檢測番茄潰瘍病菌的巢式nest-pcr的擴增引物及其檢測試劑盒和試劑盒使用方法
2024-04-01 05:52:05
專利名稱：檢測番茄潰瘍病菌的巢式nest-pcr的擴增引物及其檢測試劑盒和試劑盒使用方法
技術領域：
本發明是一種番茄細菌性潰瘍病菌的基因檢測擴增引物及其試劑盒，屬 於植物病原菌的4企測領域，專一針對番茄細菌性潰瘍病菌Clavibacter michiganensis subsp, michiganens is ( Cmm )的才企測。適用於番痴糹田菌'l"生 潰瘍病菌的田間預防及進出口植物檢疫中C隱快速片企測。
背景技術：
番茄細菌性潰瘍病是番茄最重要、危害性最大的病害之一。該病害可引 起植株萎蔦、潰瘍和果實斑點，嚴重影響果實的產量和質量。該病菌能侵染 多種茄科植物並引起蔬菜大量減產，給農業生產帶來巨大的經濟損失。因而， 目前歐洲、美洲、亞洲的大多數國家都將其列為重要的檢疫對象。我國自從 1981年首次在北京發現以來，遼寧、山西、黑龍江、新疆等地已相繼才艮道該 病的發生。甘肅省河西地區外繁種子基地是全國最大的對外製種基地，其中 番茄對外製種已經有20年歷史，面積佔總制種面積的10-20%，近年來，已 經在田間屢次發現番茄細菌性潰瘍病，因此所有的外國司都將其列為禁止 攜帶的病害，由於我國目前對該病的研究很少，快速檢測技術尚未建立，每
年都因為未能及時準確的對該病進行快速、準確地鑑定而造成種子退貨，給 農戶和制種公司帶來巨大的經濟損失。
該病病原屬密^丸安棒形桿菌密4丸安亞種(Clavibacter michiganensis subsp， michiganensis )。種子是其遠距離傳播的主要途徑，一4殳種傳率在l%-5°/。，病菌還可存活於土^裡和植物病殘體中，存活期可長達2-3年。由於 種子帶菌率很低，傳統的生物學方法很難快速地分離到病原，且程序煩瑣； 即使比較靈敏的酶聯免疫(ELISA)法檢測，也會造成漏檢，且檢測成本過 高，無法適應口岸檢疫所要求的快速、準確、靈敏的要求。90年代初期，國 外學者將分子生物學方法用於該病的檢測，檢測靈敏度得到了極大的提高， 最低檢測限達到了 100個細菌/反應體系。即便如此，在檢測周期上卻沒有 大的提高，且傳統的薩A抽提過程損失了太多的病原菌，因而不可避免地降 低了 PCR方法應有的靈敏度。
中國專利200410041287. 9公開了一種番茄潰瘍病的4企測試劑盒，最低 檢測限達到了 5 0個細菌/反應體系。
發明內容
本發明的目的在於避免現有技術的不足提供一種^r測番茄潰瘍病菌的 巢式Nest-PCR的擴增引物。
本發明的另一目的是^^開了一種番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速々企 測試劑盒及其使用方法。本發明對番茄種子進行簡單快速的病原菌抽提，去 除種子雜質和影響PCR反應的成分，獲得相對純淨的細菌做為PCR擴增摸板， 用兩對嵌套式引物對模板DNA進行擴增，可以在12小時內完成整個PCR檢 觀'J,不但極大地提高了檢測靈敏度，而且縮短了檢測時間，且結果準確、可 靠，是一種行之有效的植物病原細菌分子生物學檢測方法。
為實現上述目的，本發明採取的技術方案為 一種檢測番茄潰瘍病菌的 巢式Nest-PCR的擴增引物，其主要特點是
第一對引物上遊長度為28bp，下遊長度為26bp的核苷酸序列如下 C醒-A: gtgatgtcagagcttgctctggcggatc; C薩-a: gtacggctaccttgttacgacttagt;
第二對引物上遊長度為23bp，下遊長度為31bp的核苷酸序列如下C麗-B: ccccgactctgggataactgcta ; C醒-b: cggttaggccactggcttcgggtgttaccga; 經過兩次擴增，最終可得到分子量為1297bp的DNA產物。
所述的檢測番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR的擴增引物，其擴增條件為
第一次第一組引物，其擴增條件為PCR循環增加M分鐘，94攝氏度 高溫裂解細菌；釋放DNA作為擴增模板；PCR反應條件為94。C變性30秒， 58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35個循環。
第二次第二組引物，其擴增條件為94。C變性30秒，58。C退火30秒， 72。C延伸40秒，35個循環。
一種番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速檢測試劑盒，其主要特點是， 包括有PCR緩衝液9 x -10 x ，氯化鎂25-20 mmol/L; dNTP 9-10 mmol/L， Taq酶2 IU/uL;引物C應-A和C畫-a各10-15 pmol/yL，引物C薩-B和 C應-b各10-15 pmo1/ u L,雙蒸水99% ~ 100°/。，檢測PCR管6個，陽性對照 PCR管3個，陰性對照PCR管3個，陽性對照1管，陰性對照1管。
