44個snp位點多色螢光複合檢測的方法及試劑盒的製作方法
2024-04-01 07:36:05
專利名稱：44個snp位點多色螢光複合檢測的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及法醫學個體識別，特別涉及SNP位點的基因分型，尤其是一種用於法 醫學個體識別的44個SNP位點多色螢光複合檢測的方法及試劑盒。
背景技術：
法醫檢案工作中，由於高溫、潮溼、暴曬、微生物等因素的影響，生物性檢材中的 DNA分子經常被損壞，發生斷裂，分子變小，大片段丟失，無法進行有效的STR分型，使案件 偵破限於困境。目前，法醫DNA分析中解決高度降解檢材DNA樣本分型的技術主要集中在 兩個方面一種是miniSTR(小片段短串聯重複)分析技術。這種技術是通過將STR(短 串聯重複)遺傳標記的擴增引物設計的儘可能接近重複區域而縮短PCR產物片段長度， 應用於高度降解檢材和微量檢材中可以提高DNA分型的成功率。但在分析高度降解檢材 方面，miniSTR基因座分析的DNA片段範圍在80 150bp，對於< IOObp的高度降解DNA， miniSTR基因座分析技術仍然具有局限性。而且，由於擴增片段長度和螢光染料種類的限 制，在一個複合擴增體系中只可以同時擴增較少的miniSTR基因座，一般為一種螢光物質 標記一個基因座，一個擴增體系最多可同時複合4個miniSTR基因座，要想達到個體識別效 能，就必須增加複合擴增系統的數量，至少需要3 4個複合擴增系統，因此，不適合微量檢 材的應用。另一種是SNPs分析技術，SNPs (單核苷酸多態性)是繼限制性片段長度多態性 (restriction fragmeng length polymorphism, RELP)禾口短串聯重複序列(short tandem repeats, STRs)之後被發現的又一種人類遺傳性標記，被稱為第三代遺傳標記，指人類基因 組中特定部位的單個鹼基序列的變異，其在人類基因組中分布極為廣泛，大約每1000個鹼 基中就存在一個SNP，估計在人類基因組中大約有數百萬個SNPs，數量超出STR基因座數目 的幾個數量級，而且，SNPs具有突變率低，擴增片段短，適合高通量檢測和易於分型等特點， 因此在法醫學個體識別應用中具有廣闊前景。選用可靠的多重分型方法，許多SNPs位點可 以在短至45 55bp (變異位點兩側引物序列長度)的擴增片段內分型，因此，當DNA樣本 嚴重降解或遇到檢材微量時，SNPs分析將更有價值。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種用於個體識別的44個SNP位點多色螢光復 合檢測的方法及試劑盒，使待測靶DNA的片段範圍縮短至69 125bp，提高對高度降解DNA 分型的成功率。為解決上述技術問題，本發明採取的技術方案是用於個體識別的44個SNP位 點多色螢光複合檢測的試劑盒，其包括a)擴增體系PCR緩衝溶液、MgCl2、dNTPs, PCR 引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)擴增產物純化試劑核酸外切酶I (Exo I)及其緩 衝溶液(Exo I Buffer)、蝦鹼性磷酸酶(SAP)及其緩衝溶液(SAP Buffer), c)延伸反 應試劑延伸引物和SNaPshot反應混合液，d)測試試劑=Hi-Di甲醯胺和GeneScan Size Standards-120LIZ，所述PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點的引物組成，所述44個SNP基因位點在NCBI中SNP資料庫的rs號分別為rs 1109037，rs3780962, rs987640,rs9951171,rs430046,rs338882,rs2342747,rsl0092491,rsl821380,rs321198, rs7041158, rsl3218440, rs560681, rs445251, rs8078417, rsl0488710, rs7520386, rs214955, rs4530059, rsl3182883, rs722290, rs6811238, rs279844, rs9905977, rs6955448, rs4288409, rs315791, rs740598, rs2272998, rs7205345, rsl0773760, rs221956,rs576261,rsl498553,rs2399332, rsl058083,rs993934,rsl336071, rsl294331, rsl523537, rs2269355, rsl2997453,rsl736442 和 rsl0776839。上述SNP基因位點根據以下標準進行選取(1)具有高的雜合度(彡0. 4)；⑵等 位基因頻率在全球各大人群之間差異小(Fst < 0. 06) ； (3)系統內SNPs之間要處於連鎖平 衡狀態，位點之間的物理距離至少大於1Mb ;(4)系統內的SNP數目要足夠多以達到個體識 別效能；所有SNP位點的群體遺傳學數據已經在公開刊物上發表。其相關信息見表1。表ISNP基因位點相關信息
