生物大分子相互作用的快速檢測裝置及方法
2024-04-03 04:36:05
生物大分子相互作用的快速檢測裝置及方法
【專利摘要】本發明涉及生物工程領域，旨在提供一種生物大分子相互作用的快速檢測裝置及方法。該裝置包括底板，在底板的表面上設有n個檢測單元，n為≥1的整數；每個檢測單元中包括一個反應孔、一個檢測孔和連接兩者的微管；各檢測孔均通過微管連接至負壓裝置接口；所述微管的直徑為0.1～2毫米；所述反應孔為敞口式，用於滴入反應物；所述檢測孔為閉合式，其內部有一根具有磁性的金屬線，金屬線與該組檢測單元中微管的方向一致。本發明可以直接觀察抗原抗體或兩個生物大分子之間的相互作用，僅需要1-2分鐘，即可通過肉眼或者儀器判定反應情況。該裝置適用於ELISA原理檢測的所有生物分子，具有高效、簡捷、快速、方便、適用廣等特點。
【專利說明】生物大分子相互作用的快速檢測裝置及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程領域，具體涉及一種用於檢測生物大分子相互作用的裝置及方法。
【背景技術】
[0002]酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assays, ELISA)自 1971 年被Engvall和Perlman報導以來，在免疫學和生物化學領域得到了廣泛的應用。隨著方法的不斷改進、酶標儀的不斷更新，在抗原和抗體的檢測方面，ELISA仍是目前實驗室檢測分析中最常用的技術之一。ELISA方法的基本原理是抗原與抗體分子共價結合後，不影響各自的免疫學活性。通過抗原包被、封閉、加一抗、加酶標二抗、底物顯色等步驟，判定抗原與抗體反應的特異性,通過顏色反應的深淺確定抗體或抗原的濃度。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀(酶標儀)進行定量測定，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。然而，ELISA反應從抗原包被到底物顯色，需要多個步驟，在時間上需要4-6小時甚至過夜。目前商業化的ELISA檢測試劑盒，一般採用含有預包被抗原或者抗體的酶標板，但在檢測時間上仍需要2-4小時之久。
[0003]因此，目前的檢測技術需要從時間上解決快速檢測反應問題。為此，免疫膠體金層析技術開始問世。層析法檢測技術最早出現於1988年，是Unipath公司利用納米膠體金顆粒開發生產的一種孕檢層析試紙條，使用預製的試紙條3-5分鐘可以出檢測結果。此後，免疫膠體金在快速檢測試劑中得到了廣泛的應用和發展。但是膠體金技術需要不同納米顆粒的膠體金製作、噴金、點樣等設備，而且層析反應往往與ELISA反應不一致。在ELISA中可以出現的抗原和抗體反應，在膠體金層析試紙條中卻不出現。
[0004]因此，為了解決ELISA反應時間長的缺點，同時又能解決免疫層析中常常出現的低靈敏性問題。本發明提供了一種解決方案，即:一種快速檢測抗原和抗體反應(或生物大分子相互作用)的裝置。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種生物大分子相互作用的快速檢測裝置及方法。
[0006]為解決技術問題，本發明的解決方案是:
[0007]提供一種生物大分子相互作用的快速檢測裝置，包括底板，在底板的表面上設有η個檢測單元，η為> I的整數；每個檢測單元中包括一個反應孔、一個檢測孔和連接兩者的微管；各檢測孔均通過微管連接至負壓裝置接口 ；所述微管的直徑為0.1?2毫米；所述反應孔為敞口式，用於滴入反應物；所述檢測孔為閉合式，其內部有一根具有磁性的金屬線，金屬線與該組檢測單元中微管的方向一致。
[0008]本發明中，所述底板是塑料、陶瓷或聚乙烯等惰性材料的底板。
[0009]本發明中，所述微管是聚乙烯、丙烯或丁烯塑料材質的管道。[0010]本發明中，所述反應孔的容量為10?500微升。
[0011]本發明中，所述檢測單元至少有兩個，各檢測單元相互並列且平行布置，其反應孔和檢測孔分列底板的兩端且排布成行。
[0012]本發明中，所述負壓裝置接口是用於連接蠕動泵或吸耳球的接口。
