從混合物中分離感興趣的寡核苷酸的方法
2024-03-01 03:21:15 2
從混合物中分離感興趣的寡核苷酸的方法
【專利摘要】一種使用雙相性流動相/固定相液-液色譜系統從混合物中分離寡核苷酸的方法。第一流動相含有寡核苷酸且固定相含有可去除地結合目標寡核苷酸的交換劑物質。使該流動相在液-液色譜儀中與該固定相流動接觸以使該寡核苷酸在液體固定相中結合該交換劑物質。然後通過可將寡核苷酸從固定相置換入第二流動相的置換劑物質將該寡核苷酸從液體固定相置換入第二液體流動相。
【專利說明】從混合物中分離感興趣的寡核苷酸的方法
[0001]本發明涉及新方法，特別是使用無載體液-液色譜法分離寡核苷酸和化學雜質的方法。
[0002]寡核苷酸包含相對短序列的核酸聚合物，其可為DNA或RNA，典型具有50個或更少的鹼基，雖然現在可合成具有多至約200個鹼基的寡核苷酸。寡核苷酸有用於治療。被Prosensa公司以其名稱PR0051和本申請名稱GSK2402968確定的一種合成的RNA寡核苷酸具有序列5』 -uca agg aag aug gca uuu ca_3』。此寡核苷酸是一種反義寡核苷酸，即與所選序列互補的DNA或RNA單鏈。認為其誘導外顯子(exon) 51的外顯子遺漏，且在用於治療具有杜氏肌肉營養不良(DMD)的非臥床男孩的III期臨床研究中。
[0003]此類寡核苷酸的一個問題是其從雜質的純化。例如上述GSK2402968是20_mer，且在其合成中其可受到雜質汙染，包括含有更短鏈或更長鏈，例如含有17、18、19和21個鹼基的其它寡核苷酸。還可能存在其它雜質。
[0004]希望提供有效並可應用於工業生產規模的用於分離此類寡核苷酸的方法。「Therapeutic oligonucleotides:The state of the art in purification technologies，，，Sanghvi 等人，Current Opinion in Drug Discovery(2004)Vol.7N0.8 綜述了用於寡核苷酸純化的方法。該文獻公開了其它方法。已使用各種方法用於純化DNA和RNA序列。W0-A-01/55160公開了通過與汙染物形成亞胺鍵然後釆用色譜法或其它技術除去亞胺連接的雜質以純化寡核苷酸。「Size Fractionation of DNA Fragments Rangingfrom20to30000Base Pairs by Liquid/Liquid chromatography」，Muller 等人，Eur.J.BiOChem(1982) 128-238公開了使用其上已沉積了 PEG/右旋糖酐相的微晶纖維素實體柱用於分離核苷酸序列。「Separation and identification of oligonucleotides byhydrophilic interaction chromatography，，，Easter 等人，The Analyst (2010)，135 (10)公開了使用改進的HPLC利用固體二氧化娃載體相分離寡核苷酸。「Fractionationof oligonucleotides of yeast soluble ribonucleic acids by countercurrentdistribution」，Doctor 等人，Biochemistry (1965) 4 (I) 49-54 公開了使用包裝幹DEAE-纖維素的幹實體柱。「Oligonucleotide composition of a yeast lysine transferribonucleic acid」，Madison 等人，Biochemistry，1974，13 (3)公開了使用固相色譜法用於分離核苷酸序列。維基百科在以下網址公開了使用親水作用色譜，使用固體二氧化矽基質用於分離生物分子:http://en.wikipedia.0rg/wiki/Hydrophi lie—interaction—chromatography。
[0005] 液-液色譜法是已知的分離方法。液-液色譜法使用雙相性液體系統，該系統包含維持在伸長柱中的固定液相(類似於常規色譜中配置在管柱中的固相)，以及使之與固定相接觸流經該柱的流動液相。在此流動中，物質將以類似於常規固相色譜的方式在流動相和固定相之間分配。在液-液色譜技術中流動相將物質洗脫分離為類似於常規液-固相色譜的不同級分。在液-液色譜中該方法通常無載體操作，即無需固體載體基質承載該液相，其依靠旋轉柱內的離心力在該過程中維持它們的彼此接觸關係。「CountercurrentChromatography-The Support-Free Liquid Stationary Phase，，，Billardello，B.，Berthod, As Comprehensive Analytical Chemistry38, Berthod, A.，編
