一種以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法

2024-03-01 07:44:15

專利名稱：一種以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產α -酮基丁酸的方法，具體地說，涉及利用以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸作為底物，生產α -酮基丁酸的方法。
背景技術：
α-酮基丁酸是一種重要的中間體，可應用於化學和藥物等領域。例如，α-酮基丁酸可用於生產L-異亮氨酸1、1-丙醇23、食品香料組分4以及D- α -羥基丁酸5。其中，D- α -羥基丁酸可用來製備azinothricin家族抗癌抗生素以及高聚物聚α -羥基丁酸 [Ρ(2ΗΒ)6。另外，α-酮基丁酸可轉變為L-α-氨基丁酸，而後者是合成左乙拉西坦等抗癲癇藥物的手性前體78。α -酮基丁酸的生產方法分為傳統的化學法和微生物催化法。前者指的是由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解而成0-酮基丁酸9。而文獻中報導的後者包括以下幾種以 1，2_丁二醇為起始底物，以馬紅球菌IF03730全細胞為催化劑，最終產物濃度為153. 8毫摩爾/升，摩爾轉化率為68%，生產強度為4. 8毫摩爾/升/小時1°；以巴豆酸為起始底物， 以鋨和惡臭假單胞菌全細胞為催化劑，最終產物濃度為47毫摩爾/升，生產強度為9. 4毫摩爾/升/小時9；以DL-2-羥基丁酸為底物，以施氏假單胞菌SDM為催化劑，最終產物濃度為434. 9毫摩爾/升，摩爾轉化率為91. 5%，生產強度為18. 1毫摩爾/升/小時11；以蘇氨酸為底物，粗糙脈胞菌的ilv-3突變體發酵產α -酮基丁酸78. 4毫摩爾/升，摩爾轉化率> 90%，生產強度為0. 7毫摩爾/升/小時4。1，2- 丁二醇、巴豆酸及DL-2-羥基丁酸只能通過化學法獲得，不能實現α-酮基丁酸的綠色生產。而蘇氨酸可以通過微生物發酵大規模獲得，全世界L-蘇氨酸的產量達到20，000噸12，非常適合作為α -酮基丁酸的起始底物。由L-蘇氨酸轉化生成α-酮基丁酸，經過了 L-蘇氨酸脫水酶催化的脫氨和脫水過程13。L-蘇氨酸脫水酶(L-蘇氨酸脫氨酶)分為合成型和降解型兩種。合成型L-蘇氨酸脫水酶在有氧條件下組成性表達，受到L-異亮氨酸的抑制；降解型L-蘇氨酸脫水酶厭氧條件下受L-蘇氨酸誘導表達，不受L-異亮氨酸的抑制141516。經檢索發現，利用以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸作為底物，生產 α-酮基丁酸的方法還未見報導。參考文獻1Eggeling, I. , Codes, C. , Eggeling, L. , Sahm, H. , 1987. Regulation of acetohydroxy acid synthase in Corynebacterium glutamicum during fermentation of α -ketobutyrate to L-isoleucine. App1. Microbial. Biotechnol. 25,346-351.2Atsumi, S. , Hanai, T. , Liao, J. C. , 2008. Non-fermentative pathways for synthesis of branched—chain higher alcohols as biofuels. Nature 451,86-89.3Shen, C. R. , Liao, J. C. , 2008. Metabolic engineering of Escherichiacoli for 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acid pathways. Metab. Eng. 10,312-320.4Zurbriggen， B. D. ， Rekhif， N. ， Mehlmann-De-Campos, Μ. ， Lerch, K. ,2006. Production of α -ketobutyrate. U. S. patent 7144715.5Simon，E. S.，Plante，R. ,Whitesides,G. Μ. , 1989. D-Iactate dehydrogenase. Substrate specificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids. App1. Biochem. Biotechnol. 22，169-179.6Gao， C. ， Zhang, W. ， Ma, C. ， Liu, P. ， Xu, P. ，2011. Kinetic resolution of 2-hydroxybutanoate racemic mixtures by NAD-independent L-lactate dehydrogenase. Bioresour. Technol. 102，4595-4599.7Zhang，K.，Li，H.，Cho, K. Μ.，Liao，J. C. , 2010. Expanding metabolism for total biosynthesis of the nonnatural amino acid L-homoalanine. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 107,6234-6239.8Park，E.，Kim，M.，Shin，J. S.，2010. One-pot conversion of L-threonine mto L-homoalanine :biocatalytic production of an unnatural amino acid from a natural one. Adv. Synth. Catal. 352，3391-3398.9Furuyoshi，S.，Nawa, Y.，Kawabata, N. , 1991. Microbial production of 2-oxobutyric acid from crotonic acid. Agric. Biol. Chem. 55,123-128.10Nakahara，T.，Nakajima-kambe，T.