Aβ42在大腸桿菌中的高效可溶性表達及純化方法與流程

2024-04-03 03:08:05

技術領域：

本發明屬於生物技術和基因工程技術領域，特別涉及一種利用大腸桿菌表達系統高效可溶性表達製備人澱粉樣蛋白aβ42融合蛋白的方法，具體為重組大腸桿菌表達載體的構建及轉化方法、蛋白表達及純化方法。

背景技術：
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澱粉樣蛋白聚集成不溶性的澱粉纖維可導致各種神經性疾病，例如阿爾茲海默症(alzheimer’sdisease，ad)，又稱老年痴呆症，是一種神經退行性疾病。這種疾病嚴重影響著世界上數以百萬計的老年患者，從而對家庭對社會造成了極大的社會和經濟負擔。據國際阿爾茨海默病協會2016年公布的數據，2015年全球約有4680萬ad患者，且其數量以20年翻一番的速度遞增，預測2050年全球將有1.3億ad患者。由於ad病程長(約10年)且患者生活需要護理，因此醫療和護理花費驚人。2015年全球ad患者的醫療花費約為8180億美元，佔全球gdp的1.1％。作為老齡化進展最迅速的國家之一，我國的形勢更為嚴峻。2014年我國ad患者數量(約600萬)已居世界第一，同時還是全球增速最快的國家之一。例如，65歲以上的老人患病率為6.6％，遠超世界平均發病率(4.0％左右)。因此，我國已成為ad的重災區，這將給家庭和社會帶來沉重的負擔。因此該疾病的病因和尋找抗ad藥物成為世界範圍內研究人員關注的焦點。

澱粉樣蛋白斑(ad患者大腦中老年斑的主要成分)，主要是由澱粉樣β-蛋白(aβ)聚集形成的，主要含有39-43個胺基酸。aβ主要是通過一個含695-770個胺基酸組成的澱粉樣前體蛋白app通過β-和γ-分泌酶水解而成，但該前體蛋白的生物功能目前尚不清楚。據報導，aβ42是大腦中老年斑的主要成分之一。儘管目前對纖維形成過程中的聚集體的研究，已經取得了較大的進展，但很多關於這些體的大小、結構、形態以及與細胞毒性之間的關係等方面目前仍存在很多未知的問題。

目前許多基於抑制aβ42多肽聚集進行抗ad藥物的設計和篩選，為探索其聚集機制和毒理學性質，首先需要獲得高純度aβ42。該多肽分子量大小約為4.5kda，含有胞外和跨膜結構域。目前aβ多肽主要通過固相化學合成法(spps)製備，然而spps合成過程中殘留的胺基酸或多肽片段均嚴重影響了aβ的聚集和毒理特性。由於aβ42自身存在高疏水性和易於聚集的特性，很難從神經細胞組織中提取和純化，因此難以獲得大量高純度的多肽。基因工程方法具有能夠大量生產aβ的優勢，目前已有一些研究組設計出一些表達系統，並表達純化獲得重組aβ，然而由於aβ的高疏水性和聚集體具有較高的細胞毒性，利用傳統的大腸桿菌表達系統依然存在表達量低、純化步驟複雜、獲得aβ純度不高等缺點。利用可溶的蛋白質與aβ融合表達來增加其溶解性和穩定性是解決aβ上述缺點的常用方法之一。

mbp即麥芽糖結合蛋白作為常用的融合標籤，具有幫助目標蛋白高效可溶性表達的功能，因此利用該表達載體可實現疏水性蛋白和多肽的大量可溶性表達，也可用於難以化學合成的多肽或蛋白的基因重組合成。另外，mbp蛋白廣泛用做蛋白純化標籤，採用直鏈澱粉樹脂可特異性親和層析純化目標蛋白。