輯；Elsevier Science B.V.!Amsterdam(2002)pp177-200 提供了有用的液-液色譜法的一般說明。
[0006]已知各種液-液色譜技術。
[0007]一種技術是液-液逆流色譜法(在此稱作「CCC」)。在CCC儀器中通常恆定內徑的圓形例如螺旋形或螺旋管狀柱兩個都圍著其圓形中心和從其中心移位的旋轉軸旋轉，即所謂的行星自傳。此組合運動在柱中產生了振蕩離心力場，導致沿著柱的混合和反混合區域。典型的CCC儀器公開在W0-A-03/086639 (布魯奈爾大學)中。
[0008]另一已知的技術是離心分配色譜法(在此稱作「CPC」)。US-A-6，537，452和W0-A-2010/059715提出了使用CPC用於分離生物分子的可能性。「High PerformanceCentrifugal Partition Chromatography，，2005 (在線:http://web.archive, org/web/20050208201013/http://eversek0.c0.jp/p02.html)和「Applications ofLiquid-Liquid Chromatography Instrumentation for Laboratory Preparative&ProcessChemistry」,Brown 等人，Chromatography Today (Nov-Dec2009) 16-19 是關於 CPC 的一般性文章。「Anion-Exchange Displacement Centrifugal Partition Chromatography，，，Maciuk等人，Anal.Chem.(2004) 76，6179-6186公開了置換色譜法，其中羥基肉桂酸異構體分離通過在固定相中提供交換劑(或保留劑)物質以可去除地保留羥基肉桂酸在固定相上，然後使用置換劑物質將其從固定相置換。
[0009]多種CPC儀器類型是市場上可購的，例如來自Kromaton (Rousselet RobatelGroup的一部分)。典型 地，CPC儀器包含含有許多(有時多至1000)個小腔的柱，該小腔有時稱作「分配單元(partition cell) 」,其以一種或多種循環圓周排列以圍著旋轉軸旋轉，這些分配單元通過流動通道相互連接以使液體可經過它們順序流動。在一種已知排列中多個分配單元圍著一圓盤蝕刻或加工，例如自金屬例如不鏽鋼製備，以及多個圓盤沿著它們的中心旋轉軸堆放以形成可圍繞其旋轉軸旋轉的旋轉體。具有相對少堆放圓盤以及相對更大體積分配單元的一些CPC儀器形式有時稱作離心分配提取器(「CPE」)裝置。典型的CPC 儀器例如公開在 US-A-6, 537，452 (Kromaton) ,W0-A-2004/079363 (Partus)中以及其它科學或商業文獻中。
[0010]在CPC方法中液相被引入一系列分配單元和通道中，同時分配單元環圍著旋轉軸旋轉。此旋轉導致保持此相(固定相)在適當位置的離心力。然後可使第二液相(流動相)流經該分配單元，且因此可導致溶於該流動相中的物質在流動相和固定相之間分配，該方式類似於柱色譜中物質在流動洗脫液和固定固相之間分配的方式。
[0011]液-液色譜儀器可以以所謂的「下行(descending)」或「上行(ascending) 」模式運行。當柱旋轉時，若流動相和固定相具有不同的密度，通過旋轉產生的離心力導致較高密度相相比於較低密度相更為放射狀外離柱的旋轉軸。若在此儀器中流動相是較高密度的更為放射狀向外相，這稱作運行的「下行模式」。如果相反，流動相是較低密度的更為放射狀向內相，則稱作「上行模式」。
[0012]CPC已被用於分離各種類型的物質。例如分離芥子油苷(源自葡萄糖和胺基酸的有機物)描述在 Toribio A, Nuzillard J-M, Renault J-H ；Journal of ChromatographyA.1170(2007)44-51 中。例如使用 CPC 純化肽公開在 W0-A-2011/157803 中。[0013]本發明的一個目的是提供使用液-液色譜法將寡核苷酸與雜質分離的方法，其兼備分離有效以及適於以工業生產規模使用。
[0014]根據本發明，用於從目標寡核苷酸和一種或多種雜質的混合物中分離目標寡核苷酸的方法，包括:
