一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法和應用與流程
2024-04-01 11:09:05 2
一、技術領域
本發明屬於黃酮化合物改性製備技術領域，提高化州橘紅有效成分生物利用度和藥效的生產工藝。
二、技術背景
化州橘紅又名「化州陳皮」，是芸香科植物，其未成熟的果皮具有化痰、理氣、健胃、消食等功能,用於治療胸中痰滯,咳嗽氣喘,嘔吐呃逆,飲食積滯等。研究表明，化橘紅中的有效成分為黃酮類化合物，雖然化橘紅是一種名貴的中藥材，但是起到主要藥效的成分在純水中的溶解度很低，生物利用度很低，大大降低了化橘紅的藥用價值，提高化橘紅有效成分生物利用度和藥效為本發明要解決的問題，
黃酮化合物主要存在於柑桔類果實中，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、陣血脂和膽固醇，增強毛細血管韌性、抗是自由基氧化，增強維生素c功效並具有美白皮膚、防止骨質疏鬆等作用，廣泛應用於醫藥、食品、日用化學品領域，是一種極具開發利用價值且經濟和社會效益良好的產品。化橘紅中的黃酮化合物易溶於吡啶、二甲基甲醯胺和氫氧化鈉溶液；微溶於甲醇、熱冰醋酸、乙醋、丙酣、氯仿和苯；在純水中，化橘紅中的黃酮化合物的溶解度僅為0.02％。由於在水中的溶解度極低，致使化橘紅中的黃酮化合物的開發利用受到極大限制，因此，必須進行改性處理，以增加其在水溶液中的溶解度，經過糖基化後，化橘紅中的黃酮化合物的溶解度提高到1.02％，進而提升穩定性、吸收性、藥效等應用領域。
現有化橘紅中的黃酮化合物糖基化的方法，如公開號cn102051397a，要求的粗化橘紅中的黃酮化合物的純度高(化橘紅中的黃酮化合物的純度90％以上)，而且轉化率較低(約50-80％，低於本發明的90％的轉化率)，而且有未參加糖基化的化橘紅中的黃酮化合物和殘餘的葡萄糖，大大降低了其藥用價值；如公開號cn104862362a，雖然化橘紅中的黃酮化合物糖基化的純度高，但是要求再製備液相的條件下來生產較高糖基化的化橘紅中的黃酮化合物，其設備生產成本高，單位時間的產率低，生產工藝複雜，不利於工業化生產，大大限制了在生物生產上的應用。
三、
技術實現要素：
本發明是基於化橘紅提取物有效成分黃酮化合物在純水中的溶解度低，限制化橘紅提取物在食品藥物領域的應用，提供了一種提高化橘紅提取物有效成分生物利用度和藥效的生產工藝。
本發明首先通過市售粗化橘紅提取物(50％)為原料，基於化橘紅中的黃酮化合物易溶於氫氧化鈉溶液(ph＝10-12)中，製備化橘紅中的黃酮化合物溶液，製備化橘紅中的黃酮化合物的超濾溶液，製備化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液，製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物溶液，製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉；製備化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液，製備高生物利用度化橘紅糖基化提取物超濾溶液，製備高生物利用度化橘紅糖基化提取物凍乾粉。
具體方法步驟如下：
1.一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法的生產工藝，其特徵在於操作步驟如下：
(1)製備化橘紅中黃酮化合物溶液
以市售質量濃度為50～70％的化橘紅中的黃酮化合物溶於氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液的摩爾濃度為0.1～1mol/l中，在30～40℃條件下處理30min，即製備出化橘紅中的黃酮化合物溶液。
(2)製備化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液
第(1)步完成後，先將第(1)步製備出的化橘紅中的黃酮化合物溶液泵入截留分子量為1000～2000da的聚醚碸膜超濾器中，控制超濾壓力為0.1～0.3mpa，進行超濾處理，直至超濾截留液體積降低至化橘紅中的黃酮化合物溶液體積的1/10～1/20時停止，分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾濾過液，即為化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液。超濾截留液可在(1)中再次利用。