此外，融合標籤和目的蛋白之間一般設計蛋白酶切的酶切位點，從而可以通過蛋白酶的酶切將二者分開。常用的蛋白酶包括tev蛋白酶、凝血酶、腸激酶等，其中以tev蛋白酶最為重要。tev蛋白酶來源於菸草蝕紋病毒，其具有很強的位點特異性，能夠識別enlyfqg的七胺基酸序列，其切割位點位於第六位和第七位胺基酸之間。由於tev蛋白酶有著很好的酶切活性、胺基酸酶切位點的轉移性以及酶切條件的寬容性，因而廣泛用於融合蛋白的分離、基因組學和蛋白質組學中特定蛋白的標記和分離等研究。但是，採用tev蛋白酶切存在酶切後的目的蛋白攜帶胺基酸殘基的問題，該問題可通過對tev酶切位點進行修飾即將七胺基酸序列修飾為六胺基酸序列，使用目的蛋白的末端胺基酸替代第七位胺基酸而獲得解決，但tev酶切位點進行修飾的同時又會帶來酶切效率降低的問題，verenah.finder等在《therecombinantamyloid-βpeptideaβ1-42aggregatesfasterandismoreneurotoxicthansyntheticaβ1-42》中提到「當識別位點中第七位胺基酸-甘氨酸被天冬氨酸替代後，蛋白酶的切割效率降至90％」，天冬氨酸即為本發明中目的蛋白aβ42的末端胺基酸。

為了解決上述問題，本發明將提供一種aβ42可溶性表達和高效純化方法，以獲得高表達、高純度以及不含任何殘基的aβ42多肽的方法。

技術實現要素：
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為了實現上述目的，本發明提供一種人澱粉樣β蛋白42(aβ42)可溶性表達和高效純化方法。

本發明提供的高純度人澱粉樣蛋白aβ42多肽可溶性表達純化方法，包括重組表達載體構建、轉化與篩選、誘導表達及純化，步驟如下：

(1)將3個(nanp)多肽循環結構(以下簡稱(nanp)3)形成的可溶連接肽鏈linker及帶有改進後的tev蛋白酶切位點的aβ42融合基因核苷酸編碼序列(以下簡稱(nanp)3-tev-aβ42融合基因核苷酸編碼序列)插入到表達載體pmalc2x(載體上自帶mbp標籤)的多克隆位點，構建重組表達載體質粒；

所述改進後的tev蛋白酶切位點具體為：由enlyfqg改為enlyfq；

優選地，所述(nanp)3-tev-aβ42融合基因核苷酸編碼序列如seqidno.1所示；

(2)將(1)中構建的重組表達載體質粒轉入宿主細胞，經菌落pcr及測序鑑定得到成功導入表達載體的重組菌株；

所述的宿主細胞是大腸桿菌ecoli.bl21(de3)；

(3)誘導表達mbp-aβ42(含有融合標籤mbp的aβ42)融合蛋白，並進行蛋白純化；

所述誘導表達使用的誘導劑為異丙醇-β-硫代半乳糖苷(iptg)；

優選地，所述的蛋白純化是將細胞破碎後過直鏈澱粉樹脂，進行親和層析純化得mbp-aβ42融合蛋白；

(4)採用tev蛋白酶將(3)所得的mbp-aβ42融合蛋白中的mbp標籤切除並純化目的蛋白aβ42多肽；

優選地，所述的純化方法為分子篩凝膠過濾層析。

進一步地，本發明實現上述目的的過程具體如下：

1、可溶性表達載體及重組aβ42基因的大腸桿菌工程菌的構建

(1)根據(nanp)3-tev-aβ42胺基酸序列進行大腸桿菌表達密碼子偏好性優化，並由基因公司合成，序列如下：

gaattcaatgccaatccgaatgccaacccgaacgccaacccggaaaacctgtacttccaggatgccgagtttcgccatgatagcggctatgaggtgcaccaccagaaactggtgttctttgccgaggatgtgggcagcaacaaaggcgccattattggcctgatggtgggtggcgtggtgattgcctaaaagctt(seqidno.1)；