一種番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速^^測試劑盒的使用方法，其主 要特點是步驟為
(1) 植物病原細菌的收集和培養；
(2) 第一對引物PCR擴增；
(3) 以第一次擴增結果為才莫板對第二對引物PCR擴增；
(4) 1-1. 5°/。瓊脂糖電泳檢測目標條帶並成像分析；
(5) 對條帶進行分析得出結論。 所述的番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速檢測試劑盒的使用方法，所
述的植物病原細菌的收集和培養的具體步驟是
(a)製備抽提緩沖液:Na2SO30. 13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP ) 2g/ml， 疊氮化納0. 02g/ml，雞蛋清蛋白與吐溫-20 (tween-20)各0. 5ml/L，調製 pH為7. 4;抽提緩沖液使用量根據需要配置，一4殳種子和緩衝液的重量比約為1: 2-10。
(b)製備待檢測材料按照每兩克種子加入2ml提取緩衝液的比例，研 磨種子至種皮破裂，靜置1小時後，用紗布過濾取上清液，5000rpm(轉/每 分鐘)離心5分鐘，用100 u L重懸沉澱直接作模板進行PCR擴增。
一種番茄潰瘍病病菌的巢式Nest-PCR基因組DM ^是取方法如下
A. 取1. 5ml菌體培養物於滅菌Ep管中，12000rpm(轉/每分鐘)離心1分 鍾，除去上清液，收集菌體；
B. 在A步驟中收集的菌體中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40raM 三羥曱基氨基曱烷-醋酸(Tris-醋酸)，20幽的醋酸鈉，在lmM乙二胺四乙酸
(EDTA ) ， 1%十二烷基磺酸鈉(SDS ) ， pH7. 8的條件下混勻，置於37。C水浴1 小時製得；
C. 加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻後於13000rpm(轉/每分鐘)離 心15分鐘；
D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；
E. 在上清液裡，加兩倍體積無水乙醇，上清液1/10體積的醋酸鉀 (3M，pH8. 0), -2(TC保存1小時後,13000rpm(轉/每分鐘)離心15分鐘， 棄上清液，沉澱用70°/。乙醇洗2次；置於室溫乾燥後，溶於50ulTE溶液 中，置4'C保存備用。
本發明的有益效果是本發明番茄細菌性潰瘍病菌的檢測試劑盒，涉及 一種檢測危險性植物病原菌的分子技術，尤其是能快速、筒便、準確的檢測 病原菌的試劑盒，在12小時內就可以完成4企測。
本發明提供了一種依賴PCR的分子檢測試劑盒，克服現有的植物病原菌 檢測方法靈敏性低、特異性差、費時不穩定的不足。該試劑盒能快速、靈敏、 準確的檢測到病原菌，並直接可從植物種子、組織中4企測病原菌。大大簡化 了檢測程序，提高了我國口岸的檢疫水平，同時為病害防治策略的制定提供 了依據。通過對番茄細菌性潰瘍病菌的特異性4企測，引物C顧-A，C薩-a, C醒-B, C醒-b優化的PCR條件對目標菌抹擴增得到了 一段1297bp的PCR產 物，可以特異的檢測目標菌。但是對於8種非目標菌，均無擴增產物。
通過靈敏度的檢測，對番茄細菌性潰瘍病菌純菌液的直接PCR和 Nest-PCR檢測比較，發現直接進行PCR擴增的最低檢出限為2600個細菌 /ml，而Nested-PCR的最低鬥t出量是13個細菌/ml。
通過對番茄^r測，均可從帶菌種子中準確穩定的4企測到1297bp的PCR 產物，和ELISA;^測符合率為99%，且有1%的ELISA未4企測到的帶菌種子， 該試劑盒也可以檢測到目標條帶，說明該試劑盒比ELISA試劑盒更加靈敏。
對於番茄潰瘍病，該試劑盒可以不經過DNA提取而以病原菌為模板直接 進行一步法PCR才企測，對純菌液Direct-PCR最低檢出限為2600個細菌/ml， 而Nested-PCR最低檢出限可達到13個細菌/ml;對種子提取液,Direct-PCR 不能檢出，而Nested-PCR最低4企出限可達到3xl05個細菌/ml。
圖1是試劑盒使用流程圖2是本試劑盒引物特異性的驗證和PCR條件優化； 其中M: 200bp DNA ladder;W:水。 圖3是純菌液的Nested-PCR檢測靈敏度結果；
其中1、2. 6 x I05cells/ml ; 2、 2. 6 x I04celIs/ml; 3: 2. 6 x 103cel 1 s /ml; 4、 2. 6 x 102cells/ml; 5、 26cells/ml; 6、 3cells/ml; M、 200bp DNA ladder ; W、水。
