豬pCRTC3‑sgRNA表達載體的構建方法及用途與流程

2024-04-01 12:31:05 3

本發明涉及一種豬crtc3(pcrtc3)基因的px330-cas9-pcrtc3-sgrna(pcrtc3-sgrna)表達載體的構建方法及用途，屬於生物和現代農業
技術領域：
的應用技術。
背景技術：
：糖脂代謝是最主要的生命活動之一，直接影響著動物的脂肪沉積。在畜牧生產中，糖脂代謝直接影響著畜產品的產量和品質；同時，糖脂代謝也與人類健康息息相關。因此，探討動物糖脂代謝及其對脂肪沉積的影響及調控機制，對畜牧生產和人類健康都有非常重要的意義。研究證實，環磷酸腺苷(camp)信號通路直接調控能量平衡和養分分配。camp信號通路主要是通過camp應答元件結合蛋白(creb)及其調節轉錄輔激活因子(crtcs)發揮轉錄調節功能crtc3是crtcs家族的一員，在糖脂代謝過程中發揮著重要的功能。crtc3具有高度保守的n端creb結合域，在細胞核上與creb的bzip結構域結合併提高creb的活性。crtc3的亞細胞定位主要受磷酸化調控，去磷酸化介導的crtc3進核是上調creb靶基因的一個關鍵步驟。研究發現，crtc3去磷酸化促進肝細胞中糖原異生基因表達、增強葡萄糖生成。在肌肉中，crtc3的去磷酸化使其快速轉運進核，促進pgc1a基因表達，並影響肌肉內脂肪代謝和沉積。在脂肪組織中，sik2直接磷酸化crtc3，調控脂肪細胞中glut4表達和葡萄糖攝取；全身敲除crtc3的小鼠能量消耗增加、抑制肥胖。而且，crtc3可能與少年的肥胖相關。研究表明，stk11的底物如ampk能磷酸化crtc3，抑制creb的靶基因表達。最近我們研究發現，stk11與crtc3能直接互作，stk11缺失促進crtc3進核並影響脂肪細胞分化。提示：crtc3的亞細胞定位可能與脂肪細胞分化和脂質代謝密切相關(請見研究基礎)。但目前關於crtc3在脂質代謝方面的研究報導甚少，未見關於豬crtc3的研究報導。因此，開展pcrtc3在動物腸道功能、脂肪代謝和肌肉發育中的功能研究具有重要的意義。crispr/cas9基因編輯技術一種最新湧現的基因組編輯工具，能夠完成rna導向的dna識別與編輯，是一種較高效的基因定點修飾技術，具有速度快、效率高、簡單經濟等特點，在哺乳類細胞模型及動物模型構建的應用前景非常廣闊。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種pcrtc3-sgrna表達載體的構建方法，以及該pcrtc3-sgrna表達載體的用途。為了解決上述技術問題，本發明提供一種豬crtc3(pcrtc3)的pcrtc3-sgrna(px330-cas9-pcrtc3-sgrna)表達載體的構建方法，包括以下步驟：1)、根據載體的內切酶位點信息和pcrtc3序列(pcrtc3全長基因序列)得到4個靶序列，根據所述靶序列設計併合成4對sgrna引物；2)、pcrtc3的pcrtc3-sgrna表達載體的構建：bbsi酶切的px330-u6-chimeric-bb-cbh-hspcas9(縮寫為px330-cas9)載體與pcrtc3的sgrna引物退火後產物連接轉化，得到pcrtc3-sgrna表達載體的重組質粒。作為本發明的pcrtc3-sgrna表達載體的構建方法的改進，步驟1)為：根據pcrtc3全長基因序列，篩選並設計4對sgrna引物；該4對sgrna引物分別為：引物ⅰ：pcrtc3-sg1s:5′-caccggagaatgatgtccacgggga-3′pcrtc3-sg1as:5′-aaactccccgtggacatcattctcc-3′，引物ⅱ：pcrtc3-sg2s:5′-caccgggccaggagaaagtgtgagg-3′pcrtc3-sg2as:5′-aaaccctcacactttctcctggccc-3′，引物ⅲ：pcrtc3-sg3s:5′-caccggctgaggtctttgaacaggc-3′pcrtc3-sg3as:5′-aaacgcctgttcaaagacctcagcc-3′。引物ⅳ：pcrtc3-sg4s:5′-caccggtccttccccagcccgttga-3′pcrtc3-sg4as:5′-aaactcaacgggctggggaaggacc-3′。作為本發明的pcrtc3-sgrna表達載體的構建方法的進一步改進，步驟2)為：將px330-cas9質粒進行bbsi酶切後，與pcrtc3的sgrna引物退火後得到的pcrtc3的dna片段連接，連接產物採用熱激轉化大腸桿菌；得到pcrtc3的pcrtc3-sgrna表達載體的重組質粒。