[0015]提供包含第一液體流動相和液體固定相的雙相性流動相-固定相液-液色譜系統，所述液體固定相含有可去除地結合目標寡核苷酸的至少一種交換劑物質；
[0016]使第一液體流動相在液-液色譜儀柱中相對於並與液體固定相接觸的流動中攜帶目標寡核苷酸以使所述目標寡核苷酸在液體固定相中結合交換劑物質；
[0017]然後通過可將目標寡核苷酸從液體固定相置換入第二流動相的置換劑物質將目標寡核苷酸從液體固定相置換入第二液體流動相，所述第二液體流動相相對於並與所述固定相接觸流經所述柱。
[0018]因此所述目標寡核苷酸可從第二流動相中分離。
[0019]在此方法的一個實施方案中，使第一液體流動相在流動中攜帶目標寡核苷酸可通過提供含有目標寡核苷酸，例如含有溶解其中的目標寡核苷酸的第一液體流動相來實現。
[0020]在適於CPC的此方法一個實施方案中，該方法包括以下步驟: [0021](1)提供在溶液中含有所述目標寡核苷酸和一種或多種雜質的第一液相，以及含有可去除地結合所述目標寡核苷酸的交換劑物質的第二液相，當彼此接觸時第一液相和第二液相形成兩個不同的相；
[0022](2)將所述第二液相作為其中的固定液相引入離心分配色譜儀中；
[0023](3)將在溶液中含有所述目標寡核苷酸和一種或多種雜質的第一液相作為第一流動相引入所述離心分配色譜儀中，並使該第一液相流經所述離心分配色譜儀以與第二液體固定相接觸，使所述目標寡核苷酸在第二液體固定相中可去除地結合交換劑物質；
[0024](4)將當與第二液相接觸時形成不同相併在溶液中含有可將所述目標寡核苷酸從第二液相置換的至少一種置換劑物質的液相作為第二流動相引入離心分配色譜儀中，並使該第二流動相流經所述離心分配色譜儀以與固定液相接觸，使所述目標寡核苷酸從固定相中置換並進入第二流動相中的溶液中；
[0025](5)從第二流動相中分離所述置換的目標寡核苷酸。
[0026]寡核苷酸典型地含有50個或更少的鹼基，且如上所述可容易合成多至200個鹼基的寡核苷酸。本發明方法可認為適用於所有此類寡核苷酸，且適用於天然生成和合成寡核苷酸，例如寡核苷酸具有鹼基修飾或修飾鹼基。如本文使用的術語「寡核苷酸」包括DNA和RNA、LNA(鎖核酸,即其中採用連接2』氧和4』碳的外橋(extra bridge)修飾LNA核苷酸的核糖部分)序列、具有2』修飾的寡核苷酸、磷酸二酯和硫代磷酸，並包括受保護和未保護序列。
[0027]本發明促進了目標寡核苷酸與雜質分離，該雜質例如由寡核苷酸的合成或提取得到。分離例如可由於雜質未在固定相中結合交換劑物質，以至於雜質仍然溶於流動相中流經並離開CPC儀器。另一方面此雜質在固定相中結合交換劑物質，但結合程度不同於目標寡核苷酸，和/或可從固定相置換，但置換程度不同於感興趣的寡核苷酸，以使當第二流動相流經CPC時感興趣的寡核苷酸和雜質分離入第二流動相液流中不同的級分中，類似於常規色譜。這兩種分離過程都可能發生。[0028]本發明方法可認為適於治療中使用的典型長度的寡核苷酸，例如5-50個鹼基，例如10-30個鹼基，例如15-25個鹼基。目前可用數據表明本發明方法可應用於任何鹼基序列的寡核苷酸。所述目標寡核苷酸例如可為具有序列5』_uca agg aag aug gca uuu ca_3』的稱為GSK2402968的20鹼基RNA寡核苷酸。10鹼基DNA寡核苷酸的一個實例是5』GGC CAAACC T3』。20鹼基DNA寡核苷酸的另一實例是5』GGC CAA TCG GCT TAC CT3』。30鹼基DNA寡核苷酸的一個實例是5』 GGC CAA TCG GCT TCA CTC GGC CAA ACC3』。LNA寡核苷酸的一個實例是 5』 TTT ACG ACG ACG TTT3』。siRNA 寡核苷酸的一個實例是 5』 -gca cga uuc uca aga Ugccg-3，。
[0029]本發明方法使用的寡核苷酸還可包括肽核酸或其衍生物。
[0030]本文定義的術語「鹼基修飾」或「修飾的鹼基」是指已有鹼基(即嘧啶或嘌呤鹼基)的修飾或從頭合成鹼基。與已有鹼基相比，該從頭合成的鹼基可以看作「修飾的」。
[0031]本發明包含的寡核苷酸的其它化學性質(chemisties)和修飾如下所述。這些其它的化學性質和修飾可以與寡核苷酸已經確定的化學性質共同存在，例如存在5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2，6- 二氨基嘌呤，和包括2』-0-甲基硫代磷酸RNA的的寡核苷酸。
[0032]除了上述修飾外，本發明的方法所用的寡核苷酸可以包括其它修飾，例如如下所述的不同類型的核酸單體或核苷酸。例如，與基於RNA的寡核苷酸相比，寡核苷酸可以具有至少一個骨架，和/或糖修飾和/或至少一個鹼基修飾。
