一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒及其製備方法和使用方法
2024-02-29 18:32:15 3
專利名稱：一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒及其製備方法和使用方法
技術領域：
本發明涉及一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒及其製備方法和使用方法，具體涉及一種具有富集作用、可特異性、快速定量檢測導致感染性疾病的微生物的磁性螢光試劑盒組成、製備及使用方法。
背景技術：
微生物的快速檢測方法是應用微生物學中一個迅速發展的領域，無論是對感染性疾病的控制和治療，還是食品安全的監測和管理，都迫切需要快速的致病菌檢測方法。目前對致病菌決速檢測主要採用微生物學、化學、生物化學、分子生物學、免疫學的方法對致病菌進行分離、檢測、鑑定和計數。目前這些致病菌檢測方法仍存在局限性，到目前為止，還沒有一種方法能簡便地從多種生物樣本中分離富集致病菌；進而，適時的回答出以下兩個問題1、有沒有特定的致病菌，如威脅食品安全的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等，及嚴重威脅人類生命質量的結核分枝桿菌、肺炎鏈球菌(定性的檢查)；2、如果有，有多少？(定量的檢測)這對於確定致病菌及採用相應治療方法至關重要。免疫磁性分離方法，是將特異性抗體偶聯在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病微生物發生特異性結合，載有致病微生物的磁性顆粒在外加磁場的作用下，向磁極方向聚集， 並聚集在容器的內壁，稍後將標本液體移出，撒去磁場，收集磁性微球，可以將微生物從磁性微球上解離下來，這種方法可使致病微生物不但得以從多種樣品，如土壤樣品、食物樣品、臨床樣本中得到分離，而且也得到濃縮富集。免疫磁性分離技術從乳及乳製品、肉類和蔬菜中分離出沙門氏菌，其檢測限為每克IX IO2個細菌。Seo等將螢光免疫分析(FIA)與免疫磁性分離結合，測定接種於牛肉、蘋果汁和生牛奶中的低濃度大腸桿菌，每克牛肉中僅有4個大腸桿菌即可被檢出。可見將免疫磁性分離技術和其它檢驗方法，如酶聯免疫吸附分析(ELISA)，多聚酶鏈式反應(PCR)， 螢光免疫分析(FIA)，電子化學發光(ECL)相結合，可以數倍地提高分離效率和檢測極限。 而目前在微生物檢測中，所有與免疫磁性分離相結合的鑑定和檢測方法均包括後續生物化學、分子生物學、免疫學的檢查方法，操作繁瑣，設備條件要求高，應用前景不容樂觀。螢光微球是一種載有螢光分子的功能性微球，由於其在單個微球中富集了能夠發射螢光的分子，在許多領域具有廣泛的應用前景。目前結合特異性抗體的螢光微球已用於標記和識別各種抗原，包括多糖、蛋白質、細胞等。所檢測的螢光強度則與待測物濃度線性相關，從而實現待測抗原的定性及定量檢測。該方法最突出的優點是可以在同一體系中同時進行多標靶分析，特異性強，可實現快速診斷。因此利用磁性納米微球的富集作用和螢光微球的定性定量等現代納米技術，結合現代生物檢測方法尋找一種簡單有效的方法快速富集各種微生物，並特異性、快速定性、定量檢測微生物是本發明需要解決的主要內容。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒，以解決現有微生物檢測試劑盒所存在的諸多不足之處。該發明適用於醫院診斷，食品衛生部門檢驗，或者科研機構研究使用。本發明需要解決的技術問題之一是公開一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒。本發明需要解決的技術問題之二是提供該磁性螢光試劑盒的製備方法。本發明需要解決的技術問題之三是提供該磁性螢光試劑盒的使用方法。本發明的原理，參見