作為本發明的pcrtc3-sgrna表達載體的構建方法的進一步改進，將步驟2)所得的pcrtc3-sgrna表達載體進行鑑定：通過抗生素篩選，將陽性克隆採用pcr和測序鑑定；pcr反應的引物為特異性上遊引物和表達載體的本身引物：5′-aaaagcaccgactcggtgcc-3′；測序引物為：5′-gagggcctatttcccatgattcc-3′。本發明還同時提供了按照上述方法所得的pcrtc3-sgrna表達載體的用途：用於研究pcrtc3基因對豬腸道上皮細胞ipec-j2細胞緊密連接蛋白和糖脂代謝關鍵基因表達等產生的影響。作為本發明的pcrtc3-sgrna表達載體的用途的改進，包括以下步驟：(1)、將pcrtc3-sgrna表達載體的重組質粒(即，含pcrtc3-sgrna表達載體的大腸桿菌dh5α)擴培後，提取高純轉染級質粒；(2)、將含pcrtc3-sgrna表達載體的高純轉染級質粒轉染豬腸道上皮細胞等細胞，37℃，5％的co2中保溫4～6h後更換不含抗生素的培養基；(3)、轉染48小時後，分析pcrtc3-sgrna質粒對pcrtc3及緊密連接蛋白和糖脂代謝關鍵功能基因zo-1、atgl等表達的影響，研究pcrtc3的功能。本發明的pcrtc3-sgrna表達載體的構建方法及其用途，具有以下有益效果：本發明根據px330-cas9質粒信息和靶序列設計併合成了pcrtc3的4對sgrna引物，sgrna引物經退火後與bbsi酶切的px330-cas9載體連接得到pcrtc3-sgrna表達重組質粒，並轉化大腸桿菌dh5α，提取重組質粒並轉染豬ipec-j2細胞，用於研究pcrtc3對糖脂代謝及關鍵基因表達的影響。本發明是利用crispr/cas9技術，構建了pcrtc3的pcrtc3-sgrna表達載體，開拓了目前研究豬糖脂代謝調控和基因功能研究的新思路。此法所構建的pcrtc3-sgrna質粒，能夠特異、高效地敲除pcrtc3基因的表達，是研究pcrtc3功能的一種強有力的研究技術，為開展pcrtc3在豬腸道上皮細胞及糖脂代謝和組織發育中的功能研究具有重要的意義。附圖說明下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1是bbsi酶切的px330-cas9載體後的電泳檢測圖；圖1中：1---bbsi酶切後質粒，0---沒酶切的質粒對照，m---dnamarker；圖2是菌液pcr產物檢電泳撿測圖；圖2中：m---dnamarker；11～42---pcrtc3-sgrna1～4陽性克隆pcr產物電泳結果；圖3是pcrtc3-sgrna1測序及blast結果；圖4是pcrtc3-sgrna2測序及blast結果；圖5是pcrtc3-sgrna3測序及blast結果；圖6是pcrtc3-sgrna4測序及blast結果；圖7是pcrtc3-sg1-4對豬ipec-j2細胞中pcrtc3蛋白表達的影響圖；lipo---脂質體組，cas---脂質體+空質粒組，sg1-4---脂質體+pcrtc3-sg1-4；圖8是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中pcrtc3mrna表達的影響圖(*p<0.05,**p<0.01)；圖9是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中zo-1mrna表達的影響圖(*p<0.05,**p<0.01)；圖10是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中zo-2mrna表達的影響圖(*p<0.05,**p<0.01)；圖11是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中occludin-1mrna表達的影響圖(**p<0.01)；圖12是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中claudin-1mrna表達的影響圖(*p<0.05)；圖13是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中glut2mrna表達的影響圖；圖14是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中atglmrna表達的影響圖(*p<0.05)；圖15是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中hslmrna表達的影響圖(*p<0.05)；圖16是pcrtc3-sg1、pcrtc3-sg4對豬ipec-j2細胞中tnfαmrna表達的影響圖(**p<0.01)；上述圖8～圖16中的cas-vector代表空質粒對照組。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此。