(3)製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液
第(2)步完成後，在超濾濾過液加入糖苷轉移酶：環糊精的質量比為1:20～100投入到反應釜中，60～70℃恆溫攪拌15～20h，然後泵入4000～5000da的聚醚碸膜超濾器中，在溫度不高於40℃、流速不低於10ml/min、操作壓力0.55～1.0mpa的條件下超濾分離回收，截留液中主要為糖苷轉移酶，返回到糖苷轉移酶容器中重複利用。對收集的超濾液，泵入截留分子量為150～500da的納濾器中，控制納濾壓力為1～1.2mpa，進行納濾處理，直至納濾截留液體積降低至抽濾液體積的1/5～1/10時停止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾濾過液，含少量氫氧化鈉，送入生化處理池淨化達標後排放，對收集的納濾截留液，即為糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液，將截留液在溫度40～50℃、真空度0.09～0.lmpa的條件下減壓濃縮至膏狀，用於製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉，顏色為黃色。
所用糖苷轉移酶的活性不低於100u/mg的糖苷轉移酶，即環糊精葡萄糖苷轉移酶、麥芽糖基轉移酶、4-α-葡萄糖轉移酶、α-澱粉酶中的一種或一種以上混合物。
(4)製備糖基化化橘紅黃酮化合物凍乾粉
第(3)步完成後，將第(3)步收集的糖基化化橘紅中的黃酮化合物濃縮液置於-20～-40℃的低溫冰箱中預凍4～l0h，再送入冷凍乾燥機中，在40～60pa的絕對真空度、-50～-60℃溫度下，進行冷凍乾燥24～48h，就制出高生物利用度化橘紅糖基化提取物凍乾粉，其收得率為85.2～88.3％，平均分子量為1450da。
(5)高生物利用度化橘紅糖基化提取物凍乾粉溶出度研究
第(4)步完成後，將第(4)步收集的高生物利用度化橘紅糖基化提取物的凍乾粉，製成化橘紅糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮k30顆粒劑，然後測定化橘紅糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮k30顆粒劑的溶出速率。
(6)高生物利用度化橘紅糖基化提取物的藥代動力學研究
第(4)步完成後，將第(4)步收集的高生物利用度化橘紅糖基化提取物的凍乾粉，用pbs配成溶液，測定其在大鼠體內的代謝情況。
步驟1所述的一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法，其特徵在於：步驟1中所述的化橘紅中的黃酮化合物提取物為黃色粉末或膏狀，微溶於水，總化橘紅中的黃酮化合物含量50％以上。
步驟1所述的一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法，其特徵在於：步驟1中所述氫氧化鈉溶液ph＝10-12的溶液。
步驟1所述的一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法，其特徵在於：糖苷轉移酶：環糊精：化橘紅中的黃酮化合物的質量比為1:20～80：20～60。
步驟1所述的一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法，其特徵在於所用糖苷轉移酶的活性不低於100u/mg的糖苷轉移酶，所選的糖苷酶為環糊精葡萄糖苷轉移酶、麥芽糖基轉移酶、4-α-葡萄糖轉移酶、α-澱粉酶中的一種或一種以上混合物。
步驟1所述的一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法，其特徵在於：步驟1中所述的酶催化轉化反應的條件為反應溫度60～70℃恆溫攪拌15～20h，避光。
步驟1所述的一種高生物利用度化橘紅提取物的製備方法，其特徵在於：步驟1配製的化橘紅糖基化提取物的凍乾粉的顆粒劑的含量為150mg。
步驟1所述的一種高生物利用度化橘紅提取物的應用方法，其特徵在於：步驟1選定的大鼠重量在體重為250±20g，實驗步驟要求按照《2015中國藥典》。
本發明的糖基化化橘紅中的黃酮化合物在製備藥物製劑中的應用是將製得的化橘紅糖基化提取物與常規的藥劑輔料經常規方法製得；可根據需要製成適當的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、口服液等；通常以口服方式使用，也可以採用其他給藥方式。
