檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接elisa方法
2023-05-21 04:27:41 1
專利名稱：檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接elisa方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，屬於生物檢測技術領域。
背景技術：
大豆是動物養殖中應用最廣泛的一種優質植物蛋白源，不僅蛋白質含量高，價格低廉，而且必需胺基酸的絕對含量高，且胺基酸的組成比例平衡。但是，大豆中存在的致敏因子能引發人和動物，尤其是嬰幼兒和幼齡動物的過敏反應，從而導致腹瀉和消化吸收障礙，甚至死亡，造成了重大損失，限制了其在生產上的應用。研究表明，引起動物發生過敏反應的主要致敏因子是大豆抗原蛋白，而大豆球蛋白(glycinin)和β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)又是大豆抗原蛋白中的主要抗原成分。按離心沉降係數和免疫學方法又把大豆球蛋白和伴大豆球蛋白分別稱為IlS蛋白和7S蛋白，二者約佔到大豆蛋白 的70%。目前，大多研究使用膨化、熱乙醇變性法、熱加工法等處理方法，使致敏因子變性失活；或通過改善酶的作用條件，優化酶製劑的組合，利用外源酶對大豆抗原蛋白進行酶解從而去除抗原蛋白；或使用蛋白質糖基化工程對蛋白質表面的糖鏈進行改造，來改良蛋白質性質；或利用基因敲除的方法使某些基因無法表達，從而消除大豆中的致敏因子。這些方法不能完全去除致敏物質，而且去除條件要求高，成本增加，雖然有新品種培育出，但需要複雜的食品安全評估過程和農業推廣問題，導致其無法在生產實踐中得到廣泛應用。目前，國內外主要採用飼料中抗原檢測的方法來除去由大豆抗原蛋白引起的食源性過敏問題。這種方法只能作為一種預防手段，不能對已經過敏的動物進行有效的辨別和診斷，延誤病情，不能及時除去過敏原，導致動物病情加重，造成重大經濟損失。因此實現從動物體的過敏反應出發，探索出一種可以對大豆抗原蛋白過敏反應動物的鑑別和診斷方法具有現實意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種檢測仔豬大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，為人和動物大豆球蛋白過敏性疾病的防治和發病情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。本發明是通過以下技術方案來實現的。一種檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法是以經純化的大豆抗原蛋白作為抗原包被，用以檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法。進一步地,上述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白和β_伴大豆球蛋白。進一步地,上述純化步驟包括將大豆抗原蛋白溶於PH為7. 4的磷酸鹽緩衝液,再使用Sepharose CL-6B凝膠過濾，用磷酸鹽緩衝液洗脫得到的洗脫液經透析，冷凍乾燥得大豆抗原蛋白，儲存於_20°C作為抗原備用。
進一步地，上述間接ELISA方法包括包被抗原、封閉、加樣、加酶標二抗、顯色、終止。進一步地，上述間接ELISA方法的工作條件為抗原包被為2. (TlO. OPg /L，封閉液為1%BSA，樣品稀釋濃度為I :40(Tl :3200，酶標二抗稀釋濃度為1:100(Tl: 3000，顯色液AB比例為等比，陰陽臨界值為O. 225 O. 032。本發明的有益效 果建立的檢測仔豬大豆球蛋白抗體的間接ELISA方法，該方法對大豆抗原蛋白引起的人和動物過敏性疾病有較強的敏感性和特異性，為這類疾病的診斷提供依據，有助於解決我國動物的大豆蛋白源性食物過敏問題，為這類疾病的疾病學調查提供有效的技術手段，為人和動物大豆抗原蛋白過敏性疾病的防治和發病情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。
