一株生棘孢木黴菌株、菌劑及其在有機垃圾處理中的應用的製作方法
2024-03-01 09:23:15
一株生棘孢木黴菌株、菌劑及其在有機垃圾處理中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於微生物【技術領域】，特別涉及一株高產複合纖維素降解酶的生物防治菌株，即棘孢木黴(Trichoderma asperellum)T-1，該菌株已於2014年9月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 9722。本發明還提供了一種由棘孢木黴T-1菌株製成的垃圾堆肥菌劑及其在有機垃圾降解處理中的應用。本技術發明涉及的棘孢木黴生長快，產孢能力強，pH耐受性強，可以多種纖維素類材料為底物，是生防菌中的一員，應用於農作物種植可防病。本發明提供的棘孢木黴T-1菌劑添加到有機垃圾中可減少垃圾堆肥產生的滲透液，提高垃圾中纖維素類物質的降解效率，提高垃圾堆肥產品的質量。
CGMCC 9722
20140924
【專利說明】一株生棘孢木黴菌株、菌劑及其在有機垃圾處理中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，特別涉及一株高產複合纖維素酶的生防菌株棘孢木黴 T-1和含有該棘孢木黴的微生物菌劑，及其在有機垃圾處理處置與資源化中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著城鎮化進程的加快和人民生活水平的提高，我國的垃圾產生量在不斷增長。 但是，與此相對應的，我國的生活垃圾處理水平和汙染防治水平還相對滯後。如何實現垃圾 資源化和縮減垃圾處理量已成為一個亟待解決的問題。
[0003] 據統計，我國每年產生的有機廢棄物可達到41. 3-43. 3X 108噸，其中包括餐廚垃 圾、畜禽糞便、園林剪切物廢棄物、秸作物杆、批發市場水果蔬菜廢棄物等。目前這類有機廢 棄物大多作為垃圾處理，這種易腐性有機垃圾組分一般可佔到垃圾總量的50%以上。
[0004] 這種有機垃圾往往含水量高，易腐爛發臭，不便遠距離運輸，若得不到及時處理將 產生惡臭腐敗氣味，招惹蚊蠅，傳播疾病，影響居住環境和人類健康。此外，直接將這類有機 垃圾與不可降解垃圾一起進行處理，如衛生填埋，不僅是一種資源浪費，而且在佔用填埋土 地使用的同時，會加速垃圾填埋汙染，例如有機垃圾的高含水量會增加填埋場滲透液析出， 加速不可降解垃圾中的重金屬、多環芳烴等汙染物進入周邊土壤和地下水。
[0005] 垃圾堆肥是有機垃圾處理的一項重要手段。經過堆肥處理後的有機垃圾不僅可以 實現無害化和減量化，還可以轉變成富含有機質和氮、磷、鉀等營養元素的有機肥，實現從 農林來又回歸農林的良性循環。
[0006] 但是由於垃圾中的物質成分比較複雜，包括微生物容易利用的營養物質（如碳水 化合物、蛋白質和脂肪等）和不容易分解的物質（如纖維素和木質素等），只依靠垃圾中原 有的土著微生物往往不能達到理想的分解效果。因此，向垃圾堆肥體系中引入外源優勢微 生物，尤其是具有特殊分解功能的菌劑，將可以增強垃圾有機物的降解，提高堆肥處理的垃 圾減量化效率。此外，某些外源菌劑引入堆肥體系可以減少堆肥臭氣和滲透液的產生，改善 堆肥環境。從資源化的角度上看，合適的外源菌劑的接種還改變有機垃圾原有的生物化學 代謝過程，從而改變堆肥產物的性質，使得有機垃圾的堆肥產物更適合作為有機肥用於植 物栽培。
【發明內容】
[0007] 為了解決上述的技術問題，本發明第一目的在於提供一株可用於有機垃圾堆肥處 理的棘孢木黴菌株T-1及其微生物菌劑。
[0008] 本發明第二目的在於提供上述微生物菌劑的製備方法。
[0009] 本發明第三目的在於提供上述棘孢木黴菌株T-1及其微生物菌劑在有機垃圾堆 肥處理上的應用。