[0013]本發明還進一步提供了一種基於前述裝置的生物大分子相互作用的快速檢測方法，包括以下步驟:
[0014](I)根據免疫磁珠的產品使用說明將第一種生物大分子偶聯在免疫磁珠上，然後依次加入待檢測物質和至少一種標記的第二種生物大分子；該過程有兩種實現方式:在試管中完成混合後將反應物液體加入反應孔，或是依次向反應孔中加入反應物液體；
[0015]所述第一種生物大分子是蛋白質、多糖、多肽、核酸或化學藥物中的任意一種，所述待檢測物質和第二種生物大分子是蛋白質、多肽、多糖、毒素、化學藥物或核酸中的任意一種。其中，第二種生物大分子能與待檢測物質結合；用於第二種生物大分子的標記物是膠體金、螢光材料、化學發光材料或上轉發光材料中的任意一種；
[0016](2)啟動蠕動泵，使反應孔中的反應物液體流向檢測孔；如果偶聯到磁珠上的第一種生物大分子、待檢測物質、標記的第二種生物大分子發生了相互作用，反應物液體在流經檢測孔時會被吸附到檢測線上；通過肉眼、螢光檢測器、化學發光檢測器或者上轉發光檢測器能夠檢測到磁線的顏色變化。
[0017]本發明中，加入反應孔中的反應物液體中，偶聯到磁珠上的第一種生物大分子的濃度為0.1?I微克/暈升；標記的第二種生物大分子的濃度根據其生產商的推薦值確定。
[0018]本發明利用活化的免疫磁珠與生物大分子反應的特性，將第一種生物大分子與免疫磁珠偶聯後，再封閉未反應的活性位點。然後加入待檢測的物質和標記的第二種生物大分子。其中，待檢測物能同時與第一種生物大分子和第二種生物大分子共價結合，並形成帶有「磁性」的複合體，在反應物流經檢測孔時，被會被吸附到檢測孔中的磁鐵線上，並可以用肉眼、螢光、化學發光或上轉發光儀檢測。使用何種儀器檢測取決於第二種生物大分子的標記物。如果標記物為膠體金，則反應物複合物肉眼可見。如果標記物為螢光物質，反應複合物可用帶有濾光片的螢光檢測儀檢測。只要條件具備，從反應到檢測僅需要1-2分鐘。由於反應是在液體中進行，因此保持了常規ELISA中各反應物質的免疫學活性，從而實現了快速檢測的目的。
[0019]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0020]本發明可以直接觀察抗原抗體或兩個生物大分子之間的相互作用，僅需要1-2分鐘，即可通過肉眼或者儀器判定反應情況。
[0021]該裝置適用於ELISA原理檢測的所有生物分子。
[0022]相對於【背景技術】，本發明具有高效、簡捷、快速、方便、適用廣等特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明所述方形(2x8孔)反應裝置示意圖。
[0024]圖中的附圖標記為:反應孔I ;磁性的金屬線2 ;檢測孔3 ;蠕動泵接口 4。其中，反應複合物將被吸附於「磁性的金屬線」上。【具體實施方式】
[0025]發明原理介紹:
[0026]本發明中的生物大分子相互作用快速檢測裝置，依據的原理是將免疫磁珠與磁鐵之間的特異性吸附，以及抗原與抗體的共價結合原理製作而成。將其中之一生物大分子與免疫磁珠偶聯。另外一個生物大分子與酶、螢光基團、化學發光基團或上轉發光基團偶聯。如果兩個生物大分子直接或者間接發生相互作用，可以形成具有磁性的複合物。從而在流經磁鐵線時被吸附。
[0027]本實施例中如圖1所示，檢測裝置呈方形，反應孔為2x8孔(在實際使用中可以根據樣品數量進行增減)，並聯排列，互不幹擾。檢測孔3與反應孔I 一一對應，檢測孔3與檢測孔I之間也互不幹擾。在檢測孔3 —側相互連接的微管上設有一個蠕動泵接口 4。通過蠕動泵負壓可以將反應孔I內的液體吸入檢測孔3內，並最終流入廢液容器。本發明中，也可用吸耳球等能產生負壓的裝置代替蠕動泵，其主要目的是促進液體順利流經檢測孔。
[0028]底板為塑料、陶瓷、聚乙烯等惰性材料，該材料不與蛋白質、多肽、多糖、毒素、化學藥物、核酸等生物大分子結合，也不與磁性物質發生「磁性結合」反應。反應孔I的容量為10微升至500微升，開放式。連接反應孔I和檢測孔3的微管材質為聚乙烯、丙烯或丁烯塑料，微管直徑為0.1毫米至2毫米。檢測孔3為閉合式，僅包括液體流過的通道，容量取決於微管直徑。