圖I為大豆球蛋白(11S蛋白)的蛋白洗脫峰數據說明圖；圖2為大豆球蛋白(11S蛋白)的電泳分析數據說明圖；圖3為β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的蛋白洗脫峰數據說明圖；圖4為β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的電泳分析數據說明圖。
具體實施例方式下面根據實施例和
對本發明作進一步詳細說明。實施案例I :本發明提供的間接ELISA方法，其中，以大豆球蛋白(11S蛋白)為檢測抗原
(I)抗原的純化及純度分析純化將IlS蛋白溶於pH為7. 4的磷酸鹽緩衝液，Sepharose CL-6B凝膠過濾(1.6X120 cm層析柱)，用磷酸鹽緩衝液洗脫得到的洗脫液經透析，冷凍乾燥得大豆球蛋白(即IlS蛋白)，儲存於_20°C作為抗原備用。其中圖I為大豆球蛋白(HS蛋白)的蛋白洗脫峰數據說明圖，純化數據可參照圖I。純度分析將膠板上好並安裝在電泳槽中，取10 μ 標準(樣品)蛋白溶解液於EP管內，再加入10 μι 2倍樣品緩衝液，上樣量為10 μ 。加樣前，樣品在沸水中加熱T5min，冷卻後備用。根據目的抗原蛋白亞基的分子量大小，選擇分離膠和濃縮膠的濃度為5%的凝膠。將膠液沿著玻璃板倒入兩板之間的夾縫至離上板口約I. 50 cm處，在分離膠溶液上覆蓋一層廣5 _的水層用於消泡和密封。靜止放置(45飛O min)待其凝固。蒸餾水衝洗膠面，用吸水紙將膠面吸乾。倒好膠後，插好梳子，使梳子孔中無氣泡。上樣及電泳上樣量分別為10 PL，濃縮膠的電壓為55 80 V，電流為16 18 mA，電泳時間1.5 h，分離膠的電壓為100^125 V，電流為3(T35 mA，電泳時間4 h。染色和脫色電泳結束後，撤下膠板切去濃縮膠，輕輕揭下凝膠；37 1以上溫度，在固定液漂洗20 min;棄去固定液，放入適量新鮮染色液染色45 min。傾去染色液，用自來水漂洗直到水流無顏色為止，倒入適量脫色液進行脫色，每隔I. 5 h換一次脫色液,直至蛋白亞基條帶顯色清晰。用Quantity One軟體,用光密度法分析SDS電泳圖片，並計算其純度為90.6%。其中，圖2為大豆球蛋白(11S蛋白)的電泳分析數據說明圖，純化分析數據可參照圖2。本發明的大豆抗原蛋白過敏疾病陽性血清和陰性血清，是通過如下方式獲得的(I)陽性血清以中國農業大學食品科學與營養工程學院的郭順堂教授惠贈(專利號No.20041002958914)的IlS蛋白，仔豬21-28日齡和32-35日齡時，用IlS蛋白以4%的比例加入基礎日糧中。並28、36日齡做皮膚試敏試驗，皮內注射O. I mL 5 mg · mPllS蛋白溶液和生理鹽水,在注射30 min後，通過紅斑直徑大小來評價大豆抗原蛋白的致敏性，然後對仔豬進行空腹米血；實行前腔靜脈米血5ml,樣品米完後靜置2 h,然後尚心(3000 r/min, 10min )，分離血清。為陽性血清，備用。(2)陰性血清與陽性血清仔豬做對照的皮膚試敏試驗中無過敏反應的仔豬的血清為陰性血清。 本發明的仔豬大豆球蛋白抗體間接ELISA檢測方法的最適抗原抗體濃度、酶標二抗濃度及臨界值，是通過如下方式或得的( I)最適抗原、酶標二抗的濃度以棋盤滴定法測定。以純化的IlS蛋白作為包被抗原，用pH9. 6、O. 05 mol/L碳酸鹽緩衝液包被抗原，抗原包被濃度為10. 0,5. 0,4. 0,3. 0,2. O、I. 0,0. 5,0. 25μδ /L,作為包被液，在96孔Costar酶標板的1_8行分別加入各濃度包被液300μ1，37°C孵育2h取出，倒掉包被液，用PBST液(O. 15 mol/L,pH 7. 4)洗板4次，拍幹；用1%BSA的包被緩衝液作為封閉液封閉Ih ;用PBST液洗板4次，拍幹；分別在各酶標板1-3列加入1:1000稀釋的酶標二抗 100 μ ，4-6、7-9、10-12 列各孔分別入稀釋度為 1:1500、1:2000、1:3000 酶標二抗 100μ ，與抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍幹；每孔加入 οομ 顯色液，避光37°C反應15min，取出後每孔加入50μ1終止液2mol/L H2SO4溶液，用酶標儀測定吸光值0D450。若待測孔OD值大於O. I小於O. 2，待測孔OD值在O. 1-0. 2之間最多的兩列即定為抗原最佳包被濃度和酶標二抗最佳稀釋濃度，最大值為O. 199，最小值為O. 