水稻普通核不育系的創製方法和應用與流程

2024-04-03 02:58:05

本發明屬於水稻育種技術領域，具體涉及一種水稻普通核不育系的創製方法和應用。

背景技術：

水稻是全世界重要的糧食作物，世界上約有50％的人口以水稻為主食，大米也是加工許多食品的原材料。「三系法」和「兩系法」是當前水稻雜交優勢利用的主要途徑，但是「三系法」的問題在於受嚴格的恢保關係制約，可以利用的親本資源有限；「兩系法」在制種安全性問題上存在較大的風險，限制了這兩種途徑全面開發水稻雜種優勢的潛力。

普通核不育具有來源廣泛、無恢保關係限制、敗育徹底且育性不受環境影響、單隱性基因控制易於轉育等特點，是理想的雜種優勢利用資源，但普通核不育的繁殖問題是制約普通核不育發展的重要問題。水稻工程核不育體系的創製研究，建設「第三代雜交水稻」應用體系。「第三代雜交水稻」技術就是擬通過基因工程手段解決普通核不育的繁殖問題的技術方法。主要的技術方法有spt技術、工程核不育技術。「第三代雜交水稻」是基於普通核不育資源的一種雜種優勢利用方式。雜種優勢利用水平的提高，可以有更多的水稻資源被用於作為雜交稻的父母本，為選育高產、優質、高抗等綜合性狀優良的品種提供了更好的平臺。

普通核不育資源主要來源於人工誘變和自然突變，屬於非定向突變，然後從不定向的突變中，經過大量的篩選，獲得具有感興趣目的性狀的材料。應用中遇到的問題是：構建「第三代雜交水稻」體系所需要的普通核不育資源，需要已經被基因克隆的普通核不育基因(即基礎研究比較透徹的基因)在基因組層面上定點改變基因的表達，從而改變目的性狀，這些突變體來源的材料通常不是育種家當前最期待直接利用的材料(基礎研究的材料在生產中已經不是最好最新的材料)，所以要將這些材料用於生產中，還必須通過回交轉育等方式，是一個耗時較長、工作量較大的一項工作。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法和應用，採用基因編輯的技術，讓普通的可育材料，變成普通核不育系，再由普通核不育系通過雜交產生可持續恢復育性的方法，極大程度上拓寬了「第三代雜交水稻」不育系資源的來源。

為解決上述問題，一方面，本發明在於提供一種水稻普通核不育系的創製方法，其具體步驟如下：

1)通過基因編輯技術使水稻普通可育株系msms的育性基因表達水平降低或消失，獲得水稻普通核不育材料，自交後獲得含有不育性狀且不含基因編輯載體的新的水稻普通核不育系msms；

2)構建工程核不育中間父本載體，將該載體導入水稻普通核不育系msms，獲得轉基因苗；種植轉基因苗，收穫t0代種子，種植t0代種子，獲得t1代植株，pcr檢測，以獲得含有目的基因的擬可育中間父本材料，收穫t1代種子；

3)種植t1代種子，pcr檢測，獲得不含篩選標記基因的可育中間父本材料msmsms-l；

4)以水稻普通核不育系msms為母本，以可育中間父本材料msmsms-l為父本，雜交，產生混合種子；

5)對混合種子進行螢光分選，分選出不含螢光的種子msms，實現水稻普通核不育系的繁殖，用於與可育恢復系水稻msms進行雜交制種，產生的f1代雜交種子msms，用於大田生產；分選出含螢光的種子msmsms-l繼續用於繁殖不含螢光的種子msms。

進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，所述步驟1)中，選擇普通可育株系msms作為受體，利用基因編輯crispr-cas9的方法，定點突變普通可育株系msms的雄性不育基因的靶標序列，培育、測序、篩選，得到普通核不育株系msms。

更進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，步驟1)中所述靶標序列如seqidno.2所示。

進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，步驟2)所述的中間父本載體為包含可育基因和分選基因的水稻雙元表達載體。

更進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，步驟2)所述的中間父本載體中包含的分選基因為紅色螢光蛋白dsred。

進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，所述步驟1)中的育性基因為cyp703a3。

進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，所述步驟2)中構建工程核不育中間父本載體的過程如下：

以普通可育株系msms提取的基因組dna作為模板，設計併合成特異性引物：

9311gdnaf(其序列如seqidno.7所示)：gggatgggtgtttgactctg；

9311gdnar(其序列如seqidno.8所示)：cctgtgctcactcggaag；

擴增出如seqidno.9所示的大小為4429bp的基因組序列片段後，以該基因組序列片段構建「育性恢復基因-分選基因」的工程核不育中間父本載體。

進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，所述工程核不育中間父本載體構建過程為：通過in-fusion轉化體系將擴增調控後如seqidno.9所示的dna片段插入到含有分選基因紅色螢光蛋白dsred的載體中；獲得水稻雙元表達載體pcambia1300-dsred-cyp703a3，其基因序列如seqidno.10所示。