4 所述44個SNP基因位點的PCR引物和延伸引物的序列參見表2。根據NCBI的SNP 資料庫(dbSNP)提供的DNA序列，設計44個SNP位點的PCR引物，PCR引物長度20 29個 鹼基，擴增產物長度69 125bp，退火溫度60士5°C，GC含量40 60%。又設計了延伸 引物，延伸引物的3』末端位於多態性位點的上遊1個鹼基處，延伸引物與模板DNA互補部 分的特異性引物長度18 30個鹼基，退火溫度50士2°C。同一反應管中，被檢測突變相同 的位點的引物長度相差3 6個鹼基，為了改變引物的長度，區分不同的位點，在特異性引 物的 5，端加 poly(dT)或 poly(dCT)。表2 44個SNP基因位點的PCR引物和延伸引物的序列表 利用上述的試劑盒進行個體識別的測試方法，按照下列步驟進行a)提取DNA，得DNA提取液；b)在擴增體系中加入步驟一所得的DNA提取液，然後在擴增儀中進行擴增，擴增 條件為95°C、5min預變性；然後依次在95°C、30s，60°C、30s，65°C、30s，進行35個循環；再 在65°C保持7min ；最終在4°C保存，獲得擴增產物；c)應用核酸外切酶I和蝦鹼性磷酸酶純化擴增產物，純化反應條件37°C、lh，然 後8(TC、15min，最終在4°C保存，得純化後的擴增產物；d)對純化後的擴增產物進行延伸反應將純化後的擴增產物加入至所述的延伸反應試劑中進行延伸反應；所述的延伸反應 的條件依次在96°C、10s, 50°C、5s，60°C、30s進行25個循環，最終保存在4°C，得延伸產物；e)應用蝦鹼性磷酸酶純化延伸產物將延伸產物加入至蝦鹼性磷酸酶及其緩衝溶液的混合液中，在下列條件下進行純 化反應371、111，651、151^11，最終保存在41，得純化後的延伸產物；f)檢測、確定產物，將步驟e)中得到的純化後的延伸產物中加入至所述的測試試劑中，混勻；然後 95°C變性3min，4°C迅速冷卻後進行電泳檢測；最後根據延伸產物峰的位置和顏色確定44 個SNP基因位點的基因型。採用本發明產生的有益效果在於採用本發明可以快速、準確地獲得44個SNP位 點的基因分型，並通過螢光自動分型設備檢測分析，對人類生物檢材進行個體識別。本發明 在對高度降解檢材DNA的法醫學個體識別方面具有很大的優勢和潛力。
圖1和圖2分別是本發明的檢測結果的附圖。
具體實施例方式
用於個體識別的44個SNP位點多色螢光複合檢測的試劑盒，其包括a)擴增體系PCR緩衝溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)擴增產物純化試劑 核酸外切酶I及其緩衝溶液、蝦鹼性磷酸酶及其緩衝溶液，c)延伸反應試劑延伸引物和 SNaPshot 反應混合液，d)測試試劑Hi_Di 甲醯胺和 GeneScan Size Standards_120LIZ， 所述PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點的引物組成，所述44個SNP基因位點在 NCBI 中 SNP 資料庫的 rs 號分別為 rsl 109037, rs3780962, rs987640, rs9951171, rs430046, rs338882, rs2342747, rsl0092491, rsl821380, rs321198, rs7041158, rsl3218440, rs560681, rs445251, rs8078417, rsl0488710, rs7520386, rs214955, rs4530059, rsl3182883, rs722290, rs6811238, rs279844, rs9905977, rs6955448, rs4288409, rs315791,rs740598,rs2272998,rs7205345,rsl0773760,rs221956,rs576261,rsl498553, rs2399332, rsl058083, rs993934, rsl336071, rsl294331, rsl523537, rs2269355, rsl2997453,rsl736442 和 rsl0776839。所述PCR引物和延伸引物的序列表、濃度分別參見表2和表3。所述延伸引物由延伸引物混合物I (26個位點)和延伸引物混合物II (18個位點) 由不同長度的延伸引物組成，分別針對44個SNP位點的多態性位點。表3PCR引物和延伸引物的濃度 利用上述的試劑盒進行個體識別的測試方法，按照下列步驟進行a)提取DNA，得DNA提取液；b)多重PCR擴增包含44個SNP位點的DNA片段
在擴增體系中加入步驟一所得的DNA提取液，然後在擴增儀中進行擴增。所述PCR 擴增體系的總體積為25 y L，擴增體系的組分、濃度或含量如下
10XPCR緩衝溶液 Mg2+ (25mM) dNTPs(lOmM)
PCR引物(濃度參見表3) Taq DNA 聚合酶(5U/ u L) 模板 DNA(1 lOng/iiL) 去離子水
擴增的熱循環參數
2. 5u L 5. 5 u L 2u L
1 u L 0. 3u L 1 u L 12. 7u L
35循環
95°C 95 °C 60 °C 65 °C 65°C