，and Sato，S. , 1994. Production of 2-ketobutyric acid from 1，2—butanediol by resting cells ofRhodococcus equi IFO 3730. Biotechnol. Lett. 16，263-268.llGao，C. ， Zhang, W. ， Lv, C. ， Li， L. ，Ma, C. ，Hu, C. ，Xu, P. ，2010. Efficient production of 2-oxobutyrate from 2-hydroxybutyrate by using whole cells of Pseudomonas stutzeri stram SDM. Appl. Envrion. Microbiol. 76,1679-1682.12Debabov，V. G. ,2003. The threonine story. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 79，113-136.13Husain，A. ， Jeelani, G. ， Sato, D. ， Ali， V. ， Nozaki, Τ. , 2010. Characterization of two isotypes of L-threonine dehydratase from Entamoeba histolytica. Mol. Biochem. Parasito 1. 170,100—104.14Lam，V.M.S.，Chan，I.P.R.，Yeung，Y.G.，1980.Roleof L-threonine deaminase and L-threonine 3一dehydrogenase in the utilization of L-threonine by Pseudomonas aeruginosa· J. Gen. Microbiol. 117，539—542.15Umbarger，H. Ε. ,1956. Evidence for a negative-feedback mechanism in the biosynthesis of isoleucine.Science 123,848.16Luginbuhl，G.H.，Hofler，J. G.，Decedue，C. J.，Burns，R. 0.， 1974. Biodegradative L-threonine deaminase of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 120，559-561.
發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸作為底物，生產α -酮基丁酸的方法。本發明所述的以L-蘇氨酸作為底物生產α-酮基丁酸的方法，步驟是(1)製備含生物催化劑的懸液選取假單胞菌屬、棒桿菌屬或芽孢桿菌屬等含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株，在 LB培養基中以常規搖瓶或者發酵罐方式有氧培養；分離並收集菌體，用PH 7. 2 7. 5磷酸鉀緩衝液洗滌菌體2 4次，分離得到的微生物完整細胞即為生物催化劑；將生物催化劑重懸於上述磷酸鉀緩衝液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達到200克溼細胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲存備用；(2)轉化將步驟(1)中製得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，並使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為10 80克/升、生物催化劑濃度為40 150克溼細胞/升；在20 65°C,pH7. 0 11. 0條件下，以50 250轉/分鐘振蕩反應1 30小時，得轉化液；(3)製取含α -酮基丁酸的溶液將步驟O)的轉化液以5，000 14，000轉/分離心5 25分鐘，或者用200 400目濾布過濾，去除步驟O)中加入的生物催化劑，所得清液即為含α-酮基丁酸的溶液；(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測將上述含α-酮基丁酸的溶液於100°C加熱10分鐘，以5，000 14，000轉/分離
心1 10分鐘，將所得清夜用4%磺基水楊酸稀釋，4°C靜置過夜，離心後所得上清即為樣
P
ΡΠ Oα -酮基丁酸含量測定採用高效液相色譜AgilentllOO系統，層析柱為Aminex ΗΡΧ-87Η(美國)，分析條件為以10毫摩爾/升硫酸為流動相，柱溫55°C，流速為0. 4毫升/ 分鐘，進樣量5微升，採用示差折光檢測器。α -酮基丁酸的鑑定採用質譜檢測。測定L-蘇氨酸濃度用胺基酸分析儀(Hitachi，L-8900，日本)。轉化率=(產生的α -酮基丁酸的物質的量濃度+原L-蘇氨酸的物質的量濃度)X 100%。上述以L-蘇氨酸為底物生產α -酮基丁酸的方法中步驟(1)所述含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株優選施氏假單胞菌(I^eudomonas stutzeri) SDM CCTCC NO :M206010、穀氨酸棒桿菌 ATCC13032 或枯孢桿菌 ATCC23857。步驟( 所述L-蘇氨酸的濃度優選20 60克/升；所述生物催化劑濃度優選 60 120克溼細胞/升；所述溫度優選30 60°C ；所述pH範圍優選8. 0 10. 0 ；所述反應時間優選為2 M小時。本發明選用含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細胞作為生物催化劑，以 L-蘇氨酸作為底物，成功實現了 α-酮基丁酸的高效生產。本發明方法具有以下特點(1)菌體培養及反應周期均較短。(2)底物L-蘇氨酸生成α-酮基丁酸的轉化率高，可達99.6%以上。(3)產物α -酮基丁酸可積累到較高濃度。(4)所用菌株不需破碎，可直接用完整細胞進行轉化，操作方便。(5)利用完整細胞催化，無需添加價格昂貴的輔因子。
5
(6)生物催化劑可以通過過濾或離心去除，並且產物成分簡單，有利於後續分離提取。