進一步地，本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法，所述擬可育中間父本材料創製過程如下：將水稻雙元表達載體pcambia1300-dsred-cyp703a3導入根癌農桿菌中得到互補根癌農桿菌eha105轉化體，通過與水稻普通核不育系msms的細胞或組織接觸，從而使編碼不育基因的核苷酸轉入水稻細胞，並且整合到水稻細胞的染色體上，獲得轉基因苗；種植轉基因苗，收穫t0代種子，種植t0代種子，獲得t1代植株，pcr檢測，獲得擬可育中間父本材料。

另一方面，本發明提供一種水稻普通核不育系的水稻雙元表達載體，其核苷酸序列如seqidno.10所示。

另一方面，本發明提供一種本發明所述的水稻普通核不育系的創製方法用於水稻普通核不育系的育性恢復的應用。

本發明列舉的雄性可育基因為cyp703a3基因，其鹼基序列如seqidno.1所示。

cyp703a3的靶基因序列如seqidno.2所示，進行突變後得到如seqidno.3所示或如seqidno.4所示的突變序列基因cyp703a3-a。

進一步地，本發明列舉的水稻品種為秈稻品種9311。

cyp703a3基因屬於cytochromep450家族，基因功能非常保守，在所有水稻品種中都有這個基因，因此本發明所適用的範圍為所有水稻品種。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明提供一種水稻普通核不育系的創製方法和應用，通過應用普通可育的育種材料創製為不育系，再由不育系與中間父本材料雜交，將混合種子通過分選基因表達性狀分選後，得到大量不含轉基因成分的不育系種子，實現了普通核不育系的繁殖。利用普通核不育系與恢復系制種，得到雜交種子，該育種程序簡單，將生產中綜合農藝性狀優良的育種材料或品系直接創製為不育系，可以節省大量回交轉育的時間(具體表現為將回交選育不育系的時間由3～5年縮短為6個月內)，且不改變受體材料其它背景基因，將普通核不育的不育性狀快速導入可育材料中，大幅度的縮短育種周期。

本發明著眼點是在雜種優勢的利用，利用雄性育性基因及其蛋白參與調控水稻雄性育性的特點，及利用轉基因技術控制水稻雄性生殖發育，通過突變該蛋白序列或抑制該蛋白的表達產生新的水稻雄性不育株系，全面拓展不育系的材料範圍，提升雜種優勢的利用水平，為選育高產、優質、高抗等綜合性狀優良的品種提供了更好的技術方法，在農業生產上具有十分重要的應用。

本發明所獲得的水稻突變體在營養期與來源親本無明顯差異，進入生殖生長階段後雄性生殖發育異常，花粉敗育，得到完全不育的植株，在雜交水稻構建和農業生產上具有十分重要的應用。

附圖說明

圖1為水稻普通核不育系在水稻制種中的應用的雜交流程圖；

圖2為基因突變位點的圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。

下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等分子克隆：實驗室手冊(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。

所述cyp703a3基因的核苷酸如seqidno.1所示序列，其編碼的胺基酸如seqidno.11所示序列，其cds區如seqidno.12所示序列。

實施例1創製水稻普通核不育系cyp703a3-a

1.從已克隆的基因資源中，獲得雄性不育基因序列

genebank上獲得目的水稻雄性不育基因cyp703a3，其基因序列如seqidno.1所示；選取的靶序列如seqidno.2所示。

2.通過crispr-cas9的手段降低水稻品種中cyp703a3蛋白的表達水平

以普通可育材料(基因型為msms)秈稻9311作為受體，通過農桿菌eha105-bgko5的介導，利用常規的水稻轉基因操作方法，在轉基因群體中，選擇表型為不育的單株，對靶標序列進行一代測序，得到不育單株cyp703a3-a(基因型為msms)。

為了對cyp703a3蛋白進行應用，構建了cyp703a3基因crispr-cas9的載體cyp703a3-bgko5(載體來自百格公司，貨號bgko5)，並轉化野生型9311植株，以降低cyp703a3蛋白的表達，從而達到將野生型水稻9311變成不育系的目的。

