菸草ε-番茄紅素環化酶基因及其應用的製作方法

2024-03-01 08:36:15 4

菸草ε-番茄紅素環化酶基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種菸草ε-番茄紅素環化酶基因，其鹼基序列如SEQIDNO：1所示。本發明通過同源克隆的方式，從栽培菸草紅花大金元體內克隆獲得Ntε-LCY基因序列，並且進行了表達模式及亞細胞定位分析。利用菸草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRV）誘導基因沉默注射本氏菸草，結果表明ε-LCY的部分沉默可以提高菸葉中類胡蘿蔔素含量，並且增強煙株抵禦光抑制的能力。該研究結果能夠為利用基因工程技術培育優良品種提供理論依據和基因資源。
【專利說明】菸草ε-番茄紅素環化酶基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於植物基因工程領域，具體涉及在菸草中，一種類胡蘿蔔素合成關鍵基 因 Nt ε -LCY及其應用。

【背景技術】
[0002] 類胡蘿蔔素是自然界廣泛存在的一類重要萜類物質，一切光合組織中都能合成此 類物質。高等植物類胡蘿蔔素合成通路產生的中間物質如α-胡蘿蔔素（a-carotene)、 β -胡蘿蔔素（β-carotene)、黃體素（lutein)、新黃質（neoxanthin)、紫黃質 (violaxanthin)、玉米黃質（zeaxanthin)等參與了高等植物體內諸多重要的生理過程。類 胡蘿蔔素在光合作用中起重要作用，是光合作用中光傳導途徑和光反應中心的重要組成部 分，作為葉綠體光合天線的輔助色素，有助於葉綠體吸收光能；另一方面，類胡蘿蔔素在高 溫、強光下能通過葉黃素循環，以非光化學輻射的方式耗散光系統II (PSII)的過剩能量， 保護葉綠素免受氧化損傷的破壞。此外，類胡蘿蔔素也是合成植物激素脫落酸（ΑΒΑ)的前 體物，ΑΒΑ廣泛地參與植物生長周期發育的各個環節和抗逆過程。番茄紅素環化是該通路 的一個重要分支點，番爺紅素在番爺紅素 β-環化酶（lycopene β-cyclase, β-LCY)或者 番爺紅素 ε-環化酶（lycopenes-cyclase, ε-LCY)的作用下形成為β-胡蘿蔔素或者 胡蘿蔔素。ε-LCY和β-LCY兩個酶的活性在一定程度上決定了兩個分支產物黃體素、 胡蘿蔔素、紫黃質、玉米黃質等胡蘿蔔素類物質的比例。植物中眾多的研究實例都表明 ε -LCY是調控黃體素和β-胡蘿蔔素含量比例的關鍵酶。ε -LCY在玉米體內的自然變異 能夠解釋玉米品種間58%的黃體素和β-胡蘿蔔素含量差異。擬南芥ε-LCY的表達抑制 株系也出現了黃體素和β-胡蘿蔔素含量比例的顯著變化，土豆ε-LCY的表達抑制同樣造 成了 β_胡蘿蔔素含量的顯著上升。油菜種子中ε-LCY的表達抑制導致β-胡蘿蔔素、紫 黃質和玉米黃質等物質含量的上升，但是黃體素的含量也大幅提高，這表明不同植物體內 可能存在不同的遺傳機制或調控機制。
[0003] 類胡蘿蔔素是一類重要的香味前體物，其通過降解、轉化可形成一系列的致香物 質。菸葉中類胡蘿蔔素的含量不但決定了烤後菸葉的外觀品質，同時也能夠影響菸葉的吸 食品質，其降解產物佔菸葉總揮發性香氣成分的8%-12%。類胡蘿蔔素的降解和熱裂解產 物可生成近百種香氣化合物，如巨豆三烯酮、β_大馬酮等，這些香味物質閾值相對較低，刺 激性較小，對菸葉香氣貢獻率大，是形成烤菸細膩、高雅和清新香氣的主要成分。Weeks研究 發現，在菸葉品質提高的同時，類胡蘿蔔素降解物含量明顯增加。對β_胡蘿蔔素降解產物 進行了加香實驗，結果表明添加 β_胡蘿蔔素的降解產物能夠豐滿煙氣，增濃煙香。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的探索一種利用基因工程方法增加類胡蘿蔔素的合成效率，尤其是 β-胡蘿蔔素合成的效率。