[0010] 為了實現上述的第一個目的，本發明採用了以下的技術方案：
[0011] -種棘孢木黴T-1，其分類命名為棘孢木黴菌（Trichoderma asperellum)，已保藏 於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC 9722,保藏日期 為2014年9月24日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研 究所。
[0012] 作為優選，所述棘孢木黴T-1的ITS基因序列為序列表中SEQ ID N0 :1。
[0013] 作為優選，所述的棘孢木黴菌株T-1是一株高產複合纖維素降解酶的生防菌株， 利用多種纖維素材料進行生長繁殖。
[0014] 菌株生理特徵：上述棘孢木黴T-1在PDA培養基上，在28 °C培養4天長滿整個9cm 培養皿，菌落形成同心環，在同心環上產生稠密的分生孢子，分生孢子暗綠色，無黃色色素 滲出到瓊脂培養基上。
[0015] 菌株的鑑定：通過提取上述棘孢木黴T-1菌株的基因組，並用ITS4/ITS5通用引物 對該菌株進行測定，測定的序列表如SEQ ID NO. 1所示，從ITS rDNA基因序列測定結果來 看上述菌株可以歸為棘孢木黴。
[0016] 上述棘孢木黴T-1生長快，產孢能力強，pH耐受性強，是重要的生物防治菌株，對 植物病原真菌有拮抗作用，且能高產複合纖維素降解酶，可利用多種纖維素材料進行生長 繁殖。
[0017] 為了實現上述的第二個目的，本發明採用了以下的技術方案：
[0018] -種微生物菌劑，所述微生物菌劑為固體菌劑，由棘孢木黴T-1和固體培養基組 成；其活性成分為上述的棘孢木黴T-1菌絲、孢子和其胞外酶中的一種或多種。
[0019] 作為優選，該微生物菌劑內含有的棘孢木黴T-1活菌數大於1. OX 108cfu/g。
[0020] 為了實現上述的第三個目的，本發明採用了以下的技術方案：
[0021] 上述微生物菌劑的製備方法，包括以下步驟：
[0022] 1)菌株活化培養，將權利要求1所述的棘孢木黴T-1菌株斜面保藏物接種到PDA 平板，置於25°C -30°C下培養3-5天，直至形成大量孢子；
[0023] 2)製備固體培養基，按固體量為3:1的比例，將粉碎粒度為20-40目的秸杆與麩皮 進行混合，然後按固液量為1:1的比例，在秸杆和麩皮混合物中加入Mandel培養液，121°C 高壓滅菌20min，冷卻後作為棘孢木黴T-1的固體培養基，其中Mandel培養液含有NaN0 32g， KH2P041. 5g, CaCl20. 3g, MgS04 ? 7H20 0. 3g, FeS04 ? 7H20 0. 005g, MnS04 ? H20 0. 0016g, ZnS04 ? H200. 0014g, C〇C120. 0005g,水 1000ml，pH 為 6 ;
[0024] 3)製備固體微生物菌劑，用無菌水將PDA平板上的棘孢木黴T-1的孢子及菌絲體 衝洗出來作為接種液，均勻灑到固體培養基的表面，於25_30°C培養4天後將發酵產物風乾 或冷凍乾燥，即得微生物菌劑。
[0025] 製備上述棘孢木黴T-1及其微生物菌劑所使用的PDA平板均為常規操作方法制 備。
[0026] 為了實現上述的第四個目的，本發明採用了以下的技術方案：
[0027] 上述的棘孢木黴T-1及其微生物菌劑應用於有機垃圾減量和資源化生產有機肥。
[0028] 上述的有機垃圾指的是城市、村鎮可堆腐生活垃圾，包括餐廚廢棄物、蔬菜廢棄 物、城市綠化廢棄物、農村秸作物杆等富含纖維素和蛋白質的有機廢棄物。
[0029] 本發明的優點在於：
[0030] (1)本發明提供的棘孢木黴T-1生長快，產孢能力強，pH耐受性強，在環境pH 4-10 之間均能生長且分泌纖維素酶，其可以農用廢棄秸杆為主要生長底物和載體形成微生物固 體菌劑，製備成本低，過程簡單，同時實現農業廢棄秸杆的再利用。