(2)將優化後(nanp)3-tev-aβ42融合基因核苷酸編碼序列與pmalc2x表達載體連接，挑選陽性轉化子驗證，並提取質粒pmal-aβ42備用；

優選地，操作條件如下：

(nanp)3-tev-aβ42基因片段與pmalc2x表達載體連接，16℃反應4-6h後，連接產物加入到大腸桿菌jm109感受態細胞中，冰浴30min，42℃反應1min30s，冰浴2min，加入lb液體培養基，250rpm，37℃孵育1h；

離心收集菌體，去除後重懸菌體，塗布氨苄黴素抗性的lb培養基平板，37℃培養過夜，挑取單菌落至液體培養基中，250rpm，37℃過夜培養。

菌落pcr鑑定陽性克隆後進行測序分析，提取測序正確的陽性轉化子質粒備用；

菌落pcr驗證正向引物(ecori)nanp-aβ42-f：

cggaattcaatgccaatccgaatgcca(seqidno.2)；

菌落pcr驗證反向引物(hindiii)aβ42-r：

ccaagcttttaggcaatcaccacgcc(seqidno.3)；

(3)aβ42大腸桿菌表達菌株的構建：

將測序正確的pmal-aβ42表達載體質粒轉化大腸桿菌表達宿主ecoli.bl21(de3)中，菌落pcr驗證轉化子，最終獲得重組aβ42基因的大腸桿菌工程菌bl21-mbp-aβ42。

2、mbp-aβ42融合蛋白的表達純化及蛋白酶切提純aβ42多肽

(4)mbp-aβ42融合蛋白的表達：採用iptg誘導融合蛋白表達，16℃低溫誘導16-18h，菌液離心收集菌體，獲得含有mbp-aβ42融合蛋白的大腸桿菌菌體；

(5)mbp-aβ42融合蛋白的純化：用緩衝液將上述所得菌體重懸，加入終濃度30μg/ml的溶菌酶和1％pmsf，冰浴30min後超聲破碎，12000rpm離心40min，收集上清；將上清過直鏈澱粉樹脂親和層析柱，緩衝液充分洗滌柱子後用10個柱體積的含10mm麥芽糖的緩衝液洗脫；

(6)tev蛋白酶酶切mbp-aβ42融合蛋白提純aβ42多肽：將上述mbp-aβ42融合蛋白濃縮，加入tev蛋白酶及相應buffer，23℃反應6-12h，可完全切開；

(7)分子篩凝膠過濾層析純化高純度aβ42：將上述蛋白酶切產物經superdex200分子篩凝膠柱進一步純化，最終得到不含任何殘基的高純度aβ42。

上述aβ42多肽的鑑定：

(1)電泳鑑定：mbp-aβ42融合蛋白的表達純化及tev酶切過程中每一步取樣進行sds-page電泳檢測，最終得到的aβ42多肽經tricine-sds-page電泳確定純度及分子量，結果顯示在4.5kda附近有一條明顯的條帶；

(2)質譜鑑定：將純化所得aβ42多肽進行質譜鑑定分子量，結果表明純化所得產物確為目標aβ42多肽；

(3)tht螢光染色分析聚集特性：將上述純化所得aβ42多肽進行培養，並按時間段取樣進行tht染色，通過檢測螢光值變化來分析聚集特性，證明本發明所得aβ42多肽與人澱粉樣蛋白aβ42一致。

有益效果：

1、本發明構建的aβ42表達體系提供了原核生物可溶性融合表達人澱粉樣蛋白aβ42的表達載體的構建方法，並將表達載體導入至大腸桿菌表達宿主中，經誘導表達、蛋白酶切、兩步純化及鑑定後獲得具有高純度生物活性的目標aβ42。本方法所採用的大腸表達系統及融合蛋白，具有表達效率高、表達量大、成本低、易操作等特點，所表達的aβ42多肽不含任何殘基、純度高、產率高等優點，可用於阿爾茲海默症致病機理研究和相應藥物篩選開發的研究中；同時為其他疏水性、毒性蛋白或多肽的研究提供新的思路；