圖1:螢光微球由於微球的表面標有螢光物質或微球體內結構含有螢光物質的微球，受到外界能量刺激能激發出螢光。近年來，人們已經能夠製備各種各樣的粒徑從納米級到亞微米級的螢光微球。免疫螢光微球有比較穩定的形態結構及發光行為，受溶劑、熱、電、磁等外界條件的影響比純螢光化合物小很多。將螢光分子或發光材料通過高分子層或二氧化矽殼材料包裹或連接，表面再偶聯靶向生物分子，則可形成具有靶向性的螢光納米粒子；製備了螢光染料染色的納米微球，通過特定的化學修飾，形成免疫磁性微球，可以使數千個螢光納米粒子與一個微生物的表面抗原結合，這种放大效應的檢測可實現對微生物的超高靈敏檢測。免疫磁性微球在磁場中具有順磁性和高分子粒子的特性。免疫磁性微球的順磁性使固液分離更加簡便，可省去過濾等繁雜的傳統操作；而且免疫磁性微球顆粒小，比表面積大，與其它物質偶聯容量大，懸浮穩定性好，有利於抗原抗體偶聯反應順利地進行。將待測樣品和免疫磁性微球和免疫螢光微球混合時，待測樣品中微生物可同時與包被有微生物特異性抗體的免疫磁性微球和免疫螢光微球結合形成新的複合物。通過磁場時，進行磁性分選，該複合物可被滯留，與其它組分相分離，對經過富集後複合物可通過螢光檢測進行微生物形態觀測或螢光強度測定，其螢光點數量及螢光強度與樣品中微生物的數量相關。免疫磁性分離簡便易行，免疫磁珠分離技術用在微生物檢測方面能準確快速分離出出樣品中的微生物。本發明通過免疫磁性微球對樣本的富集作用，結合免疫螢光微球靈敏的定量的檢測效果，可同時高效的分離出樣品中的微生物及與微生物特異性結合的免疫螢光微球，通過檢測螢光強度，快速對微生物進行定性、定量分析。這對於食品衛生、疾病預防和治療的具有重要的意義。本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現作為本發明的第一方面，一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒，包括以下組成成分1)與待測微生物特異性結合的免疫磁性微球；2)與待測微生物特異性結合的免疫螢光微球。進一步，所述免疫磁性微球為具有磁響應性的納米微球，其粒徑為20-150nm，磁響應時間小於30min。所述免疫磁性微球的優選磁響應性時間小於lOmin。所述免疫磁性微球的優選磁響應性時間小於3min。進一步，所述免疫磁性微球為超順磁性納米微球，磁性材料為鐵、鈷、鎳及其合金納米粒子，包括 Fe3O4, Fe2O4, FexPty, CoxPty, MnFexOy，CoFexOy，NiFexOy，CuFexOy，ZnFexOy，and CdFexOy，其中 χ 和 y 為 1-6。所述免疫磁性微球具有核殼結構的磁性聚合物複合微球，聚合物材料包括聚苯乙
烯、二氧化矽等。所述免疫磁性微球優選為具有表面功能化核殼結構的磁性二氧化矽複合微球。所述免疫磁性微球優選為功能化親水性磁性微球，表面結合與微生物特異性結合的單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，所述免疫螢光微球為能發射螢光的納米微球，其粒徑為10-150nm。進一步，所述的免疫螢光微球的優選微球粒徑為5-50nm。所述免疫螢光微球包括無機螢光材料、有機螢光材料及量子點發光材料。所述螢光材料包括螢光素類、羅丹明類、鄰苯二甲醛類等化合物，如異硫氰酸螢光素(FlTC)、羅丹明等。所述免疫螢光微球採用螢光材料與納米微球共價結合。所述免疫螢光微球採用螢光材料包埋於納米微球內部。所述免疫螢光微球為含螢光物質的聚合物複合微球，聚合物材料包括聚苯乙烯、