[0029]在進行檢測分析之前，將第一個生物大分子與活化的免疫磁珠偶聯，偶聯物根據其性質可以放在室溫、4°C或-20°C保存備用。然後用封閉液封閉免疫磁珠上未反應的活性位點，再將磁珠偶聯物與待檢物質、標記的第二種生物大分子依次混合，加入反應孔I內。將裝置與螺動泵相連，啟動螺動泵，使液體流動(或者用吸耳球，產生吸力)。液體將從反應孔I流經檢測孔3。通過肉眼、螢光檢測裝置、化學發光檢測裝置或者上轉發光檢測裝置進行檢測。陽性反應，應在檢測孔3呈現顏色，且沿磁性的金屬線分布。
[0030]本發明中，標記的第二種生物大分子通常使用商品化的產品，具體的反應濃度則依據生產商推薦使用濃度來確定，不同生產商推薦數據略有變化。
[0031]以下的實施例可以使本專業【技術領域】的技術人員更全面的了解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0032]實施例1
[0033]1.生物大分子相互作用的快速檢測裝置製作
[0034]參照圖1定製模具，其中模具尺寸:長X寬=12x6釐米；材質為聚乙烯塑料。反應孔I的尺寸:長X寬X深=0.7x0.5x0.3釐米，為開放式，可用於加樣。檢測孔3與反應孔I尺寸相同，但為封閉式，僅用於沿微管方向鑲嵌一條即磁性的金屬線2，尺寸:長X寬X高=0.5x0.1x0.1釐米。反應孔I與檢測孔3平行排列，相距4釐米，通過微管道相連。微管道直徑0.1釐米。所有管道通過檢測孔後，外延I釐米匯總至蠕動泵接入口。微管道為模具製作，一次成型。
[0035]2.應用
[0036]本裝置的應用可以理解為基於ELISA原理的一種免疫磁珠吸附技術。目前商品化的免疫磁珠表面含氨基、羧基、矽基、鏈黴親和素、醛基或巰基等活性基團。按照廠家說明書將生物分子與免疫磁珠偶聯。以下程序以結核分枝桿菌外膜蛋白OmpA與NHS活化的磁珠(Pierce公司，貨號88826，可以和含有氨基的生物分子結合)的偶聯為例，闡述免疫磁珠與OmpA蛋白的偶聯過程和檢測方法:
[0037]取300微升磁珠置於1.5毫升離心管中，垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄。加入I毫升預冷的I mM鹽酸，輕輕震蕩混勻，垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄。立即加入300微升純化的OmpA蛋白(注:蛋白濃度為0.1-2毫克/毫升，用PH 8.5的50 mM硼酸鹽溶解；或者用不含氨基的pH 7-9的緩衝液溶解；緩衝液中不能含有Tris或者甘氨酸)，輕輕震蕩30秒。置於旋轉混勻器上，室溫或者4°C反應I小時。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄，收集磁珠。加I毫升0.1M甘氨酸(pH2.0)，震蕩混勻15秒。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄，收集磁珠。用0.1M甘氨酸(pH 2.0)反覆洗滌磁珠2次。加I毫升超純水，震蕩混勻15秒。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄，收集磁珠。加I毫升淬滅緩衝液(3M乙醇胺，PH 9.0)封閉磁珠表面的活性基團，震蕩混勻30秒後室溫反應2小時。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄，收集磁珠。加I毫升超純水，混勻。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄，收集磁珠。加I毫升存儲液(50 mM硼酸鹽，pH 8.5,0.05%疊氮鈉)，震蕩混勻15秒。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄，收集磁珠。用存儲液洗滌2次。最後用300微升存儲液懸浮磁珠蛋白偶聯物，於4°C保存備用(此時OmpA蛋白-磁珠偶聯物終濃度為10毫克/毫升)。
[0038]將OmpA蛋白-磁珠偶聯物用磷酸鹽緩衝液(10mM，pH 7.4)稀釋成I微克/毫升，取50微升置於1.5毫升離心管中，然後加入50微升待檢測的結核桿菌抗體，再加入50微升FITC標記的Protein A/G (也可以用HRP或者膠體金或者上轉發光顆粒等標記)。輕輕震蕩混勻，室溫反應5分鐘。將100微升反應樣品滴於生物大分子相互作用的快速檢測裝置中的反應孔I內。連接蠕動泵或者吸耳球，使液體從反應孔I流向檢測孔3，最終反應液全部流出廢液池內。