圖4是種子提取液的Nested-PCR檢測靈敏度結果；
其中1、 7X108cells/ml; 2、 6X 107cells/ml; 3、 3X 106cells/ml ; 4、 3X105cells/ml;5、 3X 104cells/ml;6、 3X 103cells/ml; 7、 3X102cells/ml;M、 200bp DNA ladder; W、水； T、番痴陽性質控物DM。
圖5對8種類非Cmm供試菌林的驗證檢測；
其中M: marker 1; C薩2-8:分別為丁香假單胞桿菌丁香致病型，番 茄細菌性潰痴病，番茄細菌性葉斑病菌，番茄細菌性裔痂病，十字花科蔬菜 黑腐致病變種，大豆細菌斑疹病，丁香假單胞桿菌丁香致病型，甜瓜細菌性 葉斑病菌。
圖6本發明實施例5出口番茄Cmm4企測；
其中M: marker,1-11出口番痴種子C醒的Nest-PClU企測。
圖7本發明實施例6田間樣品的Cmm檢測。
其中M:marker,1-4進口番茄種子CMM的Nest-PCR才全測。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋 本發明，並非用於限定本發明的範圍。
試驗例1:見圖2,用C醒-A和C畫-a—對引物對四個番茄潰瘍病菌基 因組DNA進行檢測，以測試試劑盒的有效性，結果發現，四個菌抹均擴增到 1487bp的目標條帶，但作為對照的水無條帶。
番茄潰瘍病病菌基因組DNA才是取方法如下
A. 取1. 5ml菌體培養物於一滅菌Ep管中，12000rpm(轉/每分鐘)離心1 分鐘，丟去上清夜，收集菌體。
B. 在A步驟中收集的菌體中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40mM 三羥甲基氨基曱烷-醋酸(Tris-醋酸)，20mM的醋酸鈉，在lmM乙二胺四乙酸
(EDTA) ，1%十二烷基石黃酸鈉(SDS) ，pH7.8的條件下混勻，置於37。C水浴l 小時製得；
C. 然後加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻後於13000rpm(轉/每分鐘) 離心15分鐘。D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
E. 加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8. 0)， -20度保存1 小時後，13000rpm(轉/每分鐘)離心15分鐘，棄上清液，沉澱用70°/。乙醇洗 2次；置於室溫乾燥後，溶於50ulTE溶液中，置4'C保存備用。
試驗例2:見圖3,純菌液的Nest-PCR檢測靈敏度結果，結果表明，該 試劑盒對於純菌液的檢測靈敏度為26cell/ml。
試驗例3:見圖4，對模擬種子帶菌的Nest-PCR檢測靈敏度，結果表明， 該試劑盒對種子提耳又液的Nest-PClU企測靈每丈度為3X105cells/ml，比酶聯
免疫高一個數量級。
試驗例4:見圖5，對8種類非C腿供試菌抹的驗證檢測 供試菌抹丁香假單胞桿菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv Syringae), 西瓜糹田菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrul 1 i )， 番痴糹田菌'l"生葉扭王病菌(Pseudomonas. syringae pv tomato), 番痴糹田菌4生皰 痂病(Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria )， 十字花科蔬菜黑腐致病 變種 (Xanthomonas campestris pv. campestris )， 大豆糹田菌斑滲病 (Xanthomonas campestris phaseoli), 丁香假單胞桿菌丁香致病型 (Pseudomonas syringae pv Syringae),甜瓜糹田菌性葉斑病菌(Pseudomonas syringae pv. lachrymans )。
PCR反應條件為94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸40秒， 35個循環。使用菌液為模板時，變性時間延長至20分鐘。擴增產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳及成像系統分析。
檢測結果表明，見圖5，以上八種供試菌，均未檢出目標條帶，說明試
劑盒有比較好的專一性。
