向日葵花盤抑菌劑及其在抑制細胞壁降解酶的活性中的應用的製作方法
2024-03-01 06:23:15 1
本發明涉及一種新型農藥及製備方法和應用，具體涉及向日葵花盤抑菌劑及其在抑制細胞壁降解酶的活性中的應用。
背景技術：
幹腐病是馬鈴薯常見病害之一，是造成馬鈴薯塊莖採後損失的最主要病害(Antifungal Activity of the Essential Oil of Zanthoxylum bungeanum and its Major Constituent on Fusarium sulphureum and Dry Rot of Potato Tubers[J].LiXing-dong,Phytoparasitica,2014,42(4):509-517)，發病症狀主要是浸染塊莖發病初期僅局部變褐色稍凹陷，擴大後病部出現很多皺褶，呈同心輪紋狀，其上有時長出灰白色的絨狀顆粒。由馬鈴薯幹腐病引起的塊莖腐爛約佔病薯的88.5％(甘肅省定西地區馬鈴薯塊莖幹腐病病原真菌的分離鑑定[J],何蘇琴,雲南農業大學學報,2004,19(5):550-552)，嚴重影響馬鈴薯的產量和質量，給馬鈴薯種植業帶來巨大的經濟損失。
在實際生產中抗幹腐病的馬鈴薯品種較少，主要通過採後應用噻苯咪唑等真菌殺菌劑對引起馬鈴薯幹腐病主要病原菌硫色鐮刀菌(Fusarium sulphureum)進行控制。由於化學合成類農藥易對農業生態環境造成影響，並在作物中產生蓄積，進而影響人類健康，因而化學合成類農藥在防治馬鈴薯幹腐病的應用中逐漸減少使用。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種植物源抑菌劑-向日葵花盤提取物，使所述向日葵花盤提取物對引起的馬鈴薯幹腐病的硫色鐮刀菌有較好的抑制作用，從而達到對馬鈴薯幹腐病的高效防治的目的。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了向日葵花盤抑菌劑，包括為以向日葵花盤為原料，採用溶劑提取方法獲得的向日葵花盤提取物，所述的溶劑為水。
優選的，所述向日葵花盤的質量與溶劑的體積比為1kg：(5～15)L。
優選的，所述提取的方法包括以下步驟：
1)將向日葵花盤粉碎，得到的向日葵花盤粉末；
2)將所述向日葵花盤粉末與溶劑混合，浸提，得到浸提液；
3)將所述步驟2)得到的浸提液離心，得到的上清液為向日葵花盤提取物。
優選的，所述浸提的時間為3～5d。
優選的，所述步驟3)中的離心後還包括：將得到的上清液進行濃縮和乾燥。
本發明還提供了所述述的向日葵花盤抑菌劑的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟：
1)將向日葵花盤粉碎，得到的向日葵花盤粉末；
2)將所述向日葵花盤粉末與溶劑混合，浸提，得到浸提液，所述溶劑為水；
3)將所述步驟2)得到的浸提液離心，得到的上清液為向日葵花盤抑菌劑。
優選的，所述步驟2)中的向日葵花盤粉末在與溶劑混合前過60～100目篩。
優選的，所述步驟3)中離心的轉速為2000～4000r/min轉速；所述步驟3)中的離心的時間為10～20min。
本發明還提供了所述的向日葵花盤抑菌劑或所述方法製備的向日葵花盤抑菌劑在抑制馬鈴薯幹腐病菌分泌的細胞壁降解酶的活性中的應用。
優選的，所述細胞壁降解酶包括多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、纖維素酶(Cx)或β-葡萄糖苷酶。
優選的，所述向日葵花盤抑菌劑中向日葵花盤提取物的質量濃度為300～340mg/ml。
本發明提供了向日葵花盤抑菌劑，包括以向日葵花盤為原料採用溶劑提取獲得的向日葵花盤提取物，所述溶劑為水。用水作為溶劑提取向日葵花盤中的活性物質，所得向日葵花盤水提取中的活性物質具有抑菌功能。
同時，本發明提供了向日葵花盤抑菌劑，提取的原料來源廣泛，容易獲得，通過將向日葵花盤提取抑菌物質，將向日葵花盤變廢為寶，同時減少了向日葵花盤因焚燒對環境造成的汙染，也降低了向日葵花盤的處理成本。
