雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒的製作方法

2024-04-01 07:03:05

專利名稱：：雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒，屬於獸用生物製品領域。
背景技術：
：在雞群中，不同病毒特點是免疫抑制性病毒感染已非常普遍。如I型雞馬立克氏病毒(Marek’sdisenseVirus,Serotyres,MDV)、禽網狀內皮增生病病毒(ReticuloendotheliosisVirus,REV)>Xl#^^ifil#(ChickinfectiousanemiaVirus,CAV)、禽呼腸孤病毒(AvianReovirus,ARV)、雞傳染性支氣管炎病毒(chickeninfectiousbronchitisvirus，IBV)N蛋白基因(IBV-N)。這些病單獨感染雛雞後，除在少數雞引起特定病理變化和症狀甚至死亡外，對多數雞往往只顯示輕微的致病作用，只呈現亞臨床感染。但是，如果有二種或二種以上病毒同時感染一隻雞時，它們在致病性上的協同作用可能使病程更為嚴重。在雞場遇到的一些發病死亡，往往是不同病毒和細菌共同感染的結果。因此，如果能對一隻雞同一份樣品對不同病毒感染作病原學檢測，將有助於闡明一個雞群發病的真正原因。本
發明內容本發明的目的在於提供一種能對一隻雞同一份樣品對不同病毒感染(I型雞馬立克氏病毒(MDV1)、禽網狀內皮增生病病毒(REV)、雞傳染性貧血病毒(CAV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)作病原學檢測，將有助於闡明一個雞群發病的真正原因的檢測試劑盒。本發明所涉及的試劑盒是分別利用MDV1特異性的pp38基因、CAV的Vp1基因、REV的pol基因和ARV的sigmac基因、IBV-N蛋白基因為模板，用特定引物通過PCR合成了經狄高辛(Digoxiaenin，DIG)標記的特異性核酸探針。通過斑點分子雜交，這些探針將可用於檢測病料樣品中某種病毒特異性核酸的存在，用於判定有無某種病毒感染。利用這一方法，在1張8X8cm大小的硝酸纖維膜或尼龍膜上可同時檢測約100份病料的核酸樣品。病料在組織樣品核酸提取後，斑點分子雜交可在2436小時內完成檢測並報告結果。如將同一樣品的核酸提取物分點在五張膜上，即可同時檢測四種不同的病毒。發明的詳細描述一、核酸探針及基因DNA對照品的製備1.MDV(l)MDV-pp38核酸探針標記1)以本發明人保存的MDV-pp38基因(姜世金，丁家波，孟珊珊等.型馬立克氏病病毒pp38和pp24基的真核表達.中國病毒學，2005年20卷4期)，基因大小為981bp作為模版用所設計併合成的一對引物(序列1、2)擴增出片段大小為641BP產物(序列3)，此段序列為I型MDV特異性的。所用引物(序列1、2)pp38-F:AGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAGpp38-R:ACCGACTAACATACCAGCGAAAAA2)探針標記反應程序(標記效果較好的程序)tableseeoriginaldocumentpage4*PCRDIG探針合成混合物為含有DIG-11-dUTP的dNTP的混和物，購自Roche公司PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸50sec，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。由此合成的為有DIG標記的641pb的探針DNA.。(2)MDV-PP38基因DNA(未標記對照)的PCR擴增tableseeoriginaldocumentpage4PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸50sec，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。由此合成如序列3所述核酸序列的為未標記的641pbDNA作為陽性對照或其他基因探針的陰性對照。(3)電泳結果見圖1，同樣是641bp，有DIG標記的探針DNA分子量大，電泳中變慢。(樣品各取2μ1，maker2000各5μ1和10μ1電泳)(4)定量結果探針標記量為50ng/μ1；共10管(1100μ1)，110μ1/管(5.5μg/管)；總量為55μg。2.REV(l)REV-pol核酸探針標記1)本發明人以本實驗室保存的REV-pol基因(王玉，崔治中，姜世金.網狀內皮組織增生症病毒中國分離株HA9901全基因組核苷酸序列的測定與分析，中國科學，C輯，2005,35:1_9.)，基因大小為3500bp作為模版用所設計併合成的一對引物(序列4、5)擴增出片段大小為775BP產物(序列6)，此段序列為REV特異性的。所用引物(序列4、5)REV-P0L-F4GGACTCAATTCCCGTATCAGAREV-P0L-R4:TCTTCCCAGCGACCTTTAC2)標記反應程序(標記效果較好)tableseeoriginaldocumentpage5PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，54°C退火40sec，72°C延伸lmin，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。