[0033]術語鹼基修飾還包括天然嘌呤和嘧啶鹼基(例如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的修飾形式，例如次黃嘌呤、乳清酸、2-胍丁胺基胞苷(agmatidine)、賴西汀、2-硫嘧啶(例如2-硫尿嘧啶 、2-硫胸腺嘧啶)、G-clamp及其衍生物、5-取代的嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-滷代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羥基甲基胞嘧啶、Super T)、2，6-二氨基嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、7-氮雜-2，6- 二氨基嘌呤、8-氮雜-7-去氮鳥嘌呤、8-氮雜-7-去氮腺嘌呤、8-氮雜-7-去氮-2，6- 二氨基嘌呤、Super G、Super A和N4-乙基胞嘧啶，或其衍生物；N2-環戊基鳥嘌呤(cPent-G)、N2-環戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)和N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pe-AP)，或其衍生物；和簡併鹼基或通用鹼基，例如2，6- 二氟甲苯，或缺失鹼基如無鹼基位點(例如1-去氧核糖、1，2- 二去氧核糖、1-去氧-2-0-甲基核糖；或其中環氧已經被氮替換的吡咯燒衍生物(氮雜核糖))。Super A>Super G和Super T的衍生物的實例可以在US-A-6，683，183中找到，將其整體引入作為參考。當將cPent_G、cPent-AP和Pr-AP摻入siRNA中時，它們顯示免疫刺激作用降低(Peacock H等人，J.Am.Chem.Soc.(2011)，133，9200)。
[0034]本發明所用的寡核苷酸可包括無鹼基位點或無鹼基單體。無鹼基位點或無鹼基單體是與包括核鹼基的相應單體相比缺乏核鹼基的單體或構件。因此無鹼基單體是寡核苷酸的構件部分但缺乏核鹼基。該無鹼基單體可以存在或連接或結合或共軛至寡核苷酸的游離末端。無鹼基單體可以為任何已知形式，並且為本領域技術人員理解，其非限制性實例描述如下:
[0035]
【權利要求】
1.用於從目標寡核苷酸和一種或多種雜質的混合物中分離目標寡核苷酸的方法，所述方法包括: 提供包含第一液體流動相和液體固定相的雙相性流動相-固定相液-液色譜系統，所述液體固定相含有可去除地結合目標寡核苷酸的至少一種交換劑物質； 使所述第一液體流動相在液-液色譜儀柱中相對於並與所述液體固定相接觸的流動中攜帶所述目標寡核苷酸以使所述目標寡核苷酸在所述液體固定相中結合所述交換劑物質； 然後通過可將所述目標寡核苷酸從所述液體固定相置換入第二流動相的置換劑物質將所述目標寡核苷酸從所述液體固定相置換入第二液體流動相，所述第二液體流動相相對於並與所述固定相接觸流經所述柱。
2.根據權利要求1的方法，包括以下步驟: (1)提供在溶液中含有所述目標寡核苷酸和一種或多種雜質的第一液相，以及含有可去除地結合所述目標寡核苷酸的交換劑物質的第二液相，當彼此接觸時所述第一液相和第二液相形成兩個不同的相； (2)將所述第二液相作為其中的固定液相引入離心分配色譜儀中； (3)將在溶液中含有所 述目標寡核苷酸和一種或多種雜質的第一液相作為第一流動相引入所述離心分配色譜儀中，並使該第一液相流經所述離心分配色譜儀以與所述第二液體固定相接觸，使所述目標寡核苷酸在所述第二液體固定相中可去除地結合所述交換劑物質； (4)將當與所述第二液相接觸時形成不同相併在溶液中含有可將所述目標寡核苷酸從所述第二液相置換的至少一種置換劑物質的第三液相作為第二流動相引入所述離心分配色譜儀中，並使該第二流動相流經所述離心分配色譜儀以與所述第二液相接觸，使所述目標寡核苷酸從所述固定相中置換並進入所述第二流動相中的溶液中； (5)從所述第二流動相中分離所述置換的目標寡核苷酸。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述目標寡核苷酸包含10-30個鹼基。
4.根據權利要求3的方法，其中所述目標寡核苷酸是具有序列5』 -UCAAGGAAGAUGGCAUUUCA-3』 的 20 個鹼基寡核苷酸。
5.根據權利要求1至4任一項的方法,其中所述目標寡核苷酸與也為寡核苷酸的一種或多種雜質分離。
