抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的Kringle變體蛋白製備方法及應用的製作方法
2023-05-12 02:54:51
專利名稱：抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的Kringle變體蛋白製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的製備和應用。
背景技術：
在臨床上，人們發現任何實體瘤生長到一定的程度都會有腫瘤血管系統的形成。基於這種臨床現象，Judah Folkman在1971年提出「腫瘤生長和轉移依賴於血管生成作用」的理論。此後，隨著一些刺激血管生成和抑制血管生成分子的發現，以及它們與腫瘤發生之間關係的闡明，為該理論提供了有力證據。
腫瘤生長可分為兩個階段在腫瘤形成的早期並沒有腫瘤血管出現，這一時期被稱為無血管期，此時腫瘤大小不超過數個立方毫米，腫瘤生長緩慢，呈線性生長；當腫瘤形成了自身的血管系統，即進入了血管期，這時腫瘤組織生長迅速。呈指數性生長，並可能發生腫瘤轉移。腫瘤組織處的血管為腫瘤的生長和轉移提供了三方面作用①血管為腫瘤細胞提供了充分的氧氣和營養，清除代謝產物②血管內皮細胞可表達多種生長因子，刺激腫瘤細胞的迅速增殖；③腫瘤組織處血管缺乏外周細胞，基底膜不完整，腫瘤細胞易進入血液循環，這就為腫瘤的轉移提供了條件。
腫瘤從無血管的緩慢生長階段轉入有血管的快速生長階段，血管生成在這個轉變過程中發揮了關鍵作用。所謂血管生成，是指從已存在的血管床中產生新生血管系統。這是一個多步驟的複雜過程，其中包括①內皮細胞增殖、遷移和分化；②細胞外基質降解；③管腔形成；④新生毛細血管形成。這個過程受控於多種血管生成調節因子。在正常生理條件下，血管生成被嚴格控制於某些特定的生理過程，如傷口癒合、胚胎發育、器官形成、生育過程和組織再生等。在病理條件下，血管生成作用失控，導致多種疾病的發生，如糖尿性視網膜病(diabeticretinopathy)、組織和器官畸變、心血管疾病和腫瘤生長。
基於血管生成在腫瘤生長和轉移中有著重要的作用，人們提出了通過抗血管生成(antiangiogenesis)來抑制腫瘤生長的腫瘤治療方案。這種方案可以將血管生成過程的各個階段作為治療靶，如抑制內皮細胞增殖、遷移或分化；誘導內皮細胞凋亡；抑制細胞外基質重塑(remodeling)等。與其它腫瘤治療方案比較，抗血管生成治療的特點是高效性、無耐藥性和無毒副作用。因此，這科治療方案的應用前景令人樂觀。到目前為止，已經分離純化15種以上的血管生成抑制因子，其中包括TNP-470，血管生成抑制素(Angiostatin)，內皮抑素(Endostatin)，幹擾素α/β，血小板因子4等。部分血管生成抑制因子已經開始了臨床試驗。
Kringle結構域是一種由80個左右胺基酸殘基組成的含有3對內部二硫鍵的蛋白質結構域，在纖溶酶原、組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶原、凝血酶原、肝細胞生長因子和載脂蛋白A等蛋白質中都廣泛存在。儘管不同的Kringle結構域在序列上有很高的同源性，但是它們卻具有不同的生物學功能。對纖溶酶原的5個Kringle結構域的研究發現，它們在抑制內皮細胞生長和遷移的活性上上有著很大的差異。其活性大小的順序是Kringle5(ED50＝50nM)＞Kringle1-3(ED50＝70nM)＞Kringle1-4(ED50＝135nM)＞Kringle1(ED50＝320nM)＞Kringle3(ED50＝460nM)＞Kringle2；而Kringle4幾乎沒有抑制內皮細胞增殖的活性。另外，許多蛋白質的Kringle結構域也被證明具有抑制內皮細胞生長的作用，肝細胞生長因子Kringle4和凝血酶原Kringle2。尿激酶原的Kringle結構域也具有一定的抑制內皮細胞生長的活性，但是活性較弱。
發明內容
本發明的目的就是通過基因工程技術將具有較弱的抑制內皮細胞生長和遷移及血管生成的尿激酶原Kringle結構域改造成具有較強的抑制內皮細胞生長和遷移及血管生成尿激酶原Kringle結構域變體蛋白，並將該變體蛋白用於與內皮細胞生長異常和血管生成異常相關的疾病，包括腫瘤的生長和轉移，肥胖，糖尿病和心腦血管疾病等。