(2)REV-po1基因DNA(未標記對照)的PCR擴增tableseeoriginaldocumentpage5PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸50sec，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。由此合成的為有未標記的641pbDNA作為陽性對照或其他基因探針的陰性對照。(3)電泳結果見圖2(樣品各取2μ1，maker2000各5μ1禾Π10μ1電泳)(4)定量結果探針標記量為50ng/yl；共9管(990μ1)，110μ1/管(5.5μg/管)；總量為49.5μg。3.CAV(I)CAV核酸探針標記1)本發明人以本實驗室保存的CAV-Vp1基因作為模版用(李延鵬，崔治中.一株雞傳染性貧血病毒野毒株致病性及全基因組序列比較.微生物學報，2007年47卷5期)，所設計併合成的一對引物(序列7、8)擴增出片段大小為842BP產物(序列9)，此段序列為CAV特異性的。所用引物(序列7、8)CAV-FlGCATTCCGAGTGGTTACTATTCCCAV-RlCGTCTTGCCATCTTACAGTCTTAT2)標記反應程序(標記效果較好)tableseeoriginaldocumentpage6PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸lmin，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。(2)CAV-Vp1基因DNA(未標記對照)的PCR擴增tableseeoriginaldocumentpage6PCR反應條件為95"C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72"C延伸50sec，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。由此合成的為有未標記的641pbDNA作為陽性對照或其他基因探針的陰性對照。(3)電泳結果見圖3(樣品各取1μl，maker2000各5μ1和10μ1電泳)(4)定量結果探針標記量為50ng/yl；共9管(990μ1)，110μ1/管(5.5μg/管)；總量為55μg。4.ARV(I)ARV核酸探針標記1)本發明人以本實驗室保存的ARV-sigmaC基因(孫愛軍，莊國慶，崔治中.禽呼腸孤病毒分離株ΡΙΟ、P17、δ3蛋白基因表達及抗血清的製備；病毒學報；2006年22卷6期)，基因大小為993bp作為模版用所設計併合成的一對引物擴增出片段大小為528bp產物(序列12)，此段序列為ARV特異性的。2)所用引物(序列10,11)ARV-sigmaC-F:ATCTATGAACGGCTGACCAATCTARV-sigmaC-RGTTAGTACCCCGTGCCATCCA3)標記反應程序(標記效果較好)tableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage7PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸40s，共30個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。(2)ARV-sigma基因DNA(未標記對照)的PCR擴增tableseeoriginaldocumentpage8PCR反應條件為95"C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72"C延伸50sec，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。由此合成的為有未標記的641pbDNA作為陽性對照或其他基因探針的陰性對照。(3)電泳結果見圖4(樣品各取2μ1，maker2000取5μ1電泳)。(4)定量結果探針標記量為40ng/l·!1；共10管(1100μ1)，110μ1/管(4.4μg/管)；總量為tableseeoriginaldocumentpage8(1)IBV-N核酸探針標記1)本發明人以本發明人保存的從IBV-H52株N蛋白基因(B.W.Calnek.DiseasesofPoutryTenthedition.IowaStateUniversityPressAmes,Iowa,USA,511-526),大小為1247bp作為模版用所設計併合成的一對引物擴增出片段大小為1229BP產物(序列15)，此段序列為IBV特異性的。所用引物(序列13、14)N-F:ATGGCAAGCGGTAAAGCN-R:ACTCAAAGTTCATTCTC2)標記反應程序(標記效果較好)tableseeoriginaldocumentpage8PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸40sec，共30個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。