(一)、pcrtc3的cas9-sgrna表達載體的構建與鑑定1、靶序列選擇：根據pcrtc3全長基因序列，篩選設計pcrtc3的sgrna靶序列：sgrna1：5'-gagaatgatgtccacgggga-3'(seqidno：1)sgrna2：5'-ggccaggagaaagtgtgagg-3'(seqidno：2)sgrna3：5'-gctgaggtctttgaacaggc-3'(seqidno：3)sgrna4：5'-gtccttccccagcccgttga-3'(seqidno：4)。根據px330-cas9載體的信息和靶序列設計併合成sgrna引物，4對shrna引物分別為：引物ⅰ：pcrtc3-sg1s:5′-caccggagaatgatgtccacgggga-3′pcrtc3-sg1as:5′-aaactccccgtggacatcattctcc-3′，引物ⅱ：pcrtc3-sg2s:5′-caccgggccaggagaaagtgtgagg-3′pcrtc3-sg2as:5′-aaaccctcacactttctcctggccc-3′，引物ⅲ：pcrtc3-sg3s:5′-caccggctgaggtctttgaacaggc-3′pcrtc3-sg3as:5′-aaacgcctgttcaaagacctcagcc-3′。引物ⅳ：pcrtc3-sg4s:5′-caccggtccttccccagcccgttga-3′pcrtc3-sg4as:5′-aaactcaacgggctggggaaggacc-3′。2、引物退火：將合成好的引物稀釋後，按下列反應體系分別進行退火：退火條件為：95℃5min後，0.1℃/s冷卻至室溫，然後1:100稀釋退火產物。3、將含有px330-cas9質粒的大腸桿菌接種到lb培養基中，培養過夜，然後利用小批量質粒提取試劑盒提取質粒，測質粒濃度後將質粒進行bbsi酶切，酶切的反應體系為：反應條件為：37℃水浴2h，然後瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，並割膠回收線性化的載體。質粒提取及酶切結果如圖1所示，表明酶切成功。將步驟2所得的每一種退火產物分別進行以下步驟4和步驟5：4、插入片段(步驟2所得的退火產物)和載體片段(步驟3酶切後的載體)用t4dna連接酶連接16℃連接1h，連接產物轉化dh5α感受態細胞，37℃培養過夜。從而得到相應的4種sgrna表達載體的重組質粒。連接的反應體系為：5、經氨苄青黴素(ampicillin)抗性初步篩選後，挑取白色單菌落接種於3ml液體lb培養基中(含amp100ng/ml)，37℃振蕩培養12h，得菌液；以載體引物5′-aaaagcaccgactcggtgcc-3′和相對應的特異性上遊引物(上述步驟1所述)進行pcr鑑定。pcr反應體系如下表1所示：表1、pcr反應體系10×pcr擴增緩衝液2.5μldntp(10mm)1.0μl特異性引物(10μm)0.5μl載體引物(10μm)0.5μl菌液2.0μltaq酶(2u/μl)0.5μlddh2o18μltotal25μlpcr反應條件為：(1)94℃預變性4min；(2)94℃變性30sec，55℃30sec，72℃30sec，共35個循環；(3)72℃10min，4℃保存。陽性克隆菌液pcr鑑定結果表明，用鑑定載體引物(序列同上)和特異性pcrtc3引物(上述步驟1所述)pcr擴增的片段大小為100bp左右，與本實驗預期結果相符，確定為陽性克隆(圖2)。並將pcr鑑定為陽性克隆菌進一步進行測序鑑定插入片段的正確性，測序引物為5′-gagggcctatttcccatgattcc-3′。陽性克隆測序及序列比對鑑定結果表明，與插入的序列完全一致(圖3-圖6)，證明pcrtc3-sgrna表達質粒構建成功。這為進一步研究pcrtc3基因的功能及調控糖脂代謝的作用途徑打下基礎，也為通過crispr/cas9技術研究豬腸道功能及肌肉發育和脂肪沉積奠定基礎。(二)、有效pcrtc3-sgrna篩選1、利用lipofectaminetm2000介導將第(一)步構建篩選得到的pcrtc3-sgrna1-4的重組質粒和空載體對照分別轉染豬ipec-j2細胞。轉染前一天，胰酶消化細胞並計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度為70％～90％，培養基中含10％胎牛血清，不含抗生素；對於每孔細胞，使用50μl無血清dmem培養基稀釋3μgdna；對於每孔細胞，使用50μldmem培養基稀釋10μllipofectaminetm2000試劑。