二氧化矽。所述免疫螢光微球優選為具有表面功能化二氧化矽複合微球。作為本發明的第二方面，一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)免疫磁性微球的製備通過雙功能偶聯試劑將磁性納米微球與微生物抗原特異性抗體偶聯，磁分離，充分洗滌後，加入含保護劑及分散劑的緩衝溶液，冷凍乾燥後製得偶聯抗體的磁性納米微球；(2)免疫螢光微球的製備通過雙功能偶聯試劑將螢光納米微球與微生物抗原特異性抗體偶聯，離心或超濾透析分離未結合的抗體，加入含保護劑及分散劑的緩衝溶液，冷凍乾燥後製得偶聯抗體的螢光納米微球。作為本發明的第三方面，一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒的使用方法，該試劑盒將對微生物信號的檢測轉化為對螢光強度的檢測，其操作步驟為(1)將待測樣品、免疫磁性微球凍乾粉及免疫螢光微球加入緩衝溶液中；(2)所鑑定微生物表面具有同時與免疫磁性微球及免疫螢光微球相結合表面抗原決定簇；故微生物表面均勻分布免疫磁性微球和免疫螢光微球；(3)通過磁性分離免疫磁性微球富集與之結合的微生物；(4)通過測定與所分離、富集的微生物相結合的免疫螢光微球的螢光強度對微生物作出定性及定量的判斷。進一步，免疫磁性微球和免疫螢光微球比例為1 2 1 2。本發明的有益效果與目前常規的致病菌檢測方法相比，如細菌培養、免疫ELISA法及PCR擴增方法， 相比較，該方法具有快速富集微生物、使用方便、準確度高、敏感度高、假陽性低、設備要求低等特點，可廣泛應用於傳染病檢測、疾病預防及治療、食品安全等領域。
以下結合附圖和具體實施方式
來進一步說明本發明。圖1為本發明的原理示意圖。
具體實施例方式為了使本發明的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發明。實施例1含氨基基團的納米磁性微球的製備免疫磁性微球具有核殼結構的磁性聚合物複合微球，聚合物材料包括聚苯乙烯、 二氧化矽，優選為具有表面功能化核殼結構的磁性二氧化矽複合微球。在500ml三頸瓶中，加入5. Og經過去離子水洗滌過的四氧化三鐵粉末，加入200ml 的去離子水，在600rpm轉速下攪拌分散後，加入IOOml硝酸溶液(3. 0M)，室溫下攪拌10分鐘。然後用磁鐵分離並用去離子水洗滌3-5次。將洗滌後的四氧化三鐵泥漿攪拌分散在 400ml的檸檬酸鈉溶液中(0. 2M)，接著用磁鐵分離並用去離子水洗滌3-5次，最後所得到的四氧化三鐵分散在200ml去離子水中，製備固含量約為2. 的磁流體。在一個500ml的三頸瓶中，加入5. Og事先製備好的磁流體，並用40mL去離子水和 200ml無水乙醇稀釋，然後在高速攪拌下加入5ml的濃氨水，加入4ml的正矽酸乙酯，維持攪拌6h後，再向此體系中加入0.5ml的三乙氧基氨丙基矽烷(APS)，繼續反應12h。反應結束後離心洗滌，所製備的免疫磁性微球的粒徑為80-90nm，磁飽和強度為8. Oemu/g，免疫磁性微球的磁響應性時間小於3min。實施例2含氨基基團的納米螢光微球的製備免疫螢光微球採用螢光材料與納米微球共價結合。通常免疫螢光微球採用螢光材料包埋於納米微球內部。免疫螢光微球為含螢光材料的聚合物複合微球，聚合物材料包括聚苯乙烯、二氧化矽，優選為具有表面功能化二氧化矽複合微球。在一個25ml的單頸圓底燒瓶中，用IOml的無水乙醇溶解0. 0356g的螢光素FITC， 然後加入0. 0183g的三乙氧基氨丙基矽烷(APS)，避光攪拌反應48h，製得鍵合螢光分子 FITC的矽烷偶聯劑。在一個500ml的三頸瓶中，加入5ml去離子水和250ml無水乙醇，然後在高速攪拌下加入8. 5ml的濃氨水，加入7. 5ml的正矽酸乙酯，維持攪拌4h後，加入2ml上述製備的鍵合螢光分子異硫氰酸螢光素(FlTC)的矽烷偶聯劑，同時再向此體系中加入5ml的正矽酸乙酯，反應12h後再向此體系中加入0. 5ml的三乙氧基氨丙基矽烷(APS)，繼續攪拌反應12h。 反應結束後離心洗滌，所製備的螢光微球的粒徑為60-70nm。實施例3抗沙門氏菌表面脂多糖的免疫磁性微球的製備1、取大約25mg的上述製備的氨基磁性微球於5ml含5%戊二醛的磷酸鹽緩衝液 (ρΗ7· 4)中，混合振蕩，室溫反應3h。2、磁分離微球，用磷酸鹽緩衝液溶液充分洗滌，磁分離後，棄上清液，除去未反應的戊二醛。