[0031] (2)本發明提供的棘孢木黴T-1及其微生物菌劑接種到有機垃圾堆肥體系中減少 了垃圾滲透壓的產生，提高了垃圾中有機物的降解率，降低了堆肥產物中纖維素的含量。
[0032] (3)本發明提供的棘孢木黴T-1及其微生物菌劑應用於有機垃圾堆肥體系減少了 堆肥前後總磷和總鉀的損失，堆肥產物的A/F值（放線菌數量/真菌數量）和B/F比值（細 菌數量/真菌數量）高於不接種棘孢木黴T-1及其微生物菌劑的堆肥產物，有利於減少有 機肥施用后土傳病害的發生。
[0033] (4)本發明將棘孢木黴作為直接堆肥菌劑用於有機生活垃圾的降解轉化，獲得的 有機肥由於帶有棘孢木黴將具備生物防治的功能。
[0034] 生物保藏聲明
[0035] 棘孢木黴菌（Trichoderma asperellum)，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC 9722,保藏日期為2014年9月24日，保藏地址為 北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明的方法、步驟 或條件所做的修改或替換，均屬於本發明範圍，若未特別指明，實施例中所用的技術手段為 本領域技術人員所熟悉的常規手段。
[0037] 實施例1 :棘孢木黴T-1的獲得
[0038] 本發明所涉及的棘孢木黴菌株是採用羧甲基纖維素平板和稀釋塗布法從土壤中 分離獲得，通過剛果紅染色和濾紙條分解試驗確定為高效纖維素降解菌，隨後經過生理特 徵分析和ITS rDNA鑑定確定為棘孢木黴菌，具體步驟如下：
[0039] 1、分離：稱取土樣10g，放入盛有90ml無菌水的三角瓶中，振蕩約20分鐘，即為 10-1稀釋度的土壤溶液，用移液槍從中吸取lml 土壤懸液注入盛有9ml無菌水的試管中，吹 吸三次，試充分混勻，即為10-2稀釋度的土壤溶液，然後再從此試管中吸取lml溶液注入盛 有9ml無菌水的試管中，依次類推製成10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9各種稀釋 度的土壤溶液。分別從上述試管稀釋液中吸取200 yl溶液，對號放入已寫好稀釋度的羧甲 基纖維素平板中，用無菌刮刀在培養基表面輕輕塗布均勻，倒置於恆溫培養箱培養一定時 間。用無菌的接種環從上面羧甲基纖維素平板上挑取生長快速的絲狀真菌菌落，點接種於 羧甲基纖維素雙層平板中央，隨後進行剛果紅染色，以透明圈的形成和大小大致反映該菌 的產纖維素酶能力。
[0040] 本實驗挑取了 17個真菌，在雙層平板上培養3-3. 5天，剛果紅染色，測量透明圈的 直徑，分析透明圈直徑與菌落直徑之比（HC)，挑選出HC>1的菌株，並通過濾紙條分解試驗 進一步考察菌株的纖維素分解能力。棘孢木黴T-1就是其中一株高效纖維素降解菌，其HC 值高於其它真菌。
[0041] 2、鑑定
[0042] 該菌株的生物學特徵為：菌落在PDA平板上28°C培養，3-4天擴展到9cm，初期白 色稀疏，菌絲在表面匍匐生長，後形成深綠色產孢區，反面白色；分生孢子球形，近球形，單 個近無色，聚集時呈淡黃綠色，壁光滑。形態學特徵符合棘孢木黴菌特徵。
[0043] 該菌株的分子生物學鑑定：用通用引物ITS5/ITS4(White et al.，1990)對真菌 ITS-5. 8SrDNA區域進行擴增獲得一個900bp左右的片段，然後對PCR片段進行序列測定和 NCBI資料庫Blast分析。菌株T-1測序得到的序列如SEQ ID NO. 1所示，經分析確定菌株 T-1為棘孢木黴，命名為棘孢木黴T-1。
[0044] 實施例2 :棘孢木黴T-1的平板拮抗實驗