本發明的技術解決方案一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的製備方法，其特徵是a.用PCR方法擴增出編碼尿激酶原Kringle結構域的基因片段，用Nde I和BamH I雙酶切後插入到pET29a質粒，構建成重組質粒pET29a-UKK；b.通過化學合成方法合成需要替換的脫氧核糖核苷酸序列，並在兩端分別加上Nco I和Pst I酶切位點，插入到重組質粒pET29a-UKK，構建成含有尿激酶原Kringle結構域變體蛋白編碼序列的重組質粒pET29a-mUKK；c.將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)後塗板，挑取單克隆至LB(卡那黴素抗性)中，培養過夜，轉接後繼續培養，再經誘導得到菌體；d.離心收集菌體，超聲破菌，離心取上清過Ni-NTA親和柱，對洗脫液中的目的蛋白進行復性，並用CM離子交換柱進一步純化，獲得高純度的目的蛋白。
用pET系列質粒構建含有尿激酶原Kringle結構域變體蛋白編碼序列的重組質粒，轉化到大腸桿菌，酵母和哺乳動物細胞等蛋白表達系統。
製備的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白，是對天然的尿激酶原Kringle結構域中一段胺基酸序列進行了替換的變體蛋白，該變體蛋白的胺基酸序列為CYEGNGHFYR GKASTDTMGR PCLPWNSATV LQHSIFTPETNPRAGLEKGK HNYCRNPDNR RRPWCYVQVG LKPLVQECMV HDC將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)後塗板，挑取單克隆至LB(卡那黴素抗性)中，37℃培養過夜，按1∶50比例轉接後繼續培養至OD600nm≈0.8，加0.5mMIPTG誘導3個小時。
所述尿激酶原Kringle結構域變體蛋白序列80％以上同源性的其它蛋白。
所述的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的脫氧核糖核苷酸序列。
一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是利用Bovine capillary endothelial cells(BCE)，Calf pulmonaryarterial endothelial cells(CPAE)，Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)等內皮細胞模型測量該變體蛋白抑制血管內皮細胞生長的活性。
一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是利用細胞劃痕法測量該變體蛋白抑制血管內皮細胞遷移的活性，利用雞尿囊膜(CAM)模型測量該變體蛋白抑制體外血管生長的活性。
一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是用小鼠腫瘤生長模型和小鼠腫瘤轉移模型測量該變體蛋白抑制腫瘤生長和轉移的活性。
一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是該尿激酶原Kringle結構域變體蛋白用於與血管內皮細胞生長異常和血管生成異常相關的疾病的治療，包括腫瘤的生長和轉移、肥胖、糖尿病和心腦血管疾病等。
對各種具有抑制血管內皮細胞生長和遷移及血管生成的Kringle結構域的胺基酸序列和空間結構進行研究後發現，一些具有較強的抑制血管內皮細胞生長和遷移及血管生成的Kringle結構域存在著保守序列。在纖溶酶原的Kringle 5結構域中，該保守序列是一個長度為16個胺基酸殘基的序列HSIFTPETNPRAGLEK。研究結果表明，該16肽具有抑制血管內皮細胞及內皮幹細胞生長及遷移的活性。
尿激酶原的Kringle結構域具有較弱的抑制血管內皮細胞生長和遷移及新生血管生成的活性。將尿激酶原的Kringle結構域中的一段序列用16肽序列替換，使該尿激酶原Kringle結構域變體蛋白具有較強的抑制血管內皮細胞生長和遷移及血管生成的活性。
本發明將具備較弱的抑制血管內皮細胞生長和遷移及血管生成的尿激酶原Kringle結構域通過基因工程的手段改造成具有較強的抑制血管內皮細胞生長和遷移及血管生成的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白，使該變體蛋白可用於治療與血管內皮細胞生長異常和新生血管生長有關的疾病，包括腫瘤的生長和轉移、肥胖、糖尿病和心腦血管疾病等。
具體實施例方式
本發明的技術內容包括1、利用基因工程的方法構建含有尿激酶原Kringle結構域基因片段的重組質粒pET29a-UKK。