3、將活化後氨基磁性微球置於4ml磷酸鹽緩衝液中，加入2ml含抗沙門氏菌表面脂多糖抗體(10mg/ml)的磷酸鹽緩衝液溶液，振蕩，37°C反應6h。4、磁分離微球，用磷酸鹽緩衝液溶液充分洗滌，磁分離後，棄上清液，除去未反應的偶聯的抗體，製得抗體偶聯的抗沙門氏菌_免疫磁性微球。實施例4抗沙門氏菌表面脂多糖免疫螢光微球的製備1、取大約25mg的上述製備的氨基螢光微球於5ml含5%戊二醛的磷酸鹽緩衝液 (ρΗ7· 4)中，混合振蕩，室溫反應3h。2、離心分離微球，用磷酸鹽緩衝液溶液充分洗滌，離心後，棄上清液。3、將活化後氨基螢光微球置於4ml磷酸鹽緩衝液中，加入2ml含抗沙門氏菌表面脂多糖抗體(10mg/ml)的磷酸鹽緩衝液溶液，振蕩，37°C反應6h。4、離心分離免疫螢光微球，用磷酸鹽緩衝液溶液充分洗滌，離心，棄上清液，製得抗體偶聯的抗沙門氏菌_免疫螢光微球。實施例5螢光顯微鏡檢測沙門氏菌1、將沙門氏菌接種於培養基中，37°C振蕩過夜，細菌計數。2、取IO3個沙門氏菌、IOmg免疫磁性微球凍乾粉及IOmg免疫螢光微球凍乾粉加入 IOml孵育緩衝液(IOmM的磷酸鹽緩衝液，pH值7. 4,0. 05%吐溫20)，室溫溫和搖蕩5min。3、磁性分離磁性微球，棄上清液。4、用5ml孵育緩衝液洗滌三次，磁分離，去除所有未結合的抗沙門氏菌_免疫螢光微球。5、撤去磁場，將所得樣品懸於少量孵育緩衝液中。6、通過螢光顯微鏡觀察沙門氏菌表面吸附的螢光微球所形成的螢光點，並進行細菌計數。實施例6螢光強度定量檢測沙門氏菌1、將沙門氏菌接種於培養基中，37°C振蕩過夜，細菌計數。2、取不同細菌數的沙門氏菌、加入IOml含抗沙門氏菌表面脂多糖的免疫磁性微球和免疫螢光微球的孵育緩衝液(IOmM的磷酸鹽緩衝液，pH值7. 4,0. 05%吐溫20)，室溫溫和搖蕩5min。3、磁性分離磁性微球，棄上清液。 4、用5ml孵育緩衝液洗滌三次，磁分離，去除所有未結合的抗沙門氏菌_免疫螢光微球。5、撤去磁場，加入Iml 8M脲溶液變性蛋白，使免疫螢光微球和免疫磁性微球分離。6、磁性分離免疫磁性微球，收集上清液。7、通過螢光計數儀測定上清液螢光強度，並繪製標準曲線。8、將待測樣品所產生的螢光強度與標準曲線比較，即得待測樣品沙門氏菌含量。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
權利要求
1.一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒，包括以下組成成分1)與待測微生物特異性結合的免疫磁性微球；2)與待測微生物特異性結合的免疫螢光微球。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫磁性微球為具有磁響應性的納米微球，其粒徑為20-150nm，磁響應時間小於30min。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫磁性微球的磁響應性時間小於 IOmin0
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫磁性微球的磁響應性時間小於 3min。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫磁性微球為超順磁性納米微球，磁性材料為鐵、鈷、鎳及其合金納米粒子，包括Fe3O4，Fe2O4，FexPty, CoxPty, MnFexOy, CoFexOy，NiFexOy，CuFexOy，ZnFexOy，and CdFexOy，其中 χ 禾口 y 為 1-6。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫磁性微球具有核殼結構的磁性聚合物複合微球，聚合物材料包括聚苯乙烯、二氧化矽。
7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫磁性微球為具有表面功能化核殼結構的磁性二氧化矽複合微球。