4°C
得擴增產物；
c)應用核酸外切酶I (Exo I)和蝦鹼性磷酸酶(SAP)純化步驟b)所得的擴增產
5min
30s
30s
30s
7min
保存
物，純化反應體系和純化反應條件如下擴增產物的純化反應體系，體積10 ii L 10 X Exo I Buffer1 u L10 X SAP Buffer1 u LExo I (5U/ u L)2u LSAP(lU/u L)2u L擴增產物4 ii L擴增產物純化反應的條件37 °Clh80 °C15min4°C保存得到純化後的擴增產物；d)將純化後的擴增產物加入至所述的延伸反應試劑中進行延伸反應；延伸反應 試劑和延伸反應條件如下延伸反應體系，反應體積10 ii L SNaPshot 反應混合液5 ii L純化後的擴增產物3iiL延伸引物(3. 3 13. 3 iiM，具體參見表3) luL去離子水1 ii L
13
延伸反應的熱循環參數
96°C10s ,
50°C5s I 25 循環
60 °C30s 『
4°C保存得延伸產物；e)應用蝦鹼性磷酸酶純化延伸產物延伸產物純化反應體系，反應體積10 ii L 10 X SAP Buffer1 u LSAP (5U/ u L)2u L去離子水5 ii L延伸產物2u L延伸產物純化反應條件37 °Clh65 °C15min4°C保存得純化後的延伸產物；f)檢測、確定產物，將步驟e)中得到的純化後的延伸產物中加入11. 5ii L Hi_Di甲醯胺和0. 5 y L GeneScan Size Standards-120 LIZ 混勻；然後 95°C變性 3min，4°C迅速冷卻後，用美國 AB 公司的DNA自動分析儀進行電泳檢測，檢測條件1500V電壓，36cm毛細管，P0P4凝膠，電泳 20min;應用Data Collection 3. 0軟體收集數據，GenemapperV 3. 2軟體進行結果分析。其 中一實施例的結果圖見附圖1和圖2。
1權利要求
44個SNP位點多色螢光複合檢測的試劑盒，其包括a)擴增體系PCR緩衝溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)擴增產物純化試劑核酸外切酶Ⅰ及其緩衝溶液、蝦鹼性磷酸酶及其緩衝溶液，c)延伸反應試劑延伸引物和SNaPshot反應混合液，d)測試試劑Hi Di甲醯胺和GeneScanTM Size Standards 120LIZ，其特徵在於，所述PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點的引物組成，所述44個SNP基因位點在NCBI中SNP資料庫的rs號分別為rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839。
2.根據權利要求1所述的44個SNP位點多色螢光複合檢測的試劑盒，其特徵在於所述 44個SNP基因位點的PCR引物和延伸引物的序列參見表2。
3.根據權利要求1或2所述的44個SNP位點多色螢光複合檢測的試劑盒，其特徵在於 同時複合擴增包含44個SNPs位點的DNA片段。
4.利用權利要求1所述的試劑盒進行個體識別的測試方法，其特徵在於按照下列步驟 進行a)提取DNA，得DNA提取液；b)在擴增體系中加入步驟一所得的DNA提取液，然後在擴增儀中進行擴增，擴增條件 為95°C、5min預變性；然後依次在95°C、30s，60°C、30s，65°C、30s，進行35個循環；再在 65°C保持7min ；最終在4°C保存，獲得擴增產物；c)應用核酸外切酶I和蝦鹼性磷酸酶純化擴增產物，純化反應條件37°C、lh，然後 80°C、15min,最終在4°C保存，得純化後的擴增產物；d)對純化後的擴增產物進行延伸反應將純化後的擴增產物加入至所述的延伸反應試劑中進行延伸反應；所述的延伸反應的 條件依次在96°C、10s, 50°C、5s，60°C、30s進行25個循環，最終保存在4°C，得延伸產物；e)應用蝦鹼性磷酸酶純化延伸產物將延伸產物加入至蝦鹼性磷酸酶及其緩衝溶液的混合液中，在下列條件下進行純化反 應371、111，651、151^11，最終保存在41，得純化後的延伸產物；f)檢測、確定產物，將步驟e)中得到的純化後的延伸產物中加入至所述的測試試劑中，混勻；然後95°C變 性3min，4°C迅速冷卻後進行電泳檢測；最後根據延伸產物峰的位置和顏色確定44個SNP 基因位點的基因型。
全文摘要
本發明公開了一種用於個體識別的44個SNPs位點多色螢光複合檢測試劑盒和檢測方法，所述試劑盒包括PCR引物，DNA聚合酶，PCR緩衝液，核酸外切酶Ⅰ，蝦鹼性磷酸酶，延伸引物和SNaPshot反應混合液；PCR引物和延伸引物由44個SNP基因位點的引物，分別針對包含44個SNP位點的DNA片段。採用本發明可以快速、準確地獲得44個SNP位點的基因分型，並通過螢光自動分型設備檢測分析，對人類生物檢材進行個體識別。
文檔編號C12Q1/68GK101921860SQ201010265870
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者叢斌, 婁春光, 李淑瑾 申請人:河北醫科大學