2、本發明通過對菸草蝕紋病毒蛋白酶(tev)酶切位點進行修飾，從而達到aβ42多肽產物不含任何殘基的效果；

3、本發明首次使用3個(nanp)多肽循環結構形成的可溶性連接區，不僅能起到連接mbp融合標籤與目的蛋白aβ42的作用，以此構建的融合蛋白表達體系還能夠大大提高酶切效率，6h時酶切率為97.9％，12h酶切率達到99.4％，解決了tev酶切位點進行修飾後由於識別率降低導致的酶切效率降低的問題。

附圖說明：

圖1aβ42可溶性表達和純化流程圖；

圖2表達載體pmal-aβ42構建示意圖；

圖3mbp-aβ42融合蛋白純化電泳圖；

其中，m：蛋白marker；1：細胞破碎液上清；2：過樹脂後washbuffer洗脫液；3：elutionbuffer洗脫液；

圖4tev蛋白酶酶切mbp-aβ42融合蛋白電泳分析；

其中，a為不同酶切時間的蛋白電泳圖，m：蛋白marker，1：0h，2：3h，3：6h，4：12h；b為蛋白電泳圖灰度分析；

圖5tricine-sds-page電泳，分離鑑定凝膠過濾層析提純後的aβ42多肽；

其中，m：蛋白marker；1：aβ42；

圖6mass質譜檢測提純後的aβ42；

圖7tht螢光染色分析聚集特性。

具體實施方式：

本發明使用限制性內切酶購自大連寶生物工程有限公司，tev蛋白酶購自sigma，其他試劑未特別註明來源的，均購自上海生工生物工程股份有限公司。基因及引物合成來自於蘇州金唯智生物科技有限公司。實驗操作未詳述的，均根據實驗室手冊——如《分子克隆》進行操作。

aβ42可溶性表達和純化流程圖如圖1所示。

實施例1：pmal-aβ42表達載體質粒及aβ42大腸桿菌表達菌株的構建

表達載體pmal-aβ42構建示意圖如圖2所示；

(1)首先根據(nanp)3-tev-aβ42胺基酸序列進行大腸桿菌表達密碼子偏好性優化，並由基因公司合成獲得(nanp)3-tev-aβ42融合基因片段，序列如seqidno.1所示，目的片段兩端酶切位點分別為ecori和hindiii；

(2)用ecori和hindiii將(nanp)3-tev-aβ42片段從質粒上切下，經瓊脂糖凝膠電泳後，膠純化回收目標酶切產物。同樣用ecori和hindiii雙酶切pmalc2x表達載體質粒，膠回收後與上述得到的目標融合基因片段連接。16℃反應4-6h後，連接產物加入到大腸桿菌jm109感受態細胞中，冰浴30min，42℃反應1min30s，冰浴2min，加入1mllb液體培養基，250rpm，37℃孵育1h。4000rpm離心收集菌體，去除800μl上清後重懸菌體，塗布氨苄黴素抗性的lb培養基平板，37℃培養過夜。挑取單菌落至5mllb液體培養基中，250rpm，37℃過夜培養。菌落pcr鑑定陽性克隆後進行測序分析。提取測序正確的陽性轉化子質粒備用，命名為pmal-aβ42。

菌落pcr引物設計如下：

正向引物(ecori)nanp-aβ42-f：cggaattcaatgccaatccgaatgcca(seqidno.2)；

反向引物(hindiii)aβ42-r：ccaagcttttaggcaatcaccacgcc(seqidno.3)。

(3)aβ42多肽大腸桿菌表達菌株的獲得：將測序正確的pmal-aβ42表達載體質粒轉化大腸桿菌表達宿主bl21(de3)中，菌落pcr驗證轉化子，最終獲得重組aβ42基因的大腸桿菌工程菌bl21-mbp-aβ42。