6.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述固定相包含基本上不與水混溶的一種或多種有機液體以及與水混溶的一種或多種有機液體的混合物。
7.根據權利要求6的方法，其中所述第一和第二流動相包含與水混溶的一種或多種有機液體以及水的混合物。
8.根據權利要求6或7的方法，其中所述固定相和流動相包含含有Cu鏈烷酸CV6烷基酯、C1^8鏈烷醇和水的液體系統的各自兩個平衡相。
9.根據權利要求8的方法，其中所述CV6鏈烷酸Cm烷基酯是乙酸乙酯且所述CV8鏈烷醇是1-丁醇。
10.根據權利要求6或7的方法，其中所述固定相和流動相包含含有CV8鏈烷醇和水的液體系統的各自兩個平衡相。
11.根據權利要求10的方法，其中所述Ci_8鏈烷醇是1-戊醇或1-丁醇。
12.根據權利要求6或7的方法，其中所述固定相和流動相包含含有Ci_8鏈烷醇、二((V8烷基)酮和水的液體系統的各自兩個平衡相。
13.根據權利要求12的方法，其中所述CV8鏈烷醇是1-丁醇且所述二((V8烷基)酮是甲基異丁基酮。
14.根據權利要求6或7的方法，其中所述固定相和流動相包含含有二((V8烷基)酮和水的液體系統的各自兩個平衡相。
15.根據權利要求14的方法，其中所述二((V8烷基)酮是甲基異丁基酮。
16.根據權利要求6或7的方法，其中所述固定相和流動相包含含有CV6烷基Cu烷基醚或c4_1(l環醚、C1^8鏈烷醇和水的液體系統的各自兩個平衡相。
17.根據權利要求16的方法，其中所述Cu烷基Cu烷基醚和C4,環醚選自甲基-叔丁基醚和2-甲基四氫呋喃，且所述Ci_8鏈烷醇選自1-戊醇和1-丁醇。
18.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述第一流動相具有7-14的pH。
19.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述目標寡核苷酸在所述柱中的濃度是200mg-80g/Lo
20.根據前述權 利要求任一項的方法，其中所述交換劑物質是有機胺和抗衡陰離子的鹽。
21.根據權利要求20的方法，其中所述鹽是仲、叔或季銨鹽。
22.根據權利要求20或21的方法，其中所述交換劑物質選自質子化形式的三(正辛基)甲基氯化銨和三(正癸基)甲基氯化銨的混合物、十六烷基三甲基溴化銨、甲基三辛基氯化銨、苯扎氯銨(還稱作烷基二甲基苄基氯化銨和ADBAC，為各種烷基鏈長的烷基苄基二甲基氯化銨的混合物)、苄基三甲基氯化銨、四丁基氯化銨和Amberlite LA2(—種提供為游離鹼形式的液體的高分子量、油溶性仲胺)。
23.根據權利要求22的方法，其中所述交換劑物質選自:三(正辛基)甲基氯化銨和三(正癸基)甲基氯化銨的混合物以及苯扎氯銨。
24.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述交換劑物質在所述固定相中的濃度為5_500mMo
25.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述第二液體流動相具有與所述第一流動相相同的液體組成。
26.根據權利要求25的方法，其中所述固定相主要包含Ci_8鏈烷醇和CV6鏈烷酸CV6烷基酯的混合物，且所述第二流動相包含水和Cu鏈烷醇的混合物。
27.根據權利要求25的方法，其中所述固定相主要包含CV6環醚和CV8鏈烷醇的混合物，且所述第二流動相主要包含水和Cu鏈烷醇的混合物。
28.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述第二流動相的pH範圍為pH7-14。
29.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述置換劑物質包含可帶單或多電荷的陰離子部分。
30.根據權利要求29的方法，其中所述置換劑物質選自碘化鈉或碘化鉀、糖精鈉鹽、日落黃和莧菜紅。
31.根據前述權利要求任一項的方法，其中所述置換劑物質在所述第二流動相中的濃度為 5_30mM。
32.根據前述權利要求任一項的方法，其中隨後將所述目標寡核苷酸從所述第二流動相中分離。
【文檔編號】C12Q1/68GK103998623SQ201280053402
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年8月30日 優先權日:2011年9月2日
【發明者】N.多伊利特, K.弗裡拜恩, H.古茲利克, J.休伯特, J-H.雷諾爾特, C.西基特 申請人:葛蘭素集團有限公司