[0005] 本發明的技術方案是：菸草ε -番茄紅素環化酶基因，其鹼基序列如SEQ ID Ν0 :1 所示。菸草ε-番茄紅素環化酶基因，其編碼序列如SEQ ID NO :2所示。
[0006] 所述的菸草ε -番茄紅素環化酶基因的應用，所述菸草番茄紅素 ε環化酶基因提 高菸草類胡蘿蔔素含量。
[0007] 一種提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，通過瞬時表達技術幹擾、沉默菸草番茄紅 素 ε環化酶基因，獲得類胡蘿蔔素含量提高的菸草轉化植株。
[0008] 所述的提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，以所述菸草番茄紅素 ε環化酶基因的 特異性核苷酸片段作為引導序列，將特異性核酸片段以正反兩個方向插入到植物表達載體 中，構建菸草番茄紅素 ε環化酶基因的病毒誘導基因沉默載體和RNAi載體。
[0009] 本發明利用一種快速、簡單、可靠的方法，病毒誘導基因沉默技術，即可下調類胡 蘿蔔素合成關鍵基因 ε -番茄紅素環化酶，從而顯著提高類胡蘿蔔素含量且增強植株抵禦 光抑制的能力。
[0010] 本發明通過同源克隆的方式，從栽培菸草紅花大金元體內克隆獲得Nt ε-LCY基 因序列，並且進行了表達模式及亞細胞定位分析。利用菸草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)誘導基因沉默注射本氏菸草，結果表明ε-LCY的部分沉默可以提高菸葉中類 胡蘿蔔素含量，並且增強煙株抵禦光抑制的能力。該研究結果能夠為利用基因工程技術培 育優良品種提供理論依據和基因資源。
[0011] 首先，從普通菸草cDNA中擴增出ε-番茄紅素環化酶基因，命名為Nt ε-LCY。並 且從基因組DNA中擴增出Nt ε -LCY的全長序列，繪製該基因結構圖；研究了 Nt ε -LCY基因 在菸草不同時期不同器官中的轉錄水平表達模式，發現該基因主要在幼葉中表達。採用激 光共聚焦發現該蛋白定位在葉綠體中；利用菸草脆裂病毒介導的病毒誘導基因沉默技術研 究了四倍體菸草類胡蘿蔔素合成通路基因表達和類胡蘿蔔素含量變化，及對葉片光合系統 ε -LCY基因部分沉默情況下發生光抑制程度的變化。
[0012] 在菸草中，探索一個類胡蘿蔔素合成關鍵基因 Nt ε -LCY，並建立起一種快速提高 類胡蘿蔔素含量，提高光抑制效應的可靠的方法。該方法無需採用費時費力的轉基因技術， 在一個月內即可達到目的。本發明揭示了菸草中ε-LCY基因在類胡蘿蔔素合成中的重要 功能，對類胡蘿蔔素組成的調控起著至關重要的作用，為植物分子改良提供了良好的理論 指導。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1 :Nt ε -LCY全長基因序列和擬南芥At ε -LCY、西紅柿S1 ε -LCY、絨毛菸草 Ntom ε -LCY和林菸草sly ε -LCY基因結構比對；
[0014] 圖2 :Nt ε -LCY-GFP融合蛋白的亞細胞定位。將融合表達載體Nt ε -LCY-GFP基因 槍法轟擊ΒΥ-2懸浮細胞進行Confocal觀察，Α是Nt ε -LCY-GFP螢光，Β是葉綠素螢光，C 是明場下細胞圖像，D是A、B、C圖像的疊加；