2、用化學合成法合成需要替換的脫氧核糖核苷酸序列，並在兩端分別加上Nco I和Pst I酶切位點，插入到重組質粒pET29a-UKK，構建成含有尿激酶原Kringle結構域變體蛋白編碼序列的重組質粒pET29a-mUKK。將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)後表達，表達產物經過變復性和純化後，獲得高純度的目的蛋白。
3、利用Bovine capillary endothelial cells(BCE)，Calf pulmonary arterialendothelial cells(CPAE)，Human umbilical vein endothelial cells(BCE)等內皮細胞模型測量該變體蛋白抑制血管內皮細胞生長的活性；利用細胞劃痕法測量該變體蛋白抑制血管內皮細胞遷移的活性；利用CAM等模型測量該變體蛋白抑制體外血管生長的活性；利用小鼠腫瘤生長模型和小鼠腫瘤轉移模型測量該變體蛋白抑制腫瘤生長和轉移的活性。
具體實施例方式1.包含尿激酶原Kringle結構域編碼基因(UKK)的重組質粒的構建根據已知的人尿激酶原基因序列，設計了Kringle結構域的引物，在5』端引物上引入Nde I酶切位點catatg，在3』端引物上引入Xho I酶切位點ctcgag5』端引物序列5』gga att cca tat gtg cta tga ggg gaa tg3』3』端引物序列5』ccg ctc gag gca gtc atg cac cat gc3』以人尿激酶原的cDNA為模板，用PCR方法擴增出人尿激酶原Kringle結構域的DNA片段。用Nde I和BamH I分別對擴增片段和pET29a質粒進行雙酶切，經2％瓊脂糖電泳後，回收得到目的基因片段(UKK，246bp)和載體片段(～5kb)。用T4 DNA連接酶將目的基因片段與載體片段於16℃連接過夜。將連接產物轉化DH5α感受態細胞，在LB瓊脂糖平板(卡那黴素抗性)上塗板，37℃培養過夜。挑取單克隆，用Nde I和BamH I雙酶切篩選鑑定陽性克隆。用鹼裂解法抽提陽性克隆的質粒，經DNA測序確認序列正確。將正確基因序列的pET29a-UKK質粒進行擴增，並轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)。
2.包含尿激酶原Kringle結構域變體蛋白編碼基因(mUKK)的重組質粒的構建化學合成法合成編碼mUKK的DNA片段，在兩端分別加上Nco I和Pst I酶切位點，兩端磷酸化並退火形成雙鏈
5』c atg ggc cgg ccc tgc ctg ccc tgg aac tct gcc act gtcccg gcc ggg acg gac ggg acc ttg aga cgg tga cagctt cgt cac tcc atc ttc act ccg gaa act aac ccg cgt gctgaa gca gtg agg tag aag tga ggc ctt tga ttg ggc gca cgaggt ctg gaa aaa ggg aaa cat aat tac tgc a 3』cca gac ctt ttt ccc ttt gta tta atg用Nco I和Pst I雙酶切重組質粒pET29a-UKK，經2％瓊脂糖電泳後，回收得到載體片段，與化學合成的mUKK片段混合，用T4DNA連接酶將目的基因片段與載體片段於16℃連接過夜。將連接產物轉化DH5α感受態細胞，在LB瓊脂糖平板(卡那黴素抗性)上塗板，37℃培養過夜。挑取單克隆，用Nco I和Pst I雙酶切篩選鑑定陽性克隆。用鹼裂解法抽提陽性克隆的質粒，經DNA測序確認序列正確。將正確基因序列的pET29a-mUKK質粒進行擴增，並轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3)。
3.尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的表達，復性和純化從培養平板上挑取單菌落於LB培養基(卡那黴素抗性)中，37℃，200rpm振蕩培養過夜，按1∶50比例轉接後繼續培養至OD600nm≈0.8，加0.5mM IPTG誘導3個小時。離心(6,000rpm，20minutes)收集菌體。每克溼菌加入5ml裂解液(20mM Tris-HCl，5mM咪唑，500mM NaCl，6M鹽酸胍，10mM β-巰基乙醇，1mM PMS F，pH 7.9)，超聲破菌，離心(12,000rpm，30minutes)收集上清。上清過Ni-NTA親和柱，用15個床體積的洗滌緩衝液(25mM Tris-HCl，10mM咪唑，10mM β-巰基乙醇，8M尿素，pH 7.9)洗去雜蛋白。用10個床體積的洗脫緩衝液(25mM Tris-HCl，20mM或50mM咪唑，10mM β-巰基乙醇，8M尿素，pH 7.9)洗脫目的蛋白。將20倍體積的復性液(25mM Tris-HCl，10mM EDTA，1mM GSSG，1mM GSH，pH 7.9)逐滴滴加到含有目的蛋白的洗脫液中，4℃靜置過夜。然後用50mM NaAc(pH 4.5)在4℃條件下透析24小時。將透析後的樣品上樣到CM離子交換柱進行進一步的純化，用高鹽緩衝液(50mM NaAc，500mMNaCl，pH 4.5)洗脫，獲得高純度的目的蛋白。