[0045] 採用對峙培養法，製備PDA平板，用打孔器在棘孢木黴菌和待拮抗菌邊緣打取一 小塊菌餅，接種到新的PDA屏蔽相對的兩側中央，28°C培養，觀察棘孢木黴對待拮抗菌的作 用。研究結果表明棘孢木黴T-1可以抑制植物病原菌尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌的生長。
[0046] 實施例3 :棘孢木黴T-1微生物菌劑的製備
[0047] 以農作物秸杆為主要底物，採用固態發酵的方式培養棘孢木黴T-1製備微生物菌 齊U，具體製備步驟如下：
[0048] 菌株活化培養，將棘孢木黴T-1菌株斜面保藏物接種到PDA平板，置於25°C _30°C 下培養3-5天，直至形成大量孢子；
[0049] 製備固體培養基，按固體量為3:1的比例，將粉碎粒度為20-40目的秸杆與麩皮進 行混合，然後按固液量為1:1的比例，在秸杆和麩皮混合物中加入Mandel培養液，121°C高 壓滅菌20min，冷卻後作為棘孢木黴T-1的固體培養基，其中Mandel培養液含有NaN0 32g， KH2P041. 5g, CaCl20. 3g, MgS04 ? 7H20 0. 3g, FeS04 ? 7H20 0. 005g, MnS04 ? H20 0. 0016g, ZnS04 ? H200. 0014g, C〇C120. 0005g,水 1000ml，pH 為 6 ;
[0050] 製備固體微生物菌劑，用無菌水將PDA平板上的棘孢木黴T-1的孢子及菌絲體衝 洗出來作為接種液，均勻灑到固體培養基的表面，於25-30°C培養4天後將發酵產物風乾 或冷凍乾燥，即得微生物菌劑。
[0051] 實施例4 :棘孢木黴T-1微生物菌劑的木質纖維素酶活測定
[0052] 浸提液（粗酶液）：將4g棘孢木黴T-1微生物菌劑與80ml檸檬酸緩衝液 (pH4. 8, 0. 05M)混合，於37°C，180rpm振蕩提取2h，離心收集上清。
[0053] 濾紙酶酶活測定（FPAase):反應體系為檸檬酸緩衝液（0.05M，pH 4.8)650iil， Waterman No. 1濾紙0. 5mg (直徑為0. 5cm的圓紙片2個），50〇 C預熱lOmin後，加入100 y 1 粗酶液，50°C保溫50min。加入含750iU DNS液的反應管中，沸水浴5min，冰水終止反應。 測定540nm處的吸光度。酶活定義：在測定條件下，每分鐘催化底物水解生成1 y mol葡萄 糖的酶量為一個酶活力單位IU。
[0054] 羧甲基纖維素酶酶活測定（CMCase):在650 ill的2% CMC-Na溶液（CMC-Na溶於 0. 05M，pH 4. 8的檸檬酸緩衝液）中加入100 yl粗酶液，50°C保溫30min。在反應液中加入 750iil DNS，沸水浴5min，冰水冷卻。測定540nm處的吸光度。酶活定義：在測定條件下， 每分鐘催化底物水解生成1 U mol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位IU。
[0055] -葡萄糖苷酶酶活測定：在450 ill的0. 4M Na2HP04-0. 1M檸檬酸緩衝液（pH 5) 中加入5〇111粗酶液，5〇1：保溫1〇111111，再加入0.51111已在5〇1：預熱了1〇111111以上的51111對 硝基苯-0-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG)，在50°C反應10min後，加入500 ill Na2C03 (1M)終止 反應。室溫放置5min後，測定400nm處的吸光度。酶活定義：在測定條件下，每小時催化底 物水解生成1 y mol產物的酶量為一個酶活力單位IU。