本發明還提供一種所述的向日葵花盤抑菌劑的製備方法，將向日葵花盤粉碎後得到的粉末與溶劑混合，浸提，離心，得到的上清液為向日葵花盤抑菌劑。所述製備方法具有方法簡單，操作簡便，製備方法對操作人員的技術要求不高，重複性好的特點。
本發明還提供所述的向日葵花盤抑菌劑在抑制馬鈴薯幹腐病中的應用。所述向日葵花盤抑菌劑能夠有效抑制造成馬鈴薯幹腐病的細胞壁降解酶的活性，從而達到對馬鈴薯幹腐病的抑制效果。實施例數據表明，PG酶活性與空白對照相比抑制率為23.42％～35.19％；PMG酶活性與空白對照相比抑制率為35.20％～40.47％；Cx酶活性與空白對照相比抑制率為38.21％～52.66％；β-葡萄糖苷酶活性與空白對照相比抑制率為47.47％～56.59％。
進一步的，本發明所述的向日葵花盤抑菌劑對多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的活性具有較好的抑制活性。多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶是引起馬鈴薯幹腐病的最為嚴重的4種細胞壁降解酶，通過對上述4種酶活性的抑制從而達到對馬鈴薯幹腐病的抑制效果。所述向日葵花盤抑菌劑對
具體實施方式
本發明提供了向日葵花盤抑菌劑，包括以向日葵花盤為原料、採用溶劑提取獲得的向日葵花盤提取物，所述溶劑為水。
本發明提供了向日葵花盤抑菌劑，採用水為溶劑提取向日葵花盤中的不同種類的活性物質，提取得到的向日葵花盤水提物中的活性物質具有抑菌功能。
在本發明中，所述向日葵花盤的質量與溶劑的體積比優選為1kg：(5～15)L，更優選為1kg：10L。
在本發明中，所述提取的方法優選包括以下步驟：
1)將向日葵花盤粉碎，得到向日葵花盤粉末；
2)將所述向日葵花盤粉末與溶劑混合，浸提，得到浸提液；
3)將所述步驟2)得到的浸提液離心，得到的上清液為向日葵花盤提取物。
在本發明中，所述向日葵花盤選擇無蟲害、黴變的向日葵花盤。
在本發明中，所述向日葵花盤優選在粉碎之前進行烘乾。所述烘乾的溫度優選為35～60℃，更優選為37～50℃；烘乾的時間優選為1～5h，更優選為2～4h。
在本發明中，所述粉碎的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的粉碎方法即可。在本發明中，所述的粉碎通過研磨的方法實現。
在本發明中，所述粉碎後向日葵花盤的粒度優選為60～100目，更優選為65～80目。
得到向日葵花盤粉末後，本發明將所述向日葵花盤粉末與溶劑混合，浸提，得到浸提液。本發明對所述混合的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的混合方法即可。在本發明實施例中，所述的混合採用攪拌的方法使原料和溶劑混合均勻。
在本發明中，所述浸提的時間為3～5d。所述浸提優選在常溫條件下進行。
得到浸提液後，本發明對所述浸提液進行離心，得到上清液。在本發明中，所述離心的速度優選為2000～4000r/min，更優選為3500r/min。所述離心的時間為10～20min，更優選為15min。
得到上清液後，本發明優選將所述上清液進行濃縮和乾燥，得到向日葵花盤提取物固體粉末。
在本發明中，所述濃縮優選為旋轉蒸餾濃縮。所述的旋轉蒸餾濃縮的溫度優選為30～45℃，更優選為35～40℃。所述濃縮的時間優選為1～5h，更優選為2～4h。
在本發明中，所述的乾燥優選為真空乾燥。所述的真空乾燥的冷阱溫度優選為-25～-55℃，更優選為-30～-45℃。所述的真空乾燥的真空度優選為15～110KPa，更優選為30～100KPa。
在本發明中，向日葵花盤抑菌劑優選還包括農藥領域接受的輔料，製成農藥領域的劑型。
本發明還提供一種所述的向日葵花盤抑菌劑的製備方法，包括以下步驟：
1)將向日葵花盤粉碎，得到的向日葵花盤粉末；
2)將所述向日葵花盤粉末與溶劑混合，浸提，得到浸提液，所述溶劑為水；
3)將所述步驟2)得到的浸提液離心，得到的上清液為向日葵花盤抑菌劑。
在本發明中，所述向日葵花盤粉末在與溶劑混合前過60～100目篩，更優選為70～90目。