實施例1: 一種檢測番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR的擴增引物， 第一對引物上遊長度為28bp，下遊長度為26bp的核苷酸序列如下 C薩-A: gtgatgtcagagcttgctctggcggatc;C應一a: gtacggctaccttgttacgacttagt;
第二對引物上遊長度為23bp，下遊長度為31bp的核苷酸序列如下 C顧一B: ccccgactctgggataactgcta ; C醒-b: cggttaggccactggcttcgggtgttaccga; 所述的檢測番茄潰痴病菌的巢式Nest-PCR的擴增引物，其擴增條件為 第一次第一組引物，其擴增條件為PCR循環增加20分鐘，M攝氏度 高溫裂解細菌；釋放DNA作為擴增模板；PCR反應條件為94。C變性30秒， 58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35個循環。
第二次第二組引物，其擴增條件為Mr變性30秒，WC退火30秒， 72。C延伸4G秒，35個循環。
經過兩次擴增，最終可得到分子量為1297bp的DNA產物。 實施例2: —種番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速一企測試劑盒，包括有 PCR緩衝液10 x ,氯化鎂25 mmol/L; dNTP 10畫1/L， Taq酶2 IU/ u L; 引物CMM-A和C畫-a各10 pmol/y L，引物CMM-B和C醒-b各10 pmo1/u L, 雙蒸水99% - 100%,檢測PCR管6個，陽性對照PCR管3個，陰性對照PCR 管3個，陽性對照1管，陰性對照1管。
實施例3: —種番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速^r測試劑盒，包括有 PCR緩衝液9x,氯化4美20 tnmol/L; dNTP 9 mmol/L, Taq酶2 IU/uL;引 物C畫-A和C薩-a各15 pmo1/ y L，引物C應-B和C醒-b各15 pmo1/ u L， 雙蒸水99% ~ 100%，檢測PCR管6個，陽性對照PCR管3個，陰性對照PCR 管3個，陽性對照1管，陰性對照1管。
實施例4:所述試劑盒的使用方法，見圖1，包括以下步驟 (1)待檢測材料的製備；按照每兩克種子加入2ml提取緩衝液的比例， 研磨種子至種皮破裂，靜置1小時後，用紗布過濾取上清，5000rpm(轉/每 分鐘)離心5分鐘，用100uL重懸沉澱直接作模板進行PCR擴增。抽提緩衝 液配方為Na2SO30. 13g/ml, PVP2g/ml，疊氮化納0. 02g/ml，雞蛋清蛋白與tween-20， PH 7. 4。抽提緩衝液使用量根據需要配置， 一般種子和緩衝液的 重量比約為1: 2-10。
(2) 第一對引物PCR擴增，PCR循環預變性增加到20分鐘，94攝氏度 高溫裂解細菌，釋放DNA作為擴增模板；PCR反應條件為94。C變性30秒， 58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35個循環。
(3) 第二對引物PCR擴增，以第一次擴增產物為模板；PCR反應條件為 預變性94。C1分鐘，94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸40秒，35 個循環。
(4) 1-1. 5%瓊脂糖電泳檢測目標條帶並成像分析；
(5) 對條帶進行分析得出結論。
實施例5:對出口的11批番茄種子進行驗證;險測
隨機抽取經過ELISA檢測的出口番茄種子23批各30克進行檢測，PCR 反應條件為94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸40秒。使用菌液 為模板時，變性時間延長至20分鐘。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳及成像 系統分析。結果表明，見圖6，所檢測的番茄種子均不攜帶Cmm，和ELISA 檢測結果完全符合。
實施例6:對進口的4批番茄種子進行驗證4企測
隨機抽取經過ELISA檢測的進口番茄種子12批各30克進行檢測，PCR 反應條件為94。C變性30秒，58。C退火30秒，7rc延伸^秒，35個循環。 使用菌液為模板時，變性時間延長至20分鐘。擴增產物用1. 5%瓊脂糖凝膠 電泳及成像系統分析。結果表明，見圖7,所檢測的番茄種子均不攜帶Cmm, 和ELISA檢測結果完全符合。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明 的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發 明的保護範圍之內。序列表