104，所以抗原抗體最佳稀釋濃度為抗原2. θμδ /L, 二抗稀釋倍數為1:1500。(2)陽性血清稀釋倍數以純化的IlS蛋白作為包被抗原，按2.(^g /L進行包被，在96孔Costar酶標板的每孔加入300μ1包被液，37°C孵育2h取出，倒掉包被液，用PBST液洗板4次，拍幹；用1%BSA的包被緩衝液作為封閉液封閉Ih ;用PBST液洗板4次，拍幹；在酶標板I列各孔加入1:100稀釋的血清100 μ ,2-12列各孔依次加入稀釋度為1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800 血清 100 μ , 12 列最後 4孔留作對照，Ε12和F12孔加入100μυ%牛血清白蛋白溶液作陰性對照，G12孔加入致敏組動物未稀釋血清做陽性對照，Η12不加任何血清留作空白對照，與抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍幹；用PBST液洗板4次，拍幹；每孔加入稀釋倍數為1:1500的酶標二抗(羊抗豬辣根過氧化物酶IgG) 100 μ ,37 °C孵育。倒掉酶標二抗後洗板4次，拍幹；每孔加入ΙΟΟμΙ顯色液，避光37°C反應15 min，取出後每孔加入50μ1終止液2mol/L H2SO4溶液，用酶標儀測定吸光值0D450。以陰性孔OD值為標準，若待測孔OD值超過0. 2，約為I左右且待測孔的OD值與陰性孔OD值的比值大於2. I時，待測孔的稀釋倍數即定為血清抗體稀釋倍數。結果所得陽性血清OD值為1.026 1)，所以血清最佳稀釋倍數為1:1600
(3)顯色液的配方顯色液包括A液和B液，A液配方為每500ml雙蒸水中加入醋酸鈉13. 6g，檸檬酸I. 6g, 30%雙氧水O. 3ml ；B液配方為每500ml雙蒸水中加入EDTAO. 2g、檸檬酸O. 95g、甘油50ml、溶於3ml雙蒸水的TMB O. 15g;使用時，按A和B等比體積混合使用。(4)重複性檢驗對大豆球蛋白的5份血清樣品進行間接ELISA檢測，大豆球蛋白批內的變異係數分別為4. 83%,8. 80%,7. 55%,6. 69%,4. 94% ;批間的變異係數分別為5. 02%、7. 30%,9. 27%,8. 73%,6. 14%，均小於10%，說明本試驗建立的間接ELISA檢測方法具有較好的重複性。(5)臨界值取6份陰性血清稀釋至1600倍時，IlS蛋白的OD值平均值(OD)為O. 148，標準誤差(SE)為O. 027，臨界值0D+3SE=0. 228。血清樣品的P/N彡2. 1，且OD彡O. 228即可判為陽性OD ( O. 201為陰性，其餘判為可疑。(6)交叉性試驗各種條件都確定後，進行IlS蛋白和7S蛋白的交叉性試驗，經酶 標儀測定，Iis蛋白的交叉率為15%。因此說明IlS蛋白抗血清特異性較高。實施案例2 本發明提供的間接ELISA方法，其中，以β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)為檢測抗原 (I)抗原的純化及純度分析純化將7S蛋白溶於pH為7. 4的磷酸鹽緩衝液，Sepharose CL-6B凝膠過濾(1.6X120 cm層析柱)，用磷酸鹽緩衝液洗脫得到的洗脫液經透析，冷凍乾燥得β-伴大豆球蛋白(即7S蛋白)，儲存於-20°C作為抗原備用。其中，圖3為β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的蛋白洗脫峰數據說明圖，純化數據可參照圖3。純度分析將膠板上好並安裝在電泳槽中，取10 μ 標準(樣品)蛋白溶解液於EP管內，再加入10 μι 2倍樣品緩衝液，上樣量為10 μ 。加樣前，樣品在沸水中加熱T5min，冷卻後備用。根據目的抗原蛋白亞基的分子量大小，選擇分離膠和濃縮膠的濃度為5%的凝膠。將膠液沿著玻璃板倒入兩板之間的夾縫至離上板口約I. 50 cm處，在分離膠溶液上覆蓋一層廣5 _的水層用於消泡和密封。靜止放置(45飛O min)待其凝固。蒸餾水衝洗膠面，用吸水紙將膠面吸乾。倒好膠後，插好梳子，使梳子孔中無氣泡。上樣及電泳上樣量分別為10 PL，濃縮膠的電壓為55 80 V，電流為16 18 mA，電泳時間1.5 h，分離膠的電壓為100^125 V，電流為3(T35 mA，電泳時間4 h。染色和脫色電泳結束後，撤下膠板切去濃縮膠，輕輕揭下凝膠；37 1以上溫度，在固定液漂洗20 min;棄去固定液，放入適量新鮮染色液染色45 min。