8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫磁性微球為功能化親水性磁性微球，表面結合與微生物特異性結合的單克隆抗體或多克隆抗體。
9.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫螢光微球為能發射螢光的納米微球，其粒徑為5-150nm。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫螢光微球粒徑為5-50nm。
11.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫螢光微球包括無機螢光材料、有機螢光材料及量子點發光材料。
12.根據權利要求11所述的試劑盒，其特徵在於，所述螢光材料包括螢光素類、羅丹明類、鄰苯二甲醛類化合物。
13.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫螢光微球採用螢光材料與納米微球共價結合。
14.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫螢光微球採用螢光材料包埋於納米微球內部。
15.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫螢光微球含螢光材料的聚合物複合微球，聚合物材料包括聚苯乙烯、二氧化矽。
16.據權利要求15所述的試劑盒，其特徵在於，所述免疫螢光微球為具有表面功能化二氧化矽複合微球。
17.—種如權利要求1所述的一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)免疫磁性微球的製備通過雙功能偶聯試劑將磁性納米微球與微生物抗原特異性抗體偶聯，磁分離，充分洗滌後，冷凍乾燥後製得偶聯抗體的磁性納米微球；(2)免疫螢光微球的製備通過雙功能偶聯試劑將螢光納米微球與微生物抗原特異性抗體偶聯，離心或超濾透析分離未結合的抗體，冷凍乾燥後製得偶聯抗體的螢光納米微球。
18.—種如權利要求1所述的一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒的使用方法，該試劑盒將對微生物信號的檢測轉化為對螢光強度的檢測，其操作步驟為(1)將待測樣品、免疫磁性微球及免疫螢光微球加入緩衝溶液中；(2)所鑑定微生物表面具有同時與免疫磁性微球及免疫螢光微球相結合表面抗原決定簇；(3)通過磁性分離免疫磁性微球富集與之結合的微生物及結合於微生物上的免疫螢光微球；(4)通過測定與所分離、富集的微生物相結合的免疫螢光微球的螢光強度對微生物作出定性及定量的判斷。
19.根據權利要求17所述的使用方法，其特徵在於，免疫磁性微球和免疫螢光微球的比例為1 2 1 2。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測微生物的磁性螢光試劑盒及其製備方法和使用方法。該試劑盒包括兩個組成成分1)與待測微生物特異性結合的免疫磁性微球；2)與待測微生物特異性結合的免疫螢光微球。製備方法包括如下步驟(1)免疫磁性微球的製備，(2)免疫螢光微球的製備。使用方法(1)將待測樣品、免疫磁性微球凍乾粉及免疫螢光微球加入緩衝溶液中；(2)所鑑定微生物表面具有同時與免疫磁性微球及免疫螢光微球相結合表面抗原決定簇；(3)通過磁性分離免疫磁性微球富集與之結合的微生物；(4)通過測定與所分離、富集的微生物相結合的免疫螢光微球的螢光強度對微生物作出定性及定量的判斷。本發明具有快速、定量、適用範圍廣的優點。
文檔編號G01N33/53GK102253193SQ20101017865
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月20日 優先權日2010年5月20日
發明者府宇雷, 府壽寬, 李莉, 楊武利 申請人:上海醫脈賽科技有限公司