SEQUENCE LISTING
<110〉 甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心
<120〉 檢測番茄潰瘍病菌的巢式NEST-PCR的擴增引物及其檢測試劑盒和試劑盒使用方 法
1
<170〉 Patentln version 3.5 <210〉 1 〈211〉 1297 DNA
密執安棒形桿菌密執安亞種 <400〉 1
cggttaggcc汪ctggcttcg ggtgUaccg actttcatga cttgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcagcgttg ctgatctgcg attactagcg actccgactt 120
catgaggtcg agttgcag汪c ctcaatccg汪atctgagaccg gctttttggg attcgctcc汪 180
ccttacggta tcgcagccct Ugtaccggc cattgtagca tgcgtg^gc ccaagacata 240
aggggc"ga tgatttgacg tcatccccac cttcctccga gttgaccccg gcagtctcct 300
atgagttccc accattacgt gctggcaaca Ugaacgagg gttgcgctcg Ugcgggact 360
taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgta taccgacctt 420
gcggggcaca caUtctgca tgUtccggt atatgtcaag ccttggtaag gUcttcgcg 480
Ugcatcgaa tUatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
UtUgcctt gcggccgtac tccccaggcg gggwctUa tgcgUagct gcgacacgg^ 600
gaccgtggaa tggtccccac atctagttcc caacgtUac ggcatggact accagggtat 660
ctaatcctgt tcgctcccca tgctttcgct cctcagcgtc agttacggcc cagagatctg 720
ccttcgccat cggtgUcct cctgatatct gcgcattcca ccgctacacc aggaattcca 780
atctccccU ccgcactcU gtctgcccgt acccactgca gacccggiggt tgagcctcgg 840
gatttcacag cagacgcgac saaccgccta cgagctcttt acgccc^U attccggaca 900
acgcttgcac cctacgtatt accgcggctg ctggcacgU gttagccggt gcUUtctg 960caggtaccgtcactUcgcttcttccctacta3aagaggtttacaacccgaaggccgtca1020
tccctcacgcggcgttgctgC￡LtC￡LggCtttcgcccattgtgcaatattccccactgctg1080
cctcccgtaggagtctgggcCgtgtCtC3gtcccagtgtggccggtcaccctctcaggcc1140
ggctacccgtcgUggcttggtgagcc"tacctcaccaacaacctgataggccgcgagt1200
ccatccccaaccgaaat tctttccacgaccagacc"gcggccaatcgtcatatccggta1260
Uagctaccat UcUgC3gttatcccagagtcgggg129權利要求
1.一種檢測番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR的擴增引物，其特徵是第一對引物上遊長度為28bp，下遊長度為26bp的核苷酸序列如下CMM-Agtgatgtcagagcttgctctggcggatc；CMM-agtacggctaccttgttacgacttagt；第二對引物上遊長度為23bp，下遊長度為31bp的核苷酸序列如下CMM-Bccccgactctgggataactgcta；CMM-bcggttaggccactggcttcgggtgttaccga；經過兩次擴增，最終可得到分子量為1297bp的DNA產物。