在本發明中，所述離心的轉速優選為2000～4000r/min，更優選為3500r/min；所述離心的時間優選為10～20min，更優選為15min。
本發明中，所述向日葵花盤抑菌劑優選還包括農藥領域接受的輔料。
在本發明中，所述農藥領域接受的輔料的種類優選為優選包括潤溼劑，分散劑，崩解劑，穩定劑，pH值調節劑，消泡劑，增效劑和填料中的一種和幾種。
在本發明中，所述向日葵花盤抑菌劑優選製成農藥領域的抑菌劑劑型。
在本發明中，所述劑型的種類優選為水分散粒劑或可溼性粉劑。
本發明還提供了所述的向日葵花盤抑菌劑在抑制馬鈴薯幹腐病菌分泌的細胞壁降解酶的活性中的應用。
在本發明中，所述細胞壁降解酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶、纖維素酶或β-葡萄糖苷酶。
在本發明中，所述的向日葵花盤抑菌劑的質量濃度優選為300～340mg/ml，更優選為320mg/mL。
在本發明中，所述的應用不受馬鈴薯品種的限制。本發明實施例中採用的馬鈴薯品種為隴薯7號馬鈴薯，隴薯10號馬鈴薯和新大坪馬鈴薯。
下面結合實施例對本發明提供的向日葵花盤抑菌劑、製備方法及其在防治馬鈴薯幹腐病菌分泌的細胞壁降解酶的活性中的應用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。
實施例1
選擇無蟲害、黴變的向日葵花盤為原料，用粉碎機製成粉狀，過60目篩，收集得到的向日葵花盤粉末。稱取粉末1kg，與10L的水混合，加入桶中浸提5天，浸提液以3000r/min轉速離心15min，收集上清液，在45℃的條件下旋蒸濃縮2h，濃縮物經真空冷凍乾燥，得提取物粉末，4℃冰箱中保藏備用。
實施例2
選擇無蟲害、黴變的向日葵花盤為原料，用粉碎機製成粉狀，過70目篩，收集得到的向日葵花盤粉末。稱取粉末1kg，與15L的水混合，加入桶中浸提3天，浸提液以3500r/min轉速離心12min，收集上清液，在35℃的條件下旋蒸濃縮3h，濃縮物經真空冷凍乾燥，得提取物粉末，4℃冰箱中保藏備用。
實施例3
選擇無蟲害、黴變的向日葵花盤為原料，用粉碎機製成粉狀，過95目篩，收集得到的向日葵花盤粉末。稱取粉末1kg，與5L的水混合，加入桶中浸提4天，浸提液以4000r/min轉速離心10min，收集上清液，在30℃的條件下旋蒸濃縮4h，濃縮物經真空冷凍乾燥，得提取物粉末，4℃冰箱中保藏備用。
實施例4～6
實施例4採用實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成300mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行；
實施例5採用實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成320mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行；
實施例6採用實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成340mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行。
將外觀整齊、無損傷的隴薯7號馬鈴薯塊莖清洗後用1％商業漂白粉浸泡20min。洗去漂白液後，製成厚1cm直徑50mm圓型切片。用無菌水清洗切片並用75％酒精消毒後，在酒精燈上灼燒除去多餘酒精，置於無菌溼濾紙上黑暗恆溫恆溼培養1h。將其中3枚切片的表面上均勻塗布0.5mL葵花盤水提物溶液，另兩枚不作處理。將4個培養1周的硫色鐮刀菌菌餅倒置接種於3枚經抑菌液處理的切片及1枚未處理切片中央，試驗組分別設置3個平行，設置1個空白對照組(CT)，另一枚不做處理的切片接入與菌餅同樣大小的無菌培養基作為正常對照組(CK)，將5枚切片置於恆溫恆溼環境中培養。
罹病組織細胞PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶的提取