圖1 α -酮基丁酸高效液相色譜檢測結果。其中a為標準品，b為反應樣品。圖2 產生的α -酮基丁酸質譜檢測結果。圖3 胺基酸分析儀檢測氨的生成。
具體實施例方式買施例1 (1)製備含生物催化劑的懸液選取施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培養基中以常規搖瓶或者發酵罐方式有氧培養；分離並收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩衝液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸於磷酸鉀緩衝液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達到200克溼細胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲存備用；(2)轉化將步驟(1)中製得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，並使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為80克/升、生物催化劑濃度為150克溼細胞/升；在20°C，pH 11. 0條件下，以200轉/分鐘振蕩反應20小時，得轉化液；(3)製取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉化液，以12，000轉/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測將上述含α -酮基丁酸的溶液於100°C加熱10分鐘，以10，000轉/分離心10分
鍾，將所得清夜用4%磺基水楊酸稀釋，4°C靜置過夜，離心後所得上清即為樣品。α -酮基丁酸含量測定採用高效液相色譜AgilentllOO系統，層析柱為Aminex ΗΡΧ-87Η(美國)，分析條件為以10毫摩爾/升硫酸為流動相，柱溫55°C，流速為0. 4毫升/ 分鐘，進樣量5微升，採用示差折光檢測器。α -酮基丁酸的鑑定採用質譜檢測。測定L-蘇氨酸濃度用胺基酸分析儀(Hitachi，L-8900,日本)。轉化率=(產生的α -酮基丁酸的物質的量濃度+原L-蘇氨酸的物質的量濃度)X 100%。經檢測，轉化液中α-酮基丁酸的濃度為34.2克/升，轉化率為49.9%。α-酮基丁酸的高效液相色譜檢測結果如圖1所示，質譜檢測結果如圖2所示，證實產物有α-酮基丁酸的生成。胺基酸分析儀測定樣品中有氨的生成，如圖3所示。產物為α-酮基丁酸和氨，證明本發明的以L-蘇氨酸作為底物生產α-酮基丁酸的過程是由L-蘇氨酸脫水酶催化的脫水脫氨過程。另外，由於微生物細胞是在有氧條件下培養，且培養過程不需要添加誘導劑，所以催化過程涉及到的L-蘇氨酸脫水酶為合成型的。實施例2 (1)製備含生物催化劑的懸液
選取枯草芽孢桿菌ATCC23857，在LB培養基中以常規搖瓶或者發酵罐方式有氧培養；分離並收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩衝液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸於磷酸鉀緩衝液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達到 200克溼細胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲存備用；(2)轉化將步驟(1)中製得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，並使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為10克/升、生物催化劑濃度為60克溼細胞/升；在30°C, pH 8. 0條件下，以200轉/分鐘振蕩反應M小時，得轉化液；(3)製取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉化液，以12，000轉/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測經檢測，轉化液中α -酮基丁酸的濃度為0. 64克/升，轉化率為7. 5%。實施例3 (1)製備含生物催化劑的懸液選取施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培養基中以常規搖瓶或者發酵罐方式有氧培養；分離並收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩衝液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸於磷酸鉀緩衝液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達到200克溼細胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲存備用；(2)轉化將步驟(1)中製得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，並使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為60克/升、生物催化劑濃度為120克溼細胞/升；在65°C，pH 7. 0條件下，以200轉/分鐘振蕩反應M小時，得轉化液；(3)製取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉化液，以12，000轉/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測經檢測，轉化液中α-酮基丁酸的濃度為19.6克/升，轉化率為38. 1%。實施例4 (1)製備含生物催化劑的懸液選取穀氨酸棒桿菌ATCC13032，在LB培養基中以常規搖瓶或者發酵罐方式有氧培養；分離並收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩衝液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸於磷酸鉀緩衝液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達到 200克溼細胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲存備用；(2)轉化將步驟(1)中製得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，並使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為20克/升、生物催化劑濃度為40克溼細胞/升；在60°C，pH 10. 0條件下，以200轉/分鐘振蕩反應20小時，得轉化液；(3)製取含α -酮基丁酸的溶液