傾去染色液，用自來水漂洗直到水流無顏色為止，倒入適量脫色液進行脫色，每隔I. 5 h換一次脫色液,直至蛋白亞基條帶顯色清晰。用Quantity One軟體,用光密度法分析SDS電泳圖片，並計算其純度為90.0%。其中，圖4為β_伴大豆球蛋白(7S蛋白)的電泳分析數據說明圖，純化分析數據可參照圖4。本發明的大豆抗原蛋白過敏疾病陽性血清和陰性血清，是通過如下方式獲得的(I)陽性血清以中國農業大學食品科學與營養工程學院的郭順堂教授惠贈(專利號Νο.20041002958914)的7S蛋白，仔豬21-28日齡和32-35日齡時，用7S蛋白以4%的比例加入基礎日糧中。並28、36日齡做皮膚試敏試驗，皮內注射O. I mL 5 mg-mLlS蛋白溶液和生理鹽水，在注射30 min後，通過紅斑直徑大小來評價大豆抗原蛋白的致敏性，然後對仔豬進行空腹米血；實行前腔靜脈米血5ml,樣品米完後靜置2 h,然後尚心(3000 r/min, 10 min),分離血清。為陽性血清，備用。(2)陰性血清與陽性血清仔豬做對照的皮膚試敏試驗中無過敏反應的仔豬的血清為陰性血清。本發明的仔豬β -伴大豆球蛋白抗體間接ELISA檢測方法的最適抗原抗體濃度、酶標二抗濃度及臨界值，是通過如下方式或得的( I)最適抗原、酶標二抗的濃度以棋盤滴定法測定。以純化的7S蛋白作為包被抗原，用ρΗ9. 6、O. 05 mol/L碳酸鹽緩衝液包被抗原，抗原包被濃度為5. 0、4. 0、3. 0、2. 5、2. 0、1.0、0. 5 >0. 25μδ /L,作為包被液，在96孔Costar酶標板的1_8行分別加入各濃度包被液300μ1，37°C孵育2h取出，倒 掉包被液，用PBST液(O. 15 mol/L,pH 7. 4)洗板4次，拍幹；用1%BSA的包被緩衝液作為封閉液封閉Ih ;用PBST液洗板4次，拍幹；分別在各酶標板1-2列加入1:1000稀釋的酶標二抗 100 μ ，3-4、5-6、7-8 列各孔分別入稀釋度為 1:1500、1:2000、1:3000 酶標二抗 100 μ ,與抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍幹；每孔加入ΙΟΟμΙ顯色液，避光37°C反應15 min,取出後每孔加入50μ1終止液2mol/L H2SO4溶液，用酶標儀測定吸光值0D450。若待測孔OD值大於O. I小於O. 2，待測孔OD值在O. 1-0. 2之間最多的兩列即定為抗原最佳包被濃度和酶標二抗最佳稀釋濃度，最大值為O. 187，最小值為O. 112，所以抗原抗體最佳稀釋濃度為抗原2. 5μg /L，二抗稀釋倍數為1:1500。(2)陽性血清稀釋倍數以純化的7S蛋白作為包被抗原，按2. 5Pg /L進行包被，在96孔Costar酶標板的每孔加入300μ1包被液，37°C孵育2h取出，倒掉包被液，用PBST液洗板4次，拍幹；用1%BSA的包被緩衝液作為封閉液封閉Ih ;用PBST液洗板4次，拍幹；在酶標板I列各孔加入1:100稀釋的血清100 μ ,2-12列各孔依次加入稀釋度為1:200,1:400,1:800,1:1600,1:3200,1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800 血清 100 μ , 12 列最後 4 孔留作對照，Ε12和F12孔加入100μυ%牛血清白蛋白溶液作陰性對照，G12孔加入致敏組動物未稀釋血清做陽性對照，Η12不加任何血清留作空白對照，與抗原作用lh，用PBST液洗板4次，拍幹；用PBST液洗板4次，拍幹；每孔加入稀釋倍數為1:1500的酶標二抗(羊抗豬辣根過氧化物酶IgG) 100 μ ,37 °C孵育。倒掉酶標二抗後洗板4次，拍幹；每孔加入ΙΟΟμΙ顯色液，避光37V反應15 min，取出後每孔加入50μ1終止液2mol/L H2SO4溶液，用酶標儀測定吸光值0D450。以陰性孔OD值為標準，若待測孔OD值超過0. 2，約為I左右且待測孔的OD值與陰性孔OD值的比值大於2. I時，待測孔的稀釋倍數即定為血清抗體稀釋倍數。結果所得陽性血清OD值為1.053 1)，所以血清最佳稀釋倍數為1:1600(3)顯色液的配方顯色液包括A液和B液，A液配方為每500ml雙蒸水中加入醋酸鈉13. 6g，檸檬酸I. 6g, 30%雙氧水O. 3ml ；B液配方為每500ml雙蒸水中加入EDTAO. 