本發明的糖基化化橘紅中的黃酮化合物在製備保健食品中的應用是將製得的化橘紅糖基化提取物採用常規的保健食品加工方法製備成保健食品。
與現有技術相比，本發明方法具有如下優點：(1)用市售的粗化橘紅中的黃酮化合物為原料，降低了原料生產成本，提高原料的利用度；(2)進行化橘紅中的黃酮化合物的酶催化反應，反應與分離於一體化，酶可以回收循環使用，提高了酶的使用效率，降低了生產成本，可以流水線循環產出，降低甚至消除了產物對酶的抑制作用、提高了催化反應的速度，縮短了生產周期；(3)本發明集成膜反應系統、冷凍乾燥技術製備高生物利用度的化橘紅中的黃酮化合物，適用於工業化生產；(4)本發明生產出糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉的生物利用度高，溶解度提高到1.02％，具有更高的醫療保健價值和更寬的實際應用領域。(5)本發明的化橘紅糖基化提取物凍乾粉在製備藥物製劑中的應用是將製得的化橘紅糖基化提取物凍乾粉與常規的藥劑輔料經常規方法製得；可根據需要製成適當的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸劑、口服液等；通常以口服方式使用，也可以採用其他給藥方式。(6)本發明的化橘紅糖基化提取物凍乾粉在製備保健食品中的應用是將製得的化橘紅糖基化提取物凍乾粉採用常規的保健食品加工方法製備成保健食品。
具體實施方式
下面結合具體實施方式，進一步說明本發明內容。
實施例1
一種以製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物的合成及純化方法，其特徵在於具體的方法步驟如下：
(1)製備化橘紅中的黃酮化合物溶液
以市售質量濃度為50％的化橘紅中的黃酮化合物溶於氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液的摩爾濃度為0.1～1mol/l中，在30～40℃條件下處理30min，即製備出化橘紅中的黃酮化合物溶液。
(2)製備化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液
第(1)步完成後，先將第(1)步製備出的化橘紅中的黃酮化合物溶液泵入截留分子量為1000～2000da的聚醚碸膜超濾器中，控制超濾壓力為0.1～0.3mpa，進行超濾處理，直至超濾截留液體積降低至化橘紅中的黃酮化合物溶液體積的1/10～1/20時停止，分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾濾過液，即為化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液。超濾截留液可在(1)中再次利用。
(3)製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液第(2)步完成後，在超濾濾過液加入糖苷轉移酶：環糊精的質量比為1:20～80投入到反應釜中，60℃恆溫攪拌15h，然後泵入4000～5000da的聚醚碸膜超濾器中，在溫度不高於40℃、流速不低於30ml/min、操作壓力0.55～0.65mpa的條件下超濾分離回收，截留液中主要為糖苷轉移酶，返回到糖苷轉移酶容器中重複利用。對收集的超濾液，泵入截留分子量為150～500da的納濾器中，控制納濾壓力為1.0～1.2mpa，進行納濾處理，直至納濾截留液體積降低至抽濾液體積的1/5～1/10時停止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾濾過液，含少量氫氧化鈉，送入生化處理池淨化達標後排放，對收集的納濾截留液，即為糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液，將截留液在溫度40～50℃、真空度0.09～0.lmpa的條件下減壓濃縮至膏狀，用於製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉，顏色為黃色。
(4)製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉
第(3)步完成後，將第(3)步收集的糖基化化橘紅中的黃酮化合物濃縮液置於-20℃的低溫冰箱中預凍4h，再送入冷凍乾燥機中，在40pa的絕對真空度、-50℃溫度下，進行冷凍乾燥24h，就制出糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉，其收得率為85.2％，平均分子量為1450da，密封、避光保存於-20℃冰箱中。
實施例2
一種以製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物的合成及純化方法，其特徵在於具體的方法步驟如下：
(1)製備化橘紅中的黃酮化合物溶液
以市售質量濃度為60％的化橘紅中的黃酮化合物溶於氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液的摩爾濃度為0.4～0.5mol/l中，在35℃條件下處理30min，即製備出化橘紅中的黃酮化合物溶液。
(2)製備化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液
第(1)步完成後，先將第(1)步製備出的化橘紅中的黃酮化合物溶液泵入截留分子量為1000～2000da的聚醚碸膜超濾器中，控制超濾壓力為0.2～0.4mpa，進行超濾處理，直至超濾截留液體積降低至化橘紅中的黃酮化合物溶液體積的1/10～1/20時停止，分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾濾過液，即為化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液。超濾截留液可在(1)中再次利用。
(3)製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液
第(2)步完成後，在超濾濾過液加入糖苷轉移酶：環糊精的質量比為1:20～80投入到反應釜中，60℃恆溫攪拌18h，然後泵入4000～5000da的聚醚碸膜超濾器中，在溫度不高於40℃、流速不低於20ml/min、操作壓力0.65～0.75mpa的條件下超濾分離回收，截留液中主要為糖苷轉移酶，返回到糖苷轉移酶容器中重複利用。對收集的超濾液，泵入截留分子量為150～500da的納濾器中，控制納濾壓力為1.0～1.2mpa，進行納濾處理，直至納濾截留液體積降低至抽濾液體積的1/5～1/10時停止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾濾過液，含少量氫氧化鈉，送入生化處理池淨化達標後排放，對收集的納濾截留液，即為糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液，將截留液在溫度40～50℃、真空度0.09～0.lmpa的條件下減壓濃縮至膏狀，用於製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉，顏色為黃色。
(4)製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉
第(3)步完成後，將第(3)步收集的糖基化化橘紅中的黃酮化合物濃縮液置於-40℃的低溫冰箱中預凍5h，再送入冷凍乾燥機中，在50pa的絕對真空度、-50℃溫度下，進行冷凍乾燥36h，就制出糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉，其收得率為86.7％，平均分子量為1450da。
實施例3
一種以製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物的合成及純化方法，其特徵在於具體的方法步驟如下：
(1)製備化橘紅中的黃酮化合物溶液
以市售質量濃度為70％的化橘紅中的黃酮化合物溶於氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液的摩爾濃度為0.6～1mol/l中，在30～40℃條件下處理30min，即製備出化橘紅中的黃酮化合物溶液。
(2)製備化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液
第(1)步完成後，先將第(1)步製備出的化橘紅中的黃酮化合物溶液泵入截留分子量為1000～2000da的聚醚碸膜超濾器中，控制超濾壓力為0.2～0.3mpa，進行超濾處理，直至超濾截留液體積降低至化橘紅中的黃酮化合物溶液體積的1/10～1/20時停止，分別收集超濾濾過液和超濾截留液，對收集的超濾濾過液，即為化橘紅中的黃酮化合物超濾溶液。超濾截留液可在(1)中再次利用。