[0015] 圖3 :3A為四倍體栽培菸草中不同時期、（stagel-Stage4分別為還苗期、盛花期、 打頂期和成熟期）的各類器官[根-R、莖-S、葉-L (5葉位-5L，10葉位-10L，15葉位-15L)、 花-F]中Nt ε -LCY-GFP的轉錄表達模式，3B是在低溫弱光脅迫下Nt ε -LCY表達模式。用 定量PCR技術檢測；
[0016] 圖4:本氏菸草中定量PCR檢測病毒介導的ε-LCY基因沉默效果。圖中C0N代表 未接種病毒的菸草，TRV代表接種了 TRV空病毒載體的菸草，TRV- ε -LCY代表接種了帶有 ε-LCY基因片段病毒的菸草；
[0017] 圖5:本氏菸草中HPLC檢測病毒介導的ε-LCY基因沉默後菸草植株類蘿蔔素 (β_胡蘿蔔素、紫黃質、新黃質和黃體素）含量及葉綠素 Α和Β的含量。圖中C0N代表未接 種病毒的菸草，TRV代表接種了 TRV空病毒載體的菸草，TRV- ε -LCY代表接種了帶有ε -LCY 基因片段病毒的菸草；
[0018] 圖6 :本氏菸草中定量PCR檢測病毒介導的ε -LCY基因沉默後類胡蘿蔔素合成通 路基因轉錄表達圖，圖中C0N代表未接種病毒的菸草，TRV代表接種了 TRV空病毒載體的煙 草，TRV- ε -LCY代表接種了帶有ε -LCY基因片段病毒的菸草；
[0019] 圖7 :7Α為四倍體栽培菸草中病毒介導的ε -LCY基因沉默後葉片在低溫弱光脅迫 條件下Fv/Fm的變化，Fv/Fm是指植物葉片光合系統II的最大光化學效率；7Β為四倍體栽 培菸草中病毒介導的ε-LCY基因沉默後葉片在低溫弱光脅迫條件下NPQ的變化（非光化 學耗散）。【具體實施方式】
[0020] 菸草ε -番茄紅素環化酶基因，其鹼基序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0021] 菸草ε -番茄紅素環化酶基因，其編碼序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0022] 所述的菸草ε -番茄紅素環化酶基因的應用，所述菸草番茄紅素 ε環化酶基因提 高菸草類胡蘿蔔素含量。
[0023] -種提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，通過瞬時表達技術幹擾、沉默菸草番茄紅 素 ε環化酶基因，獲得類胡蘿蔔素含量提高的菸草轉化植株。
[0024] 所述的提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，以所述菸草番茄紅素 ε環化酶基因的 特異性核苷酸片段作為引導序列，將特異性核酸片段以正反兩個方向插入到植物表達載體 中，構建菸草番茄紅素 ε環化酶基因的病毒誘導基因沉默載體和RNAi載體。
[0025] l、Nt ε -LCY基因的同源克隆以及基因結構分析
[0026] 通過NCBI網站搜索到ε -LCY基因所有的EST序列，通過比對拼接，在ATG和TGA 處設計保守引物進行克隆，從栽培菸草cDNA中依次進行PCR擴增，回收目的片段，Τ-Α連 接，轉化細菌感受態細胞，37°C培養，菌落PCR鑑定得到陽性克隆，陽性質粒提取，最後進行 質粒酶切鑑定和測序，得到Nt ε -LCY編碼區（⑶S)全長序列1575bp。將此基因胺基酸序列 與西紅柿、馬鈴薯及擬南芥胺基酸序列進行比對，其相似性分別高達89 %、89 %和72 %，推 測菸草Nt ε -LCY可能與其他植物具體相似的生物學功能。利用保守引物以栽培煙DNA為 模板進行擴增，得到Nt ε -LCY基因全長序列4356bp，將栽培菸草基因結構圖與西紅柿、擬 南芥、林菸草和絨毛菸草的基因結構圖進行比對，結果如圖1所示：該基因結構在不同物種 間相當保守，包含了 11個外顯子和10個內含子。