2g、檸檬酸O. 95g、甘油50ml、溶於3ml雙蒸水的TMB 0. 15g;使用時，按A和B等比體積混合使用。(4)重複性檢驗對β -伴大豆球蛋白的5份血清樣品進行間接ELISA檢測，β -伴大豆球蛋白批內的變異係數分別為9. 30%,9. 10%、6· 86%,6. 42%,6. 06% ;批間的變異係數分別為9. 74%，7. 03%,5. 26%,7. 25%,4. 84%，均小於10%,說明本試驗建立的間接ELISA檢測方法具有較好的重複性。(5)臨界值取6份陰性血清稀釋至1600倍時，β -伴大豆球蛋白的OD值平均值(OD)為O. 151，標準誤差(SE)為O. 026，臨界值0D+3SE=0. 230。血清樣品的P/N彡2. 1，且OD彡O. 230即可判為陽性，OD ( O. 204為陰性，其餘則判為可疑。(6)交叉性試驗各種條件都確定後，進行大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的交叉性試驗，經酶標儀測定，伴大豆球蛋白交叉率為35%。
上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在於讓熟悉此領域技術的人士能夠了解本發明內容並加以實施，並不能以此限制本發明的保護範圍。凡根據本發明精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護範圍內。
權利要求
1.一種檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，其特徵在於是以經純化的大豆抗原蛋白作為抗原包被，用以檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法。
2.根據權利要求I所述的檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，其特徵在於，所述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白、伴大豆球蛋白。
3.根據權利要求I或2所述的檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，其特徵在於，所述純化步驟包括將大豆抗原蛋白溶於PH為7. 4的磷酸鹽緩衝液，再使用Sepharose CL-6B凝膠過濾，用磷酸鹽緩衝液洗脫得到的洗脫液經透析，冷凍乾燥得大豆抗原蛋白，儲存於_20°C作為抗原備用。
4.根據權利要求I或2所述的檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，其特徵在於，所述間接ELISA方法包括包被抗原、封閉、加樣、加酶標二抗、顯色、終止。
5.根據權利要求4所述的檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法，其特徵在於，所述間接ELISA方法的工作條件為抗原包被為2. (ΓΙΟ. θμδ /L，封閉液為1%BSA，樣品稀釋濃度為I :400 1 :3200，酶標二抗稀釋濃度為1:1000 1:2500，顯色液AB比例為等比，陰陽臨界值為O. 225 O. 032。
全文摘要
本發明公開了一種檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法是以經純化的大豆抗原蛋白作為抗原包被，用以檢測大豆抗原蛋白血清抗體的間接ELISA方法。上述大豆抗原蛋白包括大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白。本發明的優點在於該方法對大豆抗原蛋白引起的人和動物過敏性疾病有較強的敏感性和特異性，為這類疾病的診斷提供依據，有助於解決我國動物的大豆蛋白源性食物過敏問題，為這類疾病的疾病學調查提供有效的技術手段，為人和動物大豆抗原蛋白過敏性疾病的防治和發病情況的掌握提供一種快速、簡便的檢測方法。
文檔編號G01N33/68GK102879585SQ201210372059
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者吳金節, 王希春, 寇亞楠, 孫志闊, 徐述亮, 陳亮, 王勇, 馬良友 申請人:安徽農業大學