所有切片組織培養二天時，分別從3枚平行試驗組和空白組切片組織上取3g感病部位組織，正常組取3g正常組織作為PG、PMG、CX和β-葡萄糖苷酶提取樣品，將每組樣品分別與6mL95％乙醇混合，冰浴研磨勻漿後低溫靜置10min。然後於4℃、10000×g離心10min。傾去上清液，向沉澱物中加入預冷3mL80％乙醇，震蕩，低溫放置10min後在同條件下離心。再傾去上清液，向沉澱物中加入5mL提取緩衝液(50mmol/L，PH5.5，含1.8mol/LNaCl的乙酸-乙酸鈉緩衝液)，於4℃下提取20min，再離心收集上清液，即為酶的提取液，4℃保存備用。
細胞壁降解酶活性測定
採用3,5-二硝基水楊酸法製作葡萄糖標準曲線，得出葡萄糖毫克數與吸光值之間的線性回歸方程，用以計算試驗中酶反應釋放的還原糖量。
PG和PMG活性測定
向試管中加入1.0mL乙酸-乙酸鈉緩衝液(50mmol/L，PH5.5)、0.5mL10g/L底物(PG為多聚半乳糖醛酸，PMG為果膠)，再加入0.5mL酶提取液。混勻後於37℃水浴保溫1h，保溫後立即加入1.5mL3,5-二硝基水楊酸(DNS)，沸水浴煮沸5min後迅速冷卻至室溫，按DNS法在540nm下測定吸光值。
根據酶反應所釋放的還原糖量計算PG、PMG活性。酶活單位以每小時每克馬鈴薯組織樣品在37℃催化底物水解生成半乳糖醛酸的質量表示(mg/h·g)，將3組試驗組的酶活平均值與空白對照組和正常組進行比較。
PG或PMG活性＝(m，·V·1.08)/(VS·t·m)；
m，—從標準曲線上查得的葡萄糖質量，mg；
V—樣品提取液總體積，mL；VS—測定時所取樣品提取液體積，mL；
t—酶促反應時間，h；m—樣品質量，g；
1.08—葡萄糖換算成半乳糖醛酸的係數(194/180)。
Cx與β-葡萄糖苷酶活性的測定
向試管中入1.5mL10g/L底物(Cx為羧甲基纖維素鈉CMC，β-葡萄糖苷酶為水楊苷)後按測定PG和PMG活性的方法處理。Cx和β-葡萄糖苷酶活性以每小時每克馬鈴薯組織樣品(鮮重)酶在37℃催化底物水解形成還原糖的質量表示，即(mg/h·g)。將3組試驗組的酶活平均值與空白對照組和正常組進行比較。
Cx與β-葡萄糖苷酶活性＝(m，·V)/(VS·t·m)；
m，—從標準曲線上查得的葡萄糖質量，mg；
V—樣品提取液總體積，mL；VS—測定時所取樣品提取液體積，mL；
t—酶促反應時間，h；m—樣品質量，g。
隴薯7號馬鈴薯細胞壁降解酶活性測定結果如表1所示。
表1硫色鐮刀菌侵染隴薯7號馬鈴薯分泌細胞壁降解酶活性
從表1中可以看出，質量濃度為300～340mg/mL的向日葵花盤提取物處理硫色鐮刀菌侵染隴薯7號馬鈴薯，測定得到的細胞壁降解酶活性均低於空白對照組細胞壁降解酶活性，其中質量濃度為320mg/mL的向日葵花盤提取物對細胞壁降解酶活性抑制性最佳。PG酶活性與空白對照相比抑制率為0.65％～9.77％；PMG酶活性與空白對照相比抑制率為17.66％～20.19％；Cx酶活性與空白對照相比抑制率為22.98％～24.64％；β-葡萄糖苷酶活性與空白對照相比抑制率為22.47％～28.64％。可以看出，質量濃度為300mg/mL的向日葵花盤提取物對四種細胞壁裂解酶的活性結果表明，向日葵花盤提取物對β-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，對PG酶活性最差，對PMG酶活性和Cx酶活性的抑制效果居中。
實施例7～9
採用隴薯10號馬鈴薯作為實驗馬鈴薯；
實施例7實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成300mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行；
實施例8實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成300mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行；