(2)IBV-N基因DNA(未標記對照)的PCR擴增tableseeoriginaldocumentpage9PCR反應條件為95°C預變性3min，95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸50sec，共32個循環，最後72°C延伸7min。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。由此合成的為有未標記的641pbDNA作為陽性對照或其他基因探針的陰性對照。(3)電泳結果見圖5(樣品各取2iil，maker2000取5yl電泳)。(4)定量結果探針標記量為40ng/iil；共10管(1100iil)，110ill/管(4.4iig/管)；總量為44ug0二、試劑盒的組成1.特異性核酸探針試劑管#1狄高辛標記的MDV-pp38特異性核酸探針，1Ug/1U1，10u1-50u1/瓶；試劑管#2狄高辛標記的CAV-vPl核酸探針，lug/lul,10u1-50yl/瓶;試劑管#3狄高辛標記REV-pol核酸探針，lug/lul,10u1-50yl/瓶;試劑管#4狄高辛標記的ARV-sigmac核酸探針，lug/lul,10u1-50yl/瓶;試劑管#5狄高辛標記的IBV-N核酸探針，lug/lul,10u1-50u1/瓶。2.未標記的基因DNA的對照品試劑管#6:PCR擴增的MDVrpp38基因DNA，10pg/yl，50yl/瓶；試劑管#7:PCR擴增的CAV-VPl基因DNA,10pg/yl，50yl/瓶；試劑管#8，PCR擴增的REV-pol基因DNA,10pg/yl，50yl/瓶；試劑管#9，PCR擴增的ARV-sigmac基因DNA,10pg/yl，50ill/瓶；試劑管#10,PCR擴增的IBV-N基因DNA,10pg/yl，50ill/瓶。3.硝酸纖維膜8X8cm,10片。4.其他試劑試劑管#11:封閉試劑(購自購自Roche公司，CatlogNo.1096176)lg/瓶，9瓶試劑管#12鹼基磷酸酶標記的抗Digoxiaenin抗體(購自Roche公司，，10yl/瓶；(anti-digoxigenin-APconjugate,Cat.No1093274)。試劑瓶#135-溴-4氯-3吲哚-磷酸溶液(5-bromo-4-chloro-3-inolyl-phosphate,BCPI)5ml,(250mg)試劑瓶#14氮藍四唑(4-Ntroblueterazoliumchloride,NBT)溶液5ml，(500mg)5.自備試劑和消耗品20XSSC溶液(3MNaCl，0.3M枸櫞酸三鈉，調整pH至7.0)，可塑封塑膠袋，尖頭一次性滴頭。6.需配備設備水浴鍋，壓膜機，5iil、100ia移液器。三、試劑盒的操作方法1.待檢測的樣品即懷疑有病毒感染的動物的不同組織或細胞，按常規的方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗裡奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學出版社，1996)提取其基因組DNA或RNA，即作為檢測的樣品。2.斑點分子雜交檢測步驟(1)一張適當大小的NC膜或尼龍膜，劃好格子，長和寬各8mm，做好標記；(2)吸取l.Oiil核酸樣品(約lyg待檢樣品或對照陽品的DNA)點於膜上各個格子的中央；(3)將NC膜或尼龍膜(點樣面朝上)放於已用變性液(0.5mol/LNaOH1.5mol/LNaCl)飽和的雙層濾紙上變性lOmin，再放於已用中和液(0.5mol/LTris-Cl；3.Omol/LNaClpH7.4)飽和的雙層濾紙上中和5min；(4)NC膜室溫乾燥30min，然後在80°C幹烤2h固定DNA。(5)將NC膜放於預雜交液(5XSSC,0.2%SDS，2%封閉試劑BlockingReagent,0.1%(ff/V)N-lauroylsarcosine)於6568°C反應2h，期間經常搖動NC膜容器；(6)將探針於沸水中變性lOmin，取出立即置於預先冰凍的無水乙醇中速凍5min；(防止探針變性後復性)(7)將變性的探針倒入預雜交液中，充分混勻即成雜交液，使NC膜在其中65-68°C雜交6h以上，最好過夜；(雜交後回收雜交液，可用三次)(8)將NC膜放於洗液I(2XSSC，0.1%SDS)中於室溫洗滌15min，2次；(9)將NC膜放於洗液II(0.5XSSC，0.1%SDS)中於68°C(視待檢樣品核酸與探針的同源性程度調正溫度，如6065°C，這非常重要)洗滌15min，2次；(10)置NC膜於緩衝液1(0.lmol/LTris-Cl,0.15mol/LNaCl,pH7.5)中洗lmin；(11)置NC膜於緩衝液II(緩衝液1+2%封閉試劑BlockingReagent)中反應30min，再用緩衝液I洗lmin；(12)在20ml緩衝液II中加入4u1抗狄高辛抗體的鹼性磷酸酶標記物(用之前離心5min，10000r/min)，置於適當大小(略大於NC膜，為了有效利用試劑)的容器中，將膜放於其中於37°C浸泡30min(不要超過這一時間，免得影響酶活性)；(13)緩衝液I洗滌；5minX5次；(14)置NC膜於緩衝液111(0.lmol/LTris-Cl,0.lmol/LNaCl，0.05mol/LMgCl2,pH9.5)中反應浸泡2min；(15)在適當大小(為了有效利用試劑)的容器中加入10ml緩衝液III和100u1(NBT和BCIP混合物)，將NC膜放入其中顯色一定時間(218小時)；(避光，不要搖動)(16)加入TE緩衝液(pH8.0)終止顯色反應。