[0039]用肉眼(適用於膠體金或HRP標記的Protein A/G ;如果是HRP標記,還需要加入鄰苯二胺)、螢光檢測裝置(適用於FITC等螢光素標記的Protein A/G)、上轉發光檢測裝置(適用於上轉發光顆粒標記的Protein A/G)檢測檢測孔是否出現反應線。
[0040]在滴入反應孔中的反應樣品中，OmpA蛋白-磁珠偶聯物的濃度為I微克/毫升，待檢測的結核桿菌抗體的檢測下限線濃度為0.001微克/毫升(高於此濃度均可檢出)，商品化的FITC標記的Protein A/G的濃度為0.01微克/毫升(此濃度由生產商推薦，不同生產商推薦的使用濃度略有變化)。
[0041]實施例2
[0042]1.生物大分子相互作用的快速檢測裝置製作，與實施例1相同。
[0043]2.應用
[0044]本實施例的實施方式與實施例1的原理一致，以下程序以核酸為例，闡述其與鏈黴親和素活化的磁珠(Pierce公司，貨號88816，可以和含有生物素的生物分子結合)的偶聯，闡述免疫磁珠與核酸的偶聯過程和檢測方法:
[0045]取50微升(約0.5毫克)磁珠置於1.5毫升離心管中，垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄。加入I毫升洗滌緩衝液(IOmM Tris-HCl, pH 7.0，含0.1% Tween-20)輕輕震蕩混勻，垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄。立即加入300微升生物素標記的核酸片段(注:核酸濃度為2微克/毫升，用上述洗滌緩衝液溶解)，輕輕震蕩30秒。置於旋轉混勻器上，室溫或者4°C反應I小時或者過夜。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上,吸取上清並丟棄,收集磁珠。加300毫升洗滌緩衝液，吸取上清並丟棄,收集磁珠。反覆洗滌磁珠2次，最後用300毫升洗滌緩衝液懸浮磁珠。於4°C保存備用(此時核酸-磁珠偶聯物終濃度約為1-2微克/毫升)。
[0046]將核酸-磁珠偶聯物用磷酸鹽緩衝液(10mM，pH 7.4)稀釋成0.1微克/毫升，取50微升置於1.5毫升離心管中，然後加入50微升待檢測第二種生物分子(小分子毒素，濃度為I納克-1微克/毫升)，加入50微升毒素特異性抗體(單克隆抗體，稀釋倍數為1:10000)，再加入50微升標記的二抗(FITC標記的羊抗鼠抗體，稀釋倍數為1:5000)。輕輕震蕩混勻，室溫反應5分鐘。將100微升反應樣品滴於生物大分子相互作用的快速檢測裝置中的反應孔I內。連接蠕動泵或者吸耳球，使液體從反應孔I流向檢測孔3，最終反應液全部流出廢液池內。檢測步驟同實施例一。
[0047]在滴入反應孔中的反應樣品中，核酸-磁珠偶聯物的濃度為0.1微克/毫升，待檢測的小分子毒素的檢測下限濃度為I納克/毫升(高於此濃度均可檢出)，毒素特異性抗體的濃度為I納克/毫升，商品化的FITC標記的羊抗鼠抗體的濃度為0.01微克/毫升(此濃度由生產商推薦，不同生產商推薦的使用濃度略有變化)。
[0048]實施例3
[0049]1.生物大分子相互作用的快速檢測裝置製作，與實施例1相同。
[0050]2.應用
[0051]本實施例的實施方式與實施例1原理一致，以下程序以抗體為例，闡述其與ProteinA/G活化的磁珠(Pierce公司，貨號88802,可以和抗體分子結合)的偶聯,闡述免疫磁珠與抗體的偶聯過程和檢測方法:
[0052]取50微升(約0.5毫克)磁珠置於1.5毫升離心管中，垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄。加入150微升洗滌緩衝液(IOmM Tris-HCl, pH 7.0，含0.1%Tween-20)輕輕震蕩混勻，垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄。加入I毫升洗滌緩衝液，將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄。立即加入500微升樣品(如:含抗體的血清、細胞培養物、腹水等)，輕輕震蕩30秒。置於旋轉混勻器上，室溫反應I小時。將離心管垂直放置於含有磁鐵的底座上，吸取上清並丟棄，收集磁珠。加300毫升洗滌緩衝液，吸取上清並丟棄，收集磁珠。反覆洗滌磁珠2次，最後用300毫升洗滌緩衝液懸浮磁珠。於4。C保存備用。