(3)製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液
第(2)步完成後，在超濾濾過液加入糖苷轉移酶：環糊精的質量比為1:60投入到反應釜中，70℃恆溫攪拌30h，然後泵入4000～5000da的聚醚碸膜超濾器中，在溫度不高於40℃、流速不低於10ml/min、操作壓力0.85～1.0mpa的條件下超濾分離回收，截留液中主要為糖苷轉移酶，返回到糖苷轉移酶容器中重複利用。對收集的超濾液，泵入截留分子量為150～500da的納濾器中，控制納濾壓力為1.0～1.2mpa，進行納濾處理，直至納濾截留液體積降低至抽濾液體積的1/5～1/10時停止，分別收集納濾濾過液和納濾截留液，對收集的納濾濾過液，含少量氫氧化鈉，送入生化處理池淨化達標後排放，對收集的納濾截留液，即為糖基化化橘紅中的黃酮化合物反應液，將截留液在溫度40～50℃、真空度0.09～0.lmpa的條件下減壓濃縮至膏狀，用於製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉，顏色為黃色。
(4)製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉
第(3)步完成後，將第(3)步收集的糖基化化橘紅中的黃酮化合物濃縮液置於-40℃的低溫冰箱中預凍10h，再送入冷凍乾燥機中，在40pa的絕對真空度、-60℃溫度下，進行冷凍乾燥48h，就制出糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉，其收得率為88.3％，平均分子量為1450da，密封、避光保存於-20℃冰箱中。
實施例4
一種製備糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉固體顆粒劑的製備
將1.00g糖基化化橘紅黃酮(gn)凍乾粉溶解於30ml無水乙醇中，然後分別將2.0g、3.0g、6.0g、12.0gpvpk30溶解於l00ml無水乙醇中及1.00mg單硬脂酸甘油脂溶解於200ml無水乙醇，將混合載體材料溶液和糖基化化橘紅中的黃酮化合物凍乾粉溶液混合，然後劇烈攪拌使混勻，採用旋轉蒸發除去有機溶劑，待混合物裡粘稠狀態後，迅速冷卻固化，25℃真空乾燥箱中36h，研磨，過100目篩，即得固體顆粒gn-pvp(1:2)、gn-pvp(1:3)、gn-pvp(1:6)、gn-pvp(1:12)。
實施例5
一種製備高生物利用度化橘紅糖基化提取物顆粒劑溶出度的測定
1分析方法學的建立
檢測波長的確定：分別稱取化橘紅糖基化提取物凍乾粉和輔料適量，用甲醇配製成適宜濃度的溶液，並以甲醇為空白對照，於200～700nm範圍內進行掃描。結果表明在283nm處有化橘紅糖基化提取物的最大吸收峰；而輔料在此處對化橘紅糖基化提取物的測定均無幹擾。因此，選定283nm作為測定波長。標準曲線：精密稱取化橘紅糖基化提取物凍乾粉適量，用甲醇配製成系列濃度的溶液，於283nm處測定吸收度，以濃度(c)對吸收度(a)進行線性回歸。
2固體顆粒溶出度的測定方法
稱取化含有化橘紅黃酮化合物(主要成分為柚皮苷)83nmol(50mg)的固體顆粒，以及含有化橘紅糖基化提取物83nmol的固體顆粒樣品進行溶出度試驗。每組樣品平行測定3份，按中國藥典2015版第二法進行。溶出介質為900ml的蒸餾水，溫度為37±0.5℃，轉速為100±3rpm。分別在3、6、9、12、15min取樣5ml並補入相同體積的溶出介質，樣品經0.8μm微孔濾膜過濾。取續濾液稀釋後於283nm處測定吸收度，計算化橘紅糖基化提取物凍乾粉的溶出度。
3測定結果
標準曲線方程c＝0.0455a+0.021,r2＝0.9945，線性範圍：2.179～54.846μg/ml。本發明採用體外溶出度實驗以柚皮苷原料藥為對照，測定化橘紅糖基化提取物固體顆粒在體外的溶出情況，結果表明，化橘紅糖基化提取物固體顆粒在體外溶出情況良好。結果見表一
表一化橘紅糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮k30顆粒的溶出速率
從表一可以看出，原料藥柚皮苷在15min體外累計溶出的百分比為78.3％，而在本發明的糖基化化橘紅提取物在3-15min內達到標量的88.53％-99.04％，製成的糖基化後的溶出速度均柚皮苷。因此糖基化增加了藥物的體外釋放速度。
實施例6
化橘紅糖基化提取物在大鼠體內動力學研究
1藥品、試劑與儀器
動物：大鼠(spf級)，由中山大學實驗動物中心提供，合格證號：scxk粵2016-00250