實施例9實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成300mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行。
實施例7～9採用實施例4中處理方法、酶提取方法和酶活測定方法進行實驗，隴薯10號馬鈴薯細胞壁降解酶活性測定結果如表2所示。
表2硫色鐮刀菌侵染隴薯10號馬鈴薯分泌細胞壁降解酶活性
從表2中可以看出，質量濃度為300～340mg/mL的向日葵花盤提取物處理硫色鐮刀菌侵染隴薯10號馬鈴薯，測定得到的細胞壁降解酶活性均低於空白對照組細胞壁降解酶活性，其中質量濃度為320mg/mL的向日葵花盤提取物對細胞壁降解酶活性抑制性最佳，說明向日葵花盤提取物對硫色鐮刀菌在隴薯10號馬鈴薯上分泌的4種細胞壁降解酶活性具有顯著抑制作用。PG酶活性與空白對照相比抑制率為23.42％～35.19％；PMG酶活性與空白對照相比抑制率為35.20％～40.47％；Cx酶活性與空白對照相比抑制率為38.21％～52.66％；β-葡萄糖苷酶活性與空白對照相比抑制率為47.47％～56.59％。可以看出，質量濃度為320mg/mL的向日葵花盤提取物對四種細胞壁裂解酶的活性結果比質量濃度為300mg/mL的向日葵花盤提取物對四種細胞壁裂解酶的活力的抑制效果提高顯著，向日葵花盤提取物對β-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，對PG酶活性最差，對PMG酶活性和Cx酶活性的抑制效果居中。
實施例10～12
採用新大坪馬鈴薯作為實驗馬鈴薯；
實施例10具體是實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成300mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行；
實施例11具體是實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成300mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行；
實施例12具體是實施例1～3製備得到的向日葵花盤水提物將濃度配製成300mg/ml的向日葵花盤水提取物處理馬鈴薯切片，每個處理三個平行。
實施例10～12採用實施例4中處理方法、酶提取方法和酶活測定方法進行實驗，隴薯10號馬鈴薯細胞壁降解酶活性測定結果如表3所示。
表3硫色鐮刀菌侵染新大坪馬鈴薯分泌細胞壁降解酶活性
從表3中可以看出，質量濃度為300～340mg/mL的向日葵花盤提取物處理硫色鐮刀菌侵染隴薯10號馬鈴薯，測定得到的細胞壁降解酶活性均低於空白對照組細胞壁降解酶活性，其中質量濃度為320mg/mL的向日葵花盤提取物對細胞壁降解酶活性抑制性最佳，說明向日葵花盤提取物對硫色鐮刀菌在隴薯10號馬鈴薯上分泌的4種細胞壁降解酶活性具有顯著抑制作用。PG酶活性與空白對照相比抑制率為11.22％～31.19％；PMG酶活性與空白對照相比抑制率為6.89％～21.98％；Cx酶活性與空白對照相比抑制率為24.577％～47.14％；β-葡萄糖苷酶活性與空白對照相比抑制率為13.55％～40.43％。可以看出，質量濃度為340mg/mL的向日葵花盤提取物對四種細胞壁裂解酶的活性結果比質量濃度為320mg/mL的向日葵花盤提取物對四種細胞壁裂解酶的活力的抑制效果略低，向日葵花盤提取物對β-葡萄糖苷酶活性抑制效果最好，對PG酶活性最差，對PMG酶活性和Cx酶活性的抑制效果居中。
由以上實施例可知，本發明提供的向日葵花盤抑制劑在質量濃度為300～340mg/mL的向日葵花盤提取物對硫色鐮刀菌侵染馬鈴薯分泌細胞壁降解酶活性具有抑制作用，當向日葵花盤提取物的質量濃度為320mg/mL時對硫色鐮刀菌侵染馬鈴薯分泌細胞壁降解酶活性抑制性最強，並且向日葵花盤抑制劑對不同馬鈴薯品種均具有抑制作用，並且對侵染隴薯10號馬鈴薯的病原菌的細胞壁裂解酶的活性抑制率最高。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。