lipofectaminetm2000稀釋後，在5min內同稀釋的dna混合(保溫時間過長會降低活性)；混合稀釋的dna和稀釋的lipofectaminetm2000，在室溫保溫20-30min(複合物可以在室溫保持6h穩定)；直接將複合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混。如果在無血清條件下轉染，使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板，在加入複合物前移去生長培養基，替換無血清培養基；在37℃，5％的co2中保溫4～6h後更換不含抗生素的完全培養基；2、在細胞中加入質粒dna和lipofectaminetm2000複合物48h後，收集細胞，用於分析檢測各表達載體效果。3、敲除效果檢測：處理48小時後，用ripabuffer提取細胞中總蛋白，採用westernblot方法檢測pcrtc3蛋白表達水平，見圖7。結果表明，與脂質體組(lipo)和空質粒對照組(cas-vector組，lipo+cas-vector)相比，pcrtc3-sgrna1(sg1)和pcrtc3-sgrna4(sg4)效果較好，顯著降低pcrtc3蛋白表達。(三)、pcrtc3-sgrna對ipec-j2細胞中緊密連接蛋白zo-1、zo-2等表達的影響選取第(二)步篩選得到效果最好的pcrtc3-sgrna1(sg1)和pcrtc3-sgrna4(sg4)，檢測pcrtc3對緊密連接相關基因zo-1、zo-2、occludin-1、claudin-1等mrna表達的影響。將豬ipec-j2細胞傳代培養24h後，使其在轉染日密度達70-95％進行處理。轉染條件按3ug質粒/10ul脂質體的比例的進行轉染，實驗分成三個組：cas-vector對照組，轉染空載體，sg1組，轉染有效重組質粒pcrtc3-sgrna1；sg4組，轉染重組質粒pcrtc3-sgrna4，每個處理4個重複。轉染48h後收集ipec-j2細胞，real-time定量pcr檢測緊密連接相關基因zo-1等mrna表達水平。結果如圖8所示：轉染sg1和sg448h後，豬ipec-j2細胞中crtc3基因表達顯著低於cas-vector對照組。與cas-vector對照組相比，sg1組crtc3基因的mrna水平顯著降低了52.01％(p<0.01)，sg4組降低了47.89％(p<0.05)(圖8)。同時，研究結果還表明，轉染sg1和sg448h後，顯著降低了豬緊密連接相關蛋白zo-1等基因表達。與cas-vector對照組相比，sg1組zo-1、zo-2、occludin-1、claudin-1基因的mrna水平分別降低了57.88％(p<0.01，圖9)、40.19％(p<0.01，圖10)、51.59％(p<0.01，圖11)、35.70％(p<0.05，圖12)；sg4組zo-1、zo-2、occludin-1、claudin-1基因的mrna水平分別降低了53.38％(p<0.05，圖9)、50.52％(p<0.05，圖10)、39.97％(p＝0.09，圖11)、44.06％(p<0.05，圖12)。(四)、pcrtc3-sgrna對豬ipec-j2細胞中糖脂代謝相關基因表達的影響將豬ipec-j2細胞傳代培養24h後，使其在轉染日密度達70-95％進行處理。轉染條件按3ug質粒/10ul脂質體的比例的進行轉染，實驗分成三個組：cas-vector對照組，轉染空載體，sg1組，轉染有效重組質粒pcrtc3-sgrna1；sg4組，轉染重組質粒pcrtc3-sgrna4r，每個處理4個重複。轉染48h後收集ipec-j2細胞，real-time定量pcr檢測脂質代謝相關基因glut2、atgl、hsl等mrna表達水平。結果表明，sg1組和sg4組glut2基因表達與cas-vector對照組相比差異不顯著(圖13)。與cas-vector對照組相比，sg1組atgl和hsl基因mrna水平分別降低了38.31％(p<0.05，圖14)和41.39％(p<0.05，圖15)；sg4組atgl和hsl基因mrna水平與cas-vector對照組相比差異不顯著(圖14，圖15)。同時研究發現，sg1組tnfαmrna水平顯著低於對照組(p<0.01，圖16)。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護範圍。浙江大學豬pcrtc3-sgrna表達載體的構建方法及用途4120dna人工序列靶序列sgrna11gagaatgatgtccacgggga20220dna人工序列靶序列sgrna22ggccaggagaaagtgtgagg20320dna人工序列靶序列sgrna33gctgaggtctttgaacaggc20420dna人工序列靶序列sgrna44gtccttccccagcccgttga20當前第1頁12