設計併合成cyp703a3突變位點檢測引物：

cyp703a3crisprup(seqidno.5)：tgtgtggcggcgccggcgacgcactg

cyp703a3crisprdown(seqidno.6)：aaaccagtgcgtcgccggcgccgcca

對構建含有水稻cyp703a3基因靶序列的cyp703a3-bgko5質粒進行測序，測序正確確定構建成功。

將含有cyp703a3-bgko5質粒，轉化成含cyp703a3-bgko5的根癌農桿菌在含有kan(50μg/μl)的yeb平板上劃線，獲的單菌落。挑單菌落接種到3ml含抗生素的yeb液體培養基中，於28℃振蕩培養過夜，第2天按1％接種量轉接入50ml含抗生素的yeb液體培養基中，200rpm繼續振蕩培養至od600為0.4至0.6左右後，將新鮮的根癌農桿菌菌液於5000rpm、離心5分鐘，收集並重懸於1/3體積的aam液體培養基中，此時獲得可用於轉化水稻各種受體的材料。

採用常規的根癌農桿菌轉化方法轉化秈稻品種9311的幼胚愈傷。取授粉後12-15天的秈稻品種9311未成熟種子經70％乙醇浸泡1分鐘後，於次氯酸鈉溶液中(與水1∶3混合，加2-3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無菌水衝洗4-5次，然後用解剖刀和鑷子挑出幼胚並轉入到n6d2培養基上誘導愈傷組織，在26±1℃、避光條件下培育，4天後可用於轉化。將幼胚愈傷浸泡入新鮮的aam根癌農桿菌菌液中並不時搖動，20分鐘後將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉移到n6d2c培養基上，於26℃共培養3天。共培養時，在共培養培養基中加入乙醯丁香酮，使用濃度為100μm。3天後，從共培養培養基上取出愈傷組織，切去胚芽並轉入含有25mg/l潮黴素的選擇培養基上進行選擇培養。7-12天後將抗性愈傷組織轉到含有50mg/lhyg的選擇培養基上繼續篩選。10-12天後生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到預分化培養基上培養一周左右，再移至分化培養基上分化(12小時光照/天)。再生的小苗在1/2ms0h培養基上生根壯苗，隨後移入人工氣候室營養液栽培。

轉化植株提取葉片總dna，利用cyp703a3突變位點檢測引物，即cyp703a3crisprup(如seqidno.5所示)和cyp703a3crisprdown(如seqidno.6所示)，經pcr進一步鑑定轉化植株。測序檢測靶位點基因序列，如果發生純合突變則為有效的基因敲除植株cyp703a3-a(基因型為msms)，得到水稻雄性不育系cyp703a3-a能實現完全不育。不育單株cyp703a3-a中兩條同源染色體均發生了插入，一個插入鹼基a，一個插入鹼基g，不育單株為含兩個不同的等位突變基因，後代表型一致為不育。具體如seqidno.3所示或如seqidno.4所示的核苷酸。如圖2所示，在箭頭所示位點插入了a鹼基或g鹼基。

3創製具有螢光分選基因的cyp703a3中間父本材料cyp703a3-b

構建工程核不育中間父本載體pcambia1300-dsred-cyp703a3，導入cyp703a3-a，轉基因群體中選擇可育株cyp703a3-b(基因型為msmsms-l)。

從野生型9311幼苗葉片中提取基因組dna作為模板，設計併合成特異性引物：

9311gdnaf(其序列如seqidno.7所示)：gggatgggtgtttgactctg

9311gdnar(其序列如seqidno.8所示)：cctgtgctcactcggaag

擴增出如seqidno.9所示的大小為4429bp的基因組序列片段；

通過大連寶生物公司的in-fusion轉化體系將擴增如seqidno.9所示的dna片段插入到含有分選基因紅色螢光蛋白dsred的用於轉化水稻雙元載體pcambia1300-dsred中；測序驗證正確，獲得水稻雙元表達載體pcambia1300-dsred-cyp703a3，其基因序列如seqidno.10所示；

將上述步驟所得載體通過電擊導入根癌農桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105得到cyp703a3互補根癌農桿菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105轉化體，使用遺傳轉化手段轉化突變體cyp703a3-a營養生殖生長期的幼穗愈傷，從而使編碼如seqidno.10所示胺基酸的核苷酸轉入水稻細胞，並且整合到水稻細胞的染色體上，獲得轉基因苗；種植轉基因苗，收穫t0代種子，種植t0代種子，獲得t1代植株；pcr檢測，以獲得含有目的基因的擬可育單株材料，收穫t1代種子；種植t1代種子，pcr檢測，獲得不含篩選標記基因的可育中間父本材料cyp703a3-b(基因型為msmsms-l)。

4普通核不育系的創製及其繁殖方法

具體流程如圖1所示。以不育單株獲得的cyp703a3-a做母本，可育單株cyp703a3-b為父本，雜交，產生混合種子。

利用美亞光電定製的螢光色選機ak-1，對混合種子進行螢光分選，選擇不含螢光的種子cyp703a3-a(基因型為msms)，實現了普通核不育cyp703a3-a的繁殖。

利用cyp703a3-a與恢復性(基因型為msms)雜交制種，生產f1代雜交種子，用於大田生產。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。