10圖1:MDV-pp38核酸探針標記電泳圖1陰性對照(去離子水)PCR結果2以MDV-pp38目的片段為模板的PCR結果(2ill)；3地高辛標記PCR結果(2yl)；Ml:5ulDNAMarker(DL2000)；M2:10u1DNAMarker(DL2000)。圖2:REV-pol核酸探針標記電泳圖1.以REV-pol目的片段為模板的PCR結果(2u1)；2.地高辛標記PCR結果(2iil)；Ml:5u1DNAMarker(DL2000)；M2:10u1DNAMarker(DL2000)；3陰性對照(去離子水)PCR結果。圖3:CAV-vpl核酸探針標記電泳圖1地高辛標記PCR結果(1u1)；2以CAV_vpl目的片段為模板的PCR結果(1ii1)；Ml5u1DNAMarker(DL2000)；M2:10u1DNAMarker(DL2000)；3陰性對照(去離子水)PCR結果。圖4:ARV-sigmac核酸探針標記電泳圖A:5ii1DNAMarker(DL2000)；B地高辛標記PCR結果(2yl);C:以ARV-sigmac目的片段為模板的PCR結果(2yl)；圖5IBV-N基因標記的探針核酸探針標記電泳圖1.5illDNAMarker(DL2000)；2.以IBV-N目的片段為模板的PCR結果(2y1)；3.地高辛標記PCR結果(2yl)。本發明的積極意義利用本發明所涉及的試劑盒，提取病料組織樣品的核酸後，進行斑點分子雜交可在2436小時內完成檢測並報告結果。如將同一樣品的核酸提取物分點點在五張膜上，即可同時檢測五種不同的病毒。在1張8X8cm大小的硝酸纖維膜或尼龍膜上可同時檢測約100份病料的核酸樣品。權利要求一種雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有1)分別經狄高辛標記的如序列3、序列6、序列9、序列12及序列15所述的核酸序列的MDV-pp-38核酸探針、REV-pol核酸探針、CAV-vp1核酸探針、ARV-Sigmac核酸探針和IBV-N核酸探針；2)未經標記的作為對照用如序列3、序列6、序列9、序列12及序列15所述的核酸序列的MDV-pp-38基因DNA、REV-pol基因DNA、CAV-vp1基因DNA、ARV-sigmac基因DNA和IBV-N基因DNA；3)硝酸纖維膜、封閉試劑、鹼基磷酸酶標記的抗狄高辛抗體、NCPI溶液、NBT溶液和20×SSC溶液。2.一種雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒製備方法，其特徵在於分別利用I型雞馬立克氏病毒特異性的PP38基因、禽網狀內皮增生病病毒的pol基因、雞傳染性貧血病毒的VP1基因、禽呼腸孤病毒的sigmac基因、雞傳染性支氣管炎病毒N蛋白基因為模板，用各自對應的特定引物通過PCR合成了經狄高辛標記的特異性核酸探針，通過斑點分子雜交，這些探針將可用於檢測病料樣品中某種病毒特異性核酸的存在。3.如權利要求2所述一種雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒的方法，其特徵在於在用PCR合成經狄高辛標記的MDV-pp-38核酸探針、REV-pol核酸探針、CAV-Vp1核酸探針、ARV-sigmac核酸探針和IBV-N核酸探針分別使用了序列1、2，序列4、5，序列7、8，序列10、11和序列3、14所述的核酸序列作為引物。4.如權利要求2所述一種雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒的方法，其特徵在於用PCR合成經狄高辛標記的MDV-pp-38基因DNA、REV-pol基因DNA、CAV-Vp1基因DNA、ARV-sigmac基因DNA禾ΠIBV-N基因DNA分別使用序列1、2，序列4、5，序列7、8，序列10、11和序列3、14所述的核酸序列作為引物。全文摘要本發明涉及一種雞多重病毒核酸探針斑點雜交檢測試劑盒。本發明所述的試劑盒分別利用I型雞馬立克氏病毒特異性的pp38基因、禽網狀內皮增生病病毒的pol基因、雞傳染性貧血病毒的vp1基因、禽呼腸孤病毒的sigmac基因、雞傳染性支氣管炎病毒N蛋白基因為模板，用特定引物通過PCR合成了經狄高辛標記的特異性核酸探針，通過斑點分子雜交，這些探針將可用於檢測病料樣品中某種病毒特異性核酸的存在。利用本發明所涉及的試劑盒，提取病料組織樣品的核酸後，進行斑點分子雜交可在24～36h內完成檢測並報告結果。如將同一樣品的核酸提取物分點點在五張膜上，即可同時檢測五種不同的病毒。文檔編號C12Q1/68GK101824488SQ20101014227公開日2010年9月8日申請日期2010年4月9日優先權日2010年4月9日發明者崔治中申請人:山東農業大學