[0027] 具體步驟如下所述：
[0028] 所用引物為 5' -ATGGATTGTATTGGAGCTCGAAAT-3' 和 5' -CTAAAATGTAAGATAAGTTC TTATCA-3'。作為模板的cDNA和DNA都來自栽培菸草紅花大金元旺長期幼葉片（RNA和DNA 提取按照QIAGEN公司RNA或DNA提取試劑盒說明書進行）。按照Reverse transcription system試劑盒說明書，以Oligo (dT) 18 (TaKaRa公司）為引物合成cDNA第一鏈。首先 以cDNA為模板PCR擴增反應體系及條件如下：反應體系為50 μ L，模板2 μ L，引物各 2. 5 μ L (10 μ moL/L)，dNTPs (10 μ moL/L) 4 μ L，buffer (10 X，Mg2+plus) 5 μ L，Taq 酶（北京全 式金生物技術有限公司）0. 5 μ L，滅菌水33. 5 μ L。其反應參數：94°C預變性3min，94°C變性 3〇8,521：退火3〇8,721：延伸9〇8,35個循環；最後721：延伸1〇1^11。？0?產物進行瓊脂糖凝 膠電泳，用凝膠提取試劑盒（Gel Extraction KIT,購自QIAGEN公司）從瓊脂糖凝膠上純化 目標ε -LCY Q)S片段（方法參照試劑盒說明書），用Eppendorf公司BioPhotometer測定 濃度後用於連接或存_20°C備用。純化的ε-LCY CDS片段與pMD19-T載體（TaKaRa公司， 氨節黴素抗性）連接（Solution I ligase，TaKaRa公司，按照試劑盒說明書操作），熱激轉 化（42°C 90s)入大腸桿菌DH5 a (TaKaRa公司）。從得到的克隆轉化子中用菌落PCR(引物 為上述擴增引物）鑑定陽性克隆，提取陽性克隆質粒Nt ε -LCY-T (小提質粒試劑盒，QIAGEN 公司，方法參照試劑盒說明書進行）。陽性質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測 序。
[0029] 菸草Nt ε -LCY基因全長擴增以栽培菸草DNA組為模板，其反應參數：94°C預變性 3min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸5min，35個循環；最後72°C延伸lOmin。反應 體系及純化、連接、轉化條件與上述條件一致。經菌落PCR驗證陽性後，提取陽性克隆質粒 送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。
[0030] 2、Nt ε -LCY的蛋白定位於葉綠體
[0031] 為了得到最確切的Nt ε -LCY蛋白亞細胞定位結果，構建Nt ε -LCY-GFP融合蛋白 載體。採用基因槍轟擊轉化菸草懸浮細胞（ΒΥ-2)，用雷射共聚焦顯微鏡觀察其定位，結果如 附圖2所示，Α為融合蛋白綠色螢光，Β為葉綠素自身的紅色螢光，C為明場下的細胞圖像，D 為三者的重疊圖像，由D圖可見，融合蛋白的綠色螢光恰與葉綠素的紅色螢光重疊在一起， 表明Nt ε -LCY蛋白定位在葉綠體中，這與其可能發揮的光合生理作用是一致的。
[0032] 具體方法如下所述：