實施例2：mbp-aβ42融合蛋白的表達純化及蛋白酶切提純aβ42多肽

(4)mbp-aβ42融合蛋白的表達：

挑取構建好的bl21-mbp-aβ42工程菌單菌落至5mllb培養基中過夜37℃培養，按1％接種量轉接新鮮lb培養基中，37℃培養至od600為0.6-0.8，加入終濃度0.5mmiptg誘導，誘導溫度為16℃，誘導時間16-18h。最終6000rpm離心10min收集菌體。

(5)mbp-aβ42融合蛋白的純化：

用緩衝液lysisbuffer(20mmtris-hcl，ph7.4，200mmnacl，1mmedta，1mmdtt)將上述所得菌體重懸，加入終濃度30μg/ml的溶菌酶和1％pmsf，冰浴30min後超聲破碎，12000rpm離心40min，收集上清。將上清加入到直鏈澱粉樹脂親和層析柱，再用10個柱體積的washbuffer(20mmtris-hcl，ph7.4，200mmnacl，1mmedta，1mmdtt，2mm麥芽糖)洗滌柱子，最後用10個柱體積的elutionbuffer(20mmtris-hcl，ph7.4，200mmnacl，1mmedta，1mmdtt，10mm麥芽糖)緩衝液洗脫。經bca試劑盒測定蛋白濃度，計算蛋白含量，1l菌液可得約240mgmbp-aβ42融合蛋白，mbp-aβ42融合蛋白純化電泳圖如圖3所示。

(6)tev蛋白酶酶切mbp-aβ42融合蛋白提純aβ42多肽：

將上述洗脫下的mbp-aβ42融合蛋白：tev蛋白酶＝1mg：4μl的比例加入蛋白酶和相應buffer，23℃反應6-12h，可完全切開。

tev蛋白酶酶切mbp-aβ42融合蛋白電泳圖如圖4-a所示；利用imagelab軟體對4-a蛋白電泳圖進行灰度分析，分別分析酶切3h、6h、12h後殘留mbp-aβ含量。結果如圖4-b所示，顯示酶切3h後剩餘融合蛋白含量佔酶切前含量的38.28％，6h後佔2.1％，12h後佔0.62％，表明酶切12h後mbp-aβ基本切割完全。

(7)分子篩凝膠過濾層析純化高純度aβ42：

將上述蛋白酶切產物經superdex200分子篩凝膠柱進一步純化，該步驟中所用流動相buffer為20mmph7.4tris-hcl，150mmnacl，最終得到不含任何殘基的高純度aβ42。

實施例3：aβ42多肽鑑定

(1)電泳鑑定：最終得到的aβ42多肽經tricine-sds-page電泳確定純度及分子量，如圖5所示，在4.5kda附近有一條明顯的條帶。經bca試劑盒測定蛋白濃度，最終計算1l菌液可得約20mgaβ42多肽，遠高於現有其他生物表達aβ42方法。

(2)質譜鑑定：將純化所得aβ42多肽進行質譜鑑定分子量，如圖6所示，分子量為4539.15，與人澱粉樣多肽aβ42分子量一致。

實施例4：硫黃素(tht)螢光染色分析聚集特性

(1)已知螢光化合物硫黃素(tht)具有與澱粉樣蛋白的β-sheet結構特異性結合而顯著增強螢光強度的性質。將上述純化所得aβ42脫鹽並凍幹處理後，稱取少量aβ42粉末，用20mmnaoh溶液溶解，配成275μm母液，並用ph8.0pbs緩衝液稀釋至終濃度25μm，37℃培養7天，濃度按aβ42：tht＝1:1比例混勻，在激發波長440nm，發射波長485nm條件下檢測螢光強度變化來分析聚集特性。

結果顯示：純化所得aβ42在37℃培養時生長曲線與化學合成的aβ42具有相同的聚集特性，如圖7所示，因此證明本發明所得aβ42多肽與人澱粉樣蛋白aβ42一致。

sequencelisting

天津科技大學

aβ42在大腸桿菌中的高效可溶性表達及純化方法

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gccgaggatgtgggcagcaacaaaggcgccattattggcctgatggtgggtggcgtggtg180

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