[0056] 木聚糖酶酶活測定：將500 ii 1的1. 0 %燕麥木聚糖溶液（燕麥木聚糖溶於 0.05M，pH 4.8的檸檬酸緩衝液）與250iil稀釋的粗酶混合，50〇C保溫30min。加入含 750iil DNS液的反應管中，沸水浴5min，冰水終止反應。測定540nm處的吸光度。酶活定 義：在測定條件下，每分鐘催化底物水解生成1 U mol木糖的酶量為一個酶活力單位IU。
[0057] 我們將棘孢木黴T-1微生物菌劑與其他纖維素降解真菌微生物菌劑進行對比，酶 活測定結果見表1。由表1可知，棘孢木黴T-1具有高效的木質纖維素酶分泌能力。
[0058] 表1棘孢木黴T-1微生物菌劑和部分纖維素降解真菌微生物菌劑的纖維素酶測定 結果
[0059]
【權利要求】
1. 一種棘孢木黴T-1，其分類命名為棘孢木黴菌（Trichoderma asperellum)，已保藏 於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCC 9722,保藏日期 為2014年9月24日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研 究所。
2. 根據權利要求1所述的一種棘孢木黴T-1，其特徵在於：所述棘孢木黴T-1的ITS基 因序列為序列表中SEQ ID NO :1。
3. 根據權利要求1所述的一種棘孢木黴T-1，其特徵在於：所述棘孢木黴菌株T-1是一 株高產複合纖維素降解酶的生防菌株，利用多種纖維素材料進行生長繁殖。
4. 一種微生物菌劑，其特徵在於：所述微生物菌劑為固體菌劑，由棘孢木黴T-1和固體 培養基組成；其活性成分為權利要求1所述的棘孢木黴T-1菌絲、孢子和其胞外酶中的一種 或多種。
5. 根據權利要求4所述的微生物菌劑，其特徵在於：其內含有的棘孢木黴T-1活菌數 大於 1. 0X108cfu/g。
6. 根據權利要求4或5所述微生物菌劑的製備方法，其特徵在於該方法包括以下步 驟： 1) 菌株活化培養，將權利要求1所述的棘孢木黴T-1菌株斜面保藏物接種到PDA平板， 置於25°C -30°C下培養3-5天，直至形成大量孢子； 2) 製備固體培養基，按固體量為3:1的比例，將粉碎粒度為20-40目的秸杆與麩皮進 行混合，然後按固液量為1:1的比例，在秸杆和麩皮混合物中加入Mandel培養液，121°C高 壓滅菌20min，冷卻後作為棘孢木黴T-1的固體培養基，其中Mandel培養液含有NaN032g， KH2P041. 5g, CaCl20. 3g, MgS04 ? 7H20 0. 3g, FeS04 ? 7H20 0. 005g, MnS04 ? H20 0. 0016g, ZnS04 ? H200. 0014g, C〇C120. 0005g,水 1000ml，pH 為 6 ; 3) 製備固體微生物菌劑，用無菌水將PDA平板上的棘孢木黴T-1的孢子及菌絲體衝洗 出來作為接種液，均勻灑到固體培養基的表面，於25-30°C培養4天後將發酵產物風乾或冷 凍乾燥，即得微生物菌劑。
7. 權利要求1所述的棘孢木黴T-1在有機垃圾減量和資源化生產有機肥中的應用。
8. 權利要求4或5所述的微生物菌劑在有機垃圾減量和資源化處理中的應用。
9. 根據權利要求7或8所述的有機垃圾應指的是城市、村鎮可堆腐生活垃圾，包括餐 廚廢棄物、蔬菜廢棄物、城市綠化廢棄物、農村秸作物杆等富含纖維素和蛋白質的有機廢棄 物。
【文檔編號】C12R1/885GK104450530SQ201410578593
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月24日 優先權日:2014年10月24日
【發明者】林輝, 符建榮, 馬軍偉, 夏芸, 趙宇華, 姜麗娜, 葉靜, 王強, 俞巧鋼, 孫萬春, 鄒平 申請人:浙江省農業科學院