[0033] 以 5，-ΤΑ GTCGAC ATGGATTGTATTGGAGCTCGAAAT-3，（含 Sail 酶切位點）和 5' -GCGGATCCMATGTAAGATMGTTCTTATCA-3'(含BamH I 酶切位點）為引物，以測序正確 的Nt ε -LCY-T為模板，進行擴增，產物回收純化，使用Sail和BamH I進行酶切再純化，連接 同樣由Sail和BamH I酶切之後回收純化的pJIT163-GFP載體，熱激轉化大腸桿菌DH5 α， 經菌落PCR定陽性克隆，提取質粒並測序正確後，得到pJIT163-Nt ε -LCY-GFP融合表達載 體。具體的分子克隆技術如1中所不。
[0034] 米用基因槍〇i〇-Rad FOSIOOO/He system)轟擊菸草ΒΥ2懸浮細胞系技術進行。 BY-2懸浮細胞接種在MS培養基中，26°C，130rpm震蕩培養7天。0. 5mg DNA與金粉混合， 轟擊BY2懸浮細胞系；轟擊後要26°C暗培養12小時，之後用雷射共聚焦顯微鏡觀察螢光 (BX50-FLA, Olympus) 〇
[0035] 3、Nt ε -LCY表達模式分析
[0036] 採集栽培菸草的各個時期（還苗期、盛花期、打頂期和成熟期）的各類器官[根、 莖、葉（5葉位，10葉位，15葉位）、花]樣品，並提取它們的總RNA，反轉錄成為cDNA(方法 參看1)。定量PCR ((BI0-RAD，USA))分析Nt ε -LCY時空表達模式和低溫弱光脅迫下的表達 模式。如附圖3Α中所示，Nt ε -LCY在盛花期表達量較高，且多表達在幼葉中（表達水平： 15葉位> 10葉位> 5葉位>花彡莖>根）。在低溫弱光脅迫下，Nt ε -LCY表達量呈上升 趨勢（見圖3Β)。轉錄水平表達模式的研究結果表明，該基因與植物的生理狀態密切相關， 在煙株光合生理較為強盛的幼嫩組織表達量較高，且能夠被光抑制條件誘導，參與煙株抵 御光抑制的過程，其生物學功能必然與光合生理過程存在密切的關係。
[0037] 表達模式分析所用菸草器官樣品均在雲南大田採樣，所用的引物見表1 中ε -LCY-Q-F/R，採用26s RNA作為內參。PCR擴增反應條件：95 °C預變性3min ; 95°〇208,601：208,40個循環。反應體系：1以1^。0嫩，1(^1^3￥81?6代611，上下遊引物各 1 μ L (10 μ mol/L)，補 ddH20 至 20 μ L。
[0038] 4、菸草中下調ε -LCY表達提高類胡蘿蔔素含量並增強植物抵禦光抑制能力
[0039] 為研究如何增加菸草中類胡蘿蔔素含量，採用了一種快速可靠的方法，利用菸草 脆裂病毒介導的菸草內源基因沉默，在本氏煙中下調了 ε-LCY基因的表達，在ε-LCY基因 部分沉默的情況下，菸草中類胡蘿蔔素含量發生顯著變化，同時在正常生長條件和脅迫條 件下的光合系統效率也隨之變化。
[0040] 菸草脆裂病毒載體感染能力強，病毒症狀輕，空載體侵染與對照植株生長發育無 明顯差異。TRV- ε -LCY混合陽性菌株接種本氏菸草後，煙株新葉中ε -LCY基因表達被抑 制，只有對照植株的10% (甚至更低），說明TRV-VIGS系統沉默本氏菸草的ε -LCY基因效 果是顯著的（圖4)。在ε-LCY基因表達受到抑制的植株（ε-Icy)後，β -胡蘿蔔素、紫黃 質、玉米黃質含量上升顯著，而葉黃素含量出現下降，同時葉綠素 Α和Β含量顯著上升，胡蘿 卜素的總量上升（圖5)。同時，應用定量PCR對類胡蘿蔔素合成通路上其它基因進行了轉 錄表達分析，發現除β_胡蘿蔔素羥基化酶（β-OHase)外，八氫番茄紅素合成酶（PSY)，八 氫番茄紅素脫氫酶（PDS)，ζ -胡蘿蔔素脫氫酶（ZDS)，類胡蘿蔔素異構酶（CRTIS0)，β -番 茄紅素環化酶（β -LCY)，玉米黃質環氧化酶（ΖΕ)，紫黃質去環氧化酶（VDE)，新黃素合成酶 (NXS)表達量均顯著提高（圖6)。在光抑制條件下，對照植株的PSII最大光化學效率（Fv/ Fm)是顯著下降的，而ε-Icy煙株表現出色的抵禦光抑制能力（圖6A)。而植物光合系統 生理狀態另一個重要參數非光化學耗散（NPQ)反映植株過剩光能耗散的狀態，ε-Icy煙株 NPQ在光抑制條件下顯著低於對照植株（圖6B)。上述結果表明菸草ε-LCY基因表達受到 抑制後可以增加 β_胡蘿蔔素分枝色素的含量，進而提高類胡蘿蔔素物質的總含量，也同 時提高了煙株的葉綠素 Α和Β的含量，使植物的光合能力得到提高，也增強了煙株抵禦光抑 制的能力。