將上述轉化液，以12，000轉/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測經檢測，轉化液中α -酮基丁酸的濃度為12. 1克/升，轉化率為70. 6%。實施例5 (1)製備含生物催化劑的懸液選取施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培養基中以常規搖瓶或者發酵罐方式有氧培養；分離並收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩衝液洗滌菌體3次，分離得到的微生物完整細胞即為生物催化劑。生物催化劑重懸於磷酸鉀緩衝液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達到200克溼細胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲存備用；(2)轉化將步驟(1)中製得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，並使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為30克/升、生物催化劑濃度為60克溼細胞/升；在50°C, pH 8. 0條件下，以200轉/分鐘振蕩反應6小時，得轉化液；(3)製取含α -酮基丁酸的溶液將上述轉化液，以12，000轉/分離心20分鐘，去除步驟( 中加入的生物催化劑，
所得清夜即為含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-蘇氨酸檢測經檢測，轉化液中α -酮基丁酸的濃度為25. 6克/升，轉化率為99. 6%。本發明中涉及的含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株施氏假單胞菌(P. stutzeri) SDMCCTCC NO :M206010為申請人實驗室保藏菌株，該菌株先前已進行了專利保護與保藏；穀氨酸棒桿菌ATCC13032及枯草芽孢桿菌ATCC23857購自美國模式培養物集存庫 (American type culture collection)。
權利要求
1.一種以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，步驟是(1)製備含生物催化劑的懸液選取假單胞菌屬、棒桿菌屬或芽孢桿菌屬含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株，在LB培養基中以常規搖瓶或者發酵罐方式有氧培養；分離並收集菌體，用PH 7. 2 7. 5磷酸鉀緩衝液洗滌菌體2 4次，分離得到的微生物完整細胞即為生物催化劑；將生物催化劑重懸於上述磷酸鉀緩衝液或者去離子水中，使生物催化劑濃度達到200克溼細胞/升，即得到含生物催化劑的懸液，4°C儲存備用；(2)轉化將步驟(1)中製得的含生物催化劑的懸液與L-蘇氨酸水溶液混合，並使混合物中 L-蘇氨酸的濃度為10 80克/升、生物催化劑濃度為40 150克溼細胞/升；在20 65°C, pH7. 0 11. 0條件下，以50 250轉/分鐘振蕩反應1 30小時，得轉化液；(3)製取含α-酮基丁酸的溶液將步驟O)的轉化液以5，000 14，000轉/分離心5 25分鐘，或者用200 400 目濾布過濾，去除步驟O)中加入的生物催化劑，所得清液即為含α-酮基丁酸的溶液。
2.如權利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，其特徵在於，步驟(1)所述含合成型L-蘇氨酸脫水酶的菌株選施氏假單胞菌(P.stutzerDSDM CCTCC NO M206010、穀氨酸棒桿菌ATCC13032或枯草芽孢桿菌ATCC23857。
3.如權利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，其特徵在於，步驟 ⑵所述的L-蘇氨酸的濃度是20 60克/升。
4.如權利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的生物催化劑濃度是60 120克溼細胞/升。
5.如權利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，其特徵在於，步驟 ⑵所述的溫度選30 60°C。
6.如權利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，其特徵在於，步驟 ⑵所述的PH範圍是8. 0 10. 0。
7.如權利要求1所述以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，其特徵在於，步驟 (2)所述的反應時間為2 M小時。
全文摘要
本發明公開了一種以L-蘇氨酸為底物生產α-酮基丁酸的方法，其中產物α-酮基丁酸是以含合成型L-蘇氨酸脫水酶的微生物完整細胞作為生物催化劑，以L-蘇氨酸為底物，在20～65℃，pH 7.0～11.0條件下，以50～250轉/分鐘振蕩轉化後獲得。本發明的方法具有以下特點(1)採用生物催化的方法，反應體系簡單，反應條件溫和，步驟簡短，操作簡便；生物催化劑可以容易地除去，便於後續產物分離純化；(2)底物L-蘇氨酸生成α-酮基丁酸的轉化率高，可達99.6％以上，產物α-酮基丁酸可積累到較高濃度；(3)底物L-蘇氨酸價格低廉，易於獲得。本發明為實現α-酮基丁酸的高效生產奠定了基礎。
文檔編號C12R1/38GK102433360SQ20111037623
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月23日 優先權日2011年11月23日
發明者張文, 許平, 馬翠卿, 高超 申請人:山東大學