儀器：lc-20a高效液相色譜儀(日本島津，sil-20a自動進樣器、lc-20ad四元梯度泵、spd-20av紫外檢測器)；laboratorycentrifuges3k18(sigma)；xk96-13快速渦旋混合器(浙江)；hws12型恆溫水浴鍋(上海一恆科學儀器有限公司)；bp2110分析天平(德國sartorius)；simplicity超純水系統(美國millipore)。
試藥：柚皮苷(sigma公司，含量＞95％)；化橘紅糖基化提取物凍乾粉原料藥及固體顆粒(實驗室製備，批號：141105)；柚皮素(sigma公司，含量＞98％)；補骨脂素(中國藥品生物製品檢定所，含量＞98％)；β-葡糖醛酸酶(sigma，具硫酸酯酶活性)；甲醇(b&g公司，色譜純)；冰醋酸(分析純)；去離子水(美國millipore)。
2柚皮素血藥濃度的測定
2.1標準溶液的配製
標準儲備液：稱取105℃乾燥至恆重的柚皮素(中國藥典2015，化橘紅中黃酮化合物的代謝產物主要為柚皮素)對照品各約10mg，精密稱定，分別置於l00ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，配製成濃度均為100μg/ml的母液；分別精密吸取母液適量，置於l0ml容量瓶中，用甲醇稀釋走容成系列梯度濃度袖皮素對照品溶液(濃度依次為50μg/ml,25μg/ml,12.5μg/ml,6.25μg/ml,3.125μg/ml)，作為標準儲備液，備用。
內標儲備液：精密稱取補骨脂素對照品10mg，用甲醇定容到100ml容量瓶中，配製成濃度為100μg/ml的母液，精密吸取母液，加甲醇稀釋製成10μg/ml濃度對照品溶液,備用。
2.2檢測條件(色譜條件)
色譜柱：dikmac18柱(5μm,250mm×4.6mm)；
流動相：甲醇：水(冰醋酸調ph3.0)＝53:47；
檢測波長：283nm,324nm；
流速：1.0ml/min；柱溫：室溫；進樣體積：50μl。
2.3血漿樣品的處理方法
取血漿樣品100μl，置1.5ml離心管中，加入50μl酶(β-葡萄糖醛酸酶，3000u/ml，具硫酸酯酶活性),37℃水浴2h，取出，加入內標溶液10μl，渦旋30s混合均勻，加入190μl甲醇沉澱蛋白，離心機上15000rpm離心12min，取上清液，50μl進樣。
3分析方法學考察
3.1色譜條件專屬性
空白血漿100μl3份分別加入10μl的100μg/ml化橘紅糖基化提取物凍乾粉、10μl的100μg/ml柚皮素、10μl的100μg/ml補骨脂素對照品，考察是否有幹擾。
3.2標準曲線與線性範圍
精密吸取空白血漿溶液六份，每份100μl，分別加入10μl內標溶液和指定的系列濃度梯度化橘紅糖基化提取物凍乾粉溶液各10μl，血漿中化橘紅糖基化提取物和柚皮素對照品濃度分別為：125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml。每個樣品進樣50μl。以柚皮苷、柚皮素與內標的峰面積比和化橘紅糖基化提取物、柚皮素血漿濃度進行線性回歸，即得標準曲線方程和線性範圍。
4藥代動力學實驗的給藥方設計及血樣採集
採用單次給藥，sd大鼠16隻，體重為250±20g，隨機分為2組。實驗前一天禁食12h，自由飲水，分別灌服柚皮苷原料與化橘紅糖基化提取物凍乾粉片體(相當於原料藥330mg/kg)，於預定的時間點(0.5,1,1.5,2,3,4,5,6,7,8,12h)大鼠眼眶取血0.5ml，置1.5ml經肝素處理的塑料離心管中，3000rpm/min離心10min；取上清血漿，置冰箱中-20℃保存，待分析。樣品處理後測定。結果以給藥時間為橫坐標，以柚皮素的血藥濃度為縱坐標繪製藥時曲線。
5樣品測定
採用建立的分析方法用來檢測大鼠血漿中的柚皮素的濃度，專屬性強，靈敏度較高，實驗結果見表二所示。柚皮苷普通製劑及化橘紅糖基化提取物固體顆粒口服後柚皮素血藥達峰時間約在4h，血藥峰值分別為8466.54±2069.91ng·ml-1及12839.75±2454.66ng·h·ml-1，計算出生物利用度分別為39028.23±4024.18ng·h·ml-1及57832.45±3934.63ng·h·ml-1。由實驗結果得知，固體顆粒體提高了化橘紅糖基化提取物的口服吸收以及生物利用度。藥物的口服生物利用度是由多種原因決定的，其中之一就是藥物溶解差，分散性不好而限制其吸收。化橘紅糖基化提取物通過提高其溶解度、分散度和溶出度而達到提高生物利用度的目的。表二大鼠灌胃給藥後血漿樣品測定結果(n＝8)