4.抑制新生血管生成和抗腫瘤生長的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的活性測定(1)尿激酶原Kringle結構域變體蛋白抑制內皮細胞生長的活性測定①Bovine capillary endothelial cells(BCE)測定法取生長良好的BCE細胞，經D-Hanks液洗滌後用0.25％胰酶消化，細胞計數，用DMEM(含10％FBS，3ng/ml bFGF)培養基調節成細胞濃度為20,000個/ml的細胞懸液，加到96孔細胞培養板，每孔100μl。在37℃，5％ CO2條件下培養24小時。細胞貼壁後棄上清。每孔加入100μl DMEM(含2％ FBS)培養基，飢餓12小時。棄上清，加入100μl DMEM+2％ FBS+待測樣品。37℃培養20分鐘後，每孔補加100μlDMEM+2％ FBS+2ng/ml bFGF)，37℃培養72小時後用XTT或MTT法測活細胞數。
②Calf pulmonary arterial endothelial cells(CPAE)測定法方法同①。
③Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)測定法方法同①。
(2)尿激酶原Kringle結構域變體蛋白抑制內皮細胞遷移的活性測定細胞劃痕法取生長良好的BCE細胞，經D-Hanks液洗滌後用0.25％胰酶消化，細胞計數，用DMEM(含10％FBS)培養基調節成細胞濃度為20,000個/ml的細胞懸液，加到96孔細胞培養板，每孔100μl，在37℃，5％ CO2條件下培養24小時。細胞貼壁後，用移液槍槍頭在培養板板底劃「一」字形劃痕，在顯微鏡下記錄劃痕長度。用無血清DMEM洗滌後，加入100μl DMEM+2％ FBS+待測樣品，37℃培養24，48，72小時後，在顯微鏡下測量劃痕長度，計算出細胞的遷移距離。
(3)尿激酶原Kringle結構域變體蛋白抑制血管生成的活性測定取7天齡的雞胚，在尿囊膜附近將蛋殼打開一小洞。在0.2μm的濾膜上點上10μl的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白(1mg/ml)，待濾膜變幹後放置在雞胚尿囊膜的兩個大血管交叉處，在37℃，4％ CO2條件下培養72小時。取出尿囊膜置於細胞培養皿中，測量一級血管數、二級血管數、一級血管管徑及血管總面積與視野面積比值。用PBS作對照。
(4)尿激酶原Kringle結構域變體蛋白抑制腫瘤生長的活性測定取6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠，背部剃毛，在小鼠的背部皮下注射1×106Lewis Lung Carcinomas(LLC)細胞。待腫瘤生長至200mm3左右時開始皮下給藥。給藥劑量為每隻每天0.5mg尿激酶原Kringle結構域變體蛋白，連續給藥18天。每天用遊標卡尺測量腫瘤長徑(length)和短徑(width)，按公式width2×length×0.52計算腫瘤大小。並記錄小鼠的死亡時間。
(5)尿激酶原Kringle結構域變體蛋白抑制腫瘤轉移的活性測定取6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠，背部剃毛，在小鼠的背部皮下注射1×106Lewis Lung Carcinomas(LLC)細胞。待腫瘤生長至800mm3左右時切除腫瘤，並開始皮下給藥。給藥劑量為每隻每天0.5mg尿激酶原Kringle結構域變體蛋白。記錄小鼠死亡時間。
以上所述的活性測定方法的測定結果均表明尿激酶原Kringle結構域變體蛋白抑制內皮細胞生長和遷移，抑制血管生成，抑制腫瘤生長和轉移的活性優於野生型的尿激酶原Kringle結構域蛋白。
權利要求