[0041] 具體方法如下所述：
[0042] 構建TRV- ε -LCY載體：所用引物為5 ^ -GCGGTACC GTCCTGCTGGTCTTGCTCTTGCT-3 '(包含 ΚρηΙ 酶切位點）和 5 ' -GCCTCGAG GACTCCTGTTTTAGTCATGGGCATG-3'(包含 Xhol 酶切位點）；以 1 中測序正確的 Nt ε -LCY-T 質粒為模版擴增，回收純化PCR產物，使用ΚρηΙ和Xhol酶切PCR回收片段和TRV2病毒載 體，回收目的片段並連接，轉化細菌（DH5a，TaKaRa公司），菌落PCR鑑定陽性克隆，提取質 粒得到目的載體酶切驗證並測序。測序正確的TRV2- ε -LCY質粒轉化農桿菌，菌落PCR驗證 陽性後，注射本氏菸草。具體的分子克隆技術如1中所示。載體圖譜和病毒介導的基因沉默 (VIGS，Virus Induced Gene Silencing)操作流程詳見參考文獻[Hayward A，Padmanabhan M,Dinesh-Kumar SP,Plant Reverse Genetics:Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 678, 55-63]〇
[0043] 病毒載體接種本氏菸草葉片後30天，提取菸草同葉位葉片的RNA並反轉錄成 cDNA，實時定量PCR分析ε-LCY的沉默效果（相對於未接種的菸草對照和接種帶有空病毒 載體的菸草）。ε-LCY沉默效果檢測用引物及類胡蘿蔔素通路轉錄表達定量PCR引物見表 1〇
[0044] 表1 ε -LCY沉默效果檢測引物及類胡蘿蔔素通路轉錄表達定量PCR引物
[0045]

【權利要求】
1. 菸草ε -番茄紅素環化酶基因，其鹼基序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 菸草ε -番茄紅素環化酶基因，其編碼序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 如權利要求1所述的菸草番茄紅素環化酶基因的應用，其特徵在於：所述菸草 番茄紅素 f環化酶基因提高菸草類胡蘿蔔素含量。
4. 一種提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，其特徵在於：通過瞬時表達技術幹擾、沉默 菸草番茄紅素 f環化酶基因，獲得類胡蘿蔔素含量提高的菸草轉化植株。
5. 如權利要求4所述的提高菸草類胡蘿蔔素含量的方法，其特徵在於：以所述菸草番 茄紅素 f環化酶基因的特異性核苷酸片段作為引導序列，將特異性核酸片段以正反兩個 方向插入到植物表達載體中，構建菸草番茄紅素 ε環化酶基因的病毒誘導基因沉默載體 和RNAi載體。
【文檔編號】A01H5/00GK104152475SQ201410405714
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】王燃, 史豔梅, 羅朝鵬, 李鋒, 劉萍萍, 魏攀, 金立鋒, 魏春陽, 楊軍, 林福呈, 屈凌波, 武明珠, 陳霞, 鄭慶霞 申請人:中國菸草總公司鄭州菸草研究院