[0053]取50微升抗體-磁珠偶聯物置於1.5毫升離心管中，然後加入50微升標記的、能與磁珠上抗體反應的小分子毒素，再加入能與毒素反應的FITC標記的核酸適體，輕輕震蕩混勻，室溫反應5分鐘。將100微升反應樣品滴於生物大分子相互作用的快速檢測裝置中的反應孔I內。連接蠕動泵或者吸耳球，使液體從反應孔I流向檢測孔3，最終反應液全部流出廢液池內。檢測步驟同實施例一。
[0054]在滴入反應孔中的反應樣品中，抗體-磁珠偶聯物的濃度為0.5微克/毫升，待檢測的毒素的檢測下限濃度為I納克/毫升(高於此濃度均可檢出)，FITC標記的核酸適體濃度為0.1微克/暈升。
[0055]以上是結合具體實施例子對本發明所做的進一步描述。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明原理的前提下，本發明及其應用還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。
【權利要求】
1.生物大分子相互作用的快速檢測裝置，包括底板，其特徵在於，在底板的表面上設有η個檢測單元,η為> I的整數；每個檢測單元中包括一個反應孔、一個檢測孔和連接兩者的微管；各檢測孔均通過微管連接至負壓裝置接口 ；所述微管的直徑為0.1?2毫米；所述反應孔為敞口式，用於滴入反應物；所述檢測孔為閉合式，其內部有一根具有磁性的金屬線，金屬線與該組檢測單元中微管的方向一致。
2.根據權利要求1所述裝置，其特徵在於，所述底板是塑料、陶瓷或聚乙烯惰性材料的底板。
3.根據權利要求1所述裝置，其特徵在於，所述微管是聚乙烯、丙烯或丁烯塑料材質的管道。
4.根據權利要求1所述裝置，其特徵在於，所述反應孔的容量為10?500微升。
5.根據權利要求1至4任意一項中所述的裝置，其特徵在於，所述檢測單元至少有兩個，各檢測單元相互並列且平行布置，其反應孔和檢測孔分列底板的兩端且排布成行。
6.根據權利要求1至4任意一項中所述的裝置，其特徵在於，所述負壓裝置接口是用於連接蠕動泵或吸耳球的接口。
7.一種基於權利要求1所述裝置的生物大分子相互作用的快速檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟:(1)根據免疫磁珠的產品使用說明將第一種生物大分子偶聯在免疫磁珠上，然後依次加入待檢測物質和至少一種標記的第二種生物大分子；該過程有兩種實現方式:在試管中完成混合後將反應物液體加入反應孔，或是依次向反應孔中加入反應物液體；所述第一種生物大分子是蛋白質、多糖、多肽、核酸或化學藥物中的任意一種，所述待檢測物質和第二種生物大分子是蛋白質、多肽、多糖、毒素、化學藥物或核酸中的任意一種，所述標記的第二種生物大分子能與待檢測物質結合；用於第二種生物大分子的標記是膠體金、螢光材料、化學發光材料或上轉發光材料中的任意一種；(2)啟動蠕動泵，使反應孔中的反應物液體流向檢測孔；如果偶聯到磁珠上的第一種生物大分子、待檢測物質、標記的第二種生物大分子發生了相互作用，反應物液體在流經檢測孔時會被吸附到檢測線上；通過肉眼、螢光檢測器、化學發光檢測器或者上轉發光檢測器能夠檢測到磁線的顏色變化。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，加入反應孔中的反應物液體中，偶聯到磁珠上的第一種生物大分子的濃度為0.1?I微克/暈升；標記的第二種生物大分子的濃度根據其生產商的推薦值確定。
【文檔編號】G01N33/532GK103439506SQ201310349468
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】宋厚輝, 張志剛, 申會剛, 李然棟 申請人:杭州戈登生物科技有限公司