1.一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的製備方法，其特徵是a.用PCR方法擴增出編碼尿激酶原Kringle結構域的基因片段，用Nde I和BamH I雙酶切後插入到pET29a質粒，構建成重組質粒pET29a-UKK；b.通過化學合成方法合成需要替換的脫氧核糖核苷酸序列，並在兩端分別加上Nco I和Pst I酶切位點，插入到重組質粒pET29a-UKK，構建成含有尿激酶原Kringle結構域變體蛋白編碼序列的重組質粒pET29a-mUKK；c.將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)後塗板，挑取單克隆至LB(卡那黴素抗性)中，培養過夜，轉接後繼續培養，再經誘導得到菌體；d.離心收集菌體，超聲破菌，離心取上清過Ni-NTA親和柱，對洗脫液中的目的蛋白進行復性，並用CM離子交換柱進一步純化，獲得高純度的目的蛋白。
2.根據權利要求1所述的一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的製備方法，其特徵是用pET系列質粒構建含有尿激酶原Kringle結構域變體蛋白編碼序列的重組質粒，轉化到大腸桿菌，酵母和哺乳動物細胞等蛋白表達系統。
3.根據權利要求1所述的一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的製備方法，其特徵是製備的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白，是對天然的尿激酶原Kringle結構域中一段胺基酸序列進行了替換的變體蛋白，該變體蛋白的胺基酸序列為CYEGNGHFYR GKASTDTMGR PCLPWNSATV LQHSIFTPETNPRAGLEKGK HNYCRNPDNR RRPWCYVQVG LKPLVQECMV HDC
4.根據權利要求1所述的一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的製備方法，其特徵是將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)後塗板，挑取單克隆至LB(卡那黴素抗性)中，37℃培養過夜，按1∶50比例轉接後繼續培養至OD600nm≈0.8，加0.5mM IPTG誘導3個小時。
5.一種具有與權利要求3所述尿激酶原Kringle結構域變體蛋白序列80％以上同源性的其它蛋白。
6.一種編碼權利要求3，5所述的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的脫氧核糖核苷酸序列。
7.一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是利用Bovine capillary endothelial cells(BCE)，Calfpulmonary arterial endothelial cells(CPAE)，Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)等內皮細胞模型測量該變體蛋白抑制血管內皮細胞生長的活性。
8.一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是利用細胞劃痕法測量該變體蛋白抑制血管內皮細胞遷移的活性，利用雞尿囊膜(CAM)模型測量該變體蛋白抑制體外血管生長的活性。
9.一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是用小鼠腫瘤生長模型和小鼠腫瘤轉移模型測量該變體蛋白抑制腫瘤生長和轉移的活性。
10.一種具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白的應用，其特徵是該尿激酶原Kringle結構域變體蛋白用於與血管內皮細胞生長異常和血管生成異常相關的疾病的治療，包括腫瘤的生長和轉移、肥胖、糖尿病和心腦血管疾病等。
全文摘要
本發明屬於生物製藥領域中應用基因工程技術生產蛋白質藥物的範疇。本發明公開了一種新的具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的尿激酶原Kringle結構域變體蛋白mUKK的製備方法和應用。其製備方法是用基因工程技術構建了表達mUKK的重組質粒，並實現了在大腸桿菌中的高效表達，經分離純化後獲得高純度的具有抑制血管生成及腫瘤生長和轉移的蛋白質藥物，可用於腫瘤、肥胖、糖尿病和心腦血管疾病等血管生成異常相關的疾病的治療。
文檔編號C12N9/72GK1706942SQ200410055548
公開日2005年12月14日 申請日期2004年8月4日 優先權日2004年6月4日
發明者劉建寧, 張菁, 陳於紅, 周穎江 申請人:南京大學