2. 如權利要求1所述的檢測番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR的擴增引物，其特徵是擴增條件為 第一次第一組引物，其擴增條件為PCR循環增加20分鐘，94攝氏度高溫裂解細菌；釋放DNA作為擴增模板；PCR反應條件為94。C變性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸4G秒，35個循環； 第二次第二組引物，其擴增條件為9VC變性30秒，S8。C退火^秒，72 。C延伸40秒，35個循環。
3. —種番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速檢測試劑盒，其特徵是，包括有 PCR緩沖液9 x-10 x ，氯化鎂25—20 mmol/L; dNTP 9—10 mmol/L, Taq酶 2 IU/ ii L;引4勿CMM—A禾口 CMM—a各10—15 pmo1/ p L,引淨勿CMM—B詳口 CMM—b 各10-15 pmo1/ p L，雙蒸水99°/。 ~ 100%,才金測PCR管6個，陽性對照PCR 管3個，陰性對照PCR管3個，陽性對照1管，陰性對照1管。
4. 一種番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速檢測試劑盒的使用方法，其特徵是步驟為(1) 植物病原細菌的收集和培養；(2) 第一對引物PCR擴增；(3) 以第一次擴增結果為才莫;tl對第二對引物PCR擴增；(4) 1%-1. 5%瓊脂糖電泳檢測目標條帶並成像分析；(5) 對條帶進行分析得出結論。
5. 如權利要求4所述的番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR快速^r測試劑盒的使用方法，其特徵是，所述的植物病原細菌的收集和培養的具體步驟是(a) 製備抽提緩沖液:Na2SO30. 13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP ) 2g/ml， 疊氮化納0. 02g/ml，雞蛋清蛋白與吐溫-20 (tween-20)各0. 5ml/L， pH為7. 4;(b) 製備待檢測材料按照每兩克種子加入2ml提取緩沖液的比例， 研磨種子至種皮破裂，靜置1小時後，用紗布過濾取上清液，5000rpm(轉 /每分鐘)(轉/每分鐘)離心5分鐘，用lOOu L重懸沉澱直接作模板進行 PCR擴增。
6. —種番茄潰瘍病病菌的巢式Nest-PCR基因組DNA ^是:取方法如下A. 取1. 5ml菌體培養物於滅菌Ep管中，12000rpm離心1分鐘，除去上 清液，收集菌體；B. 在A步驟中收集的菌體中加入400ul裂解液，所述的裂解液由40mM 三羥曱基氨基曱烷-醋酸，20mM的醋酸鈉，在lmM乙二胺四乙酸(EDTA) ， ly。十二烷基石黃酸鈉，pH7. 8的條件下混勻，置於37。C水浴1小 時製得；C. 加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻後於13000rpm離心15分4中；D. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；E. 在上清液裡，加兩倍體積無水乙醇，上清液1/10體積的醋酸鉀 (3M,pH8. 0), -20。C保存l小時後，13000rpm(轉/每分鐘)離心15分鐘, 棄上清液，沉澱用70%乙醇洗2次；置於室溫乾燥後，溶於50ulTE溶液 中，置4。C保存備用。
全文摘要
本發明番茄細菌性潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp，michiganensis，Cmm)Nest-PCR檢測擴增引物及其試劑盒，屬於農作物病害防治和植物檢疫範疇，一種檢測番茄潰瘍病菌的巢式Nest-PCR的擴增引物，其主要特點是第一對引物上遊長度為28bp，下遊長度為26bp的核苷酸序列為CMM-Agtgatgtcagagcttgctctggcggatc；CMM-agtacggctaccttgttacgacttagt；第二對引物上遊長度為23bp，下遊長度為31bp的核苷酸序列為CMM-Bccccgactctgggataactgcta；CMM-bcggttaggccactggcttcgggtgttaccga；經過兩次擴增，最終可得到分子量為1297bp的DNA產物。試劑盒主要以兩次PCR放大病原菌基因信號，是一種靈敏度極高、檢測速度快、結果準確、使用方便的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101560570SQ20091014189
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月22日 優先權日2009年5月22日
發明者箐 劉 申請人:甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心