一種免疫層析試條用封閉劑組合物以及一種免疫層析試條的製作方法

2023-12-11 23:33:22

專利名稱：一種免疫層析試條用封閉劑組合物以及一種免疫層析試條的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫層析技術，具體涉及一種免疫層析試條用封閉劑組合物以及一種免疫層析試條。
背景技術：
隨著免疫診斷技術的發展，各種原材料以及各種檢測手段的綜合應用，技術越來越向小型、操作簡單、快速、準確度高的方向發展。免疫層析技術是這發展當中非常重要的一個部分，它從空間、時間上改變了這一技術的發展方向，在空間上，它從以前的實驗室搬到家庭，在時間上，它把幾天才能夠出檢測結果縮短到幾分鐘出檢測結果。因而大大推動了免疫診斷技術的快速發展。免疫層析技術是利用抗原抗體高特異性、高靈敏性的反應原理，通過高效信號標記物標記抗體(或抗原)來檢測抗原(或抗原)。在技術當中一個非常重要的技術難點就是抗原(或抗體)的固定材料，從目前解決的情況來看，一般選擇以下幾種固定材料硝酸纖維素膜(NC膜)、尼綸膜、聚偏氟乙烯膜(PVDF)，因為這些膜都能夠牢固的結合蛋白質，並且結合能力非常高。其中最常見的是NC膜，因為它結合蛋白質能力強，價格相對比較便宜。NC膜雖然能夠強有力的吸附抗原或者抗體，但是在檢測生物樣本過程中，由於生物樣本中存在大量的其他生物大分子，這些生物大分子也能夠非特異性吸附到NC膜上，因而嚴重幹擾抗原抗體的識別能力，減低檢測靈敏度。因此，需要找到一種技術解決抗原(或抗體)固定後，其他的生物大分子不會干擾抗原抗體反應的試劑目前，有很多大量專利文獻與學術文獻報告過減低NC膜的背景幹擾的問題，但是他們絕大部分是採用以下兩種方法處理採用先在NC膜固定生物大分子，然後用有機高分子物質(如PVP、PEG、PVP)與表面活性劑結合進行封閉處理。採用先在NC膜固定生物大分子，然後用BSA、脫脂奶粉、酪蛋白或者各種血清蛋白(如羊血清等)單獨處理或者與表面活性劑相結合處理。NC膜經過上述幾種方法處理後，使原本疏水的膜變得親水，同時生物大分子在NC 膜上的吸附能力大大降低，但是NC膜經過以上一系列處理後，也帶來了很多問題如因為表面活性劑的加入使原先固定在NC膜的蛋白質位置產生改變，蛋白質線出現彌散，原先固定在NC膜上的蛋白質量降低。其次由於NC膜在浸泡、乾燥過程中發生一定的變化也使試條整個性能發生改變，再次對於試條生產工藝來說，這幾種處理工藝非常麻煩，不利於生產工藝的放大。因此，目前一般試條生產廠家大都選擇購買經封閉處理後的NC膜，在生產試條時不需要進行額外的NC膜封閉處理。但是這種處理一般只解決了 NC膜的親水性能，NC膜吸附蛋白質的性能幾乎沒有發生改變，NC膜吸附蛋白質的能力還很強，膜上還存在大量蛋白質結合位點，因此很多試條生產廠家就在層析流動組分中加入BSA、表面活性劑進行再次封閉處理，以達到降低NC膜的檢測背景，但是這種處理方法並不太理想。層析試條一般是由這幾部分組成樣品墊、NC膜、吸水墊。當樣品墊中加入被檢測物時，被檢測物隨著溶液的流動與免疫顆粒反應，然後隨著液體的流動，免疫顆粒與固定在NC膜的抗原或者抗體再反應，沒有反應的顆粒最後被吸水墊收集。大多數文獻報導是在樣品墊中加入BSA與表面活性劑以解決降低NC膜背景高的問題，如發明人張濤(專利號 01126931. 6，專利名「應用流動封閉技術的免疫金檢測試劑盒」)報告了一種封閉處理技術，他是在樣品墊中加入封閉劑(封閉劑配方是脫脂奶粉、BSA、PVP、吐溫20)，當加入樣品時，樣品墊中的封閉劑釋放出來，起到封閉效果。這種封閉處理方法確實解決了膠體金層析試條上NC膜的封閉問題，但是這種方法對於乳膠顆粒的層析試條來說是不能夠封閉NC膜對乳膠顆粒的非特異性吸附問題，可能是因為乳膠顆粒疏水性比膠體金顆粒疏水性更強、 顆粒粒徑更大，從而導致乳膠顆粒經常在NC膜前端出現「死金」現象，因此沿用膠體金封閉處理方法並不理想。需要找到更合適的封閉試劑組份及方法來解決這個問題。同時目前還未報導過試條長期存儲後的封閉劑保護問題，因為封閉劑具有生物活性，容易失活；因此需要添加一些蛋白質保護劑，從而達到試條性能的長期保存。

發明內容
本發明要解決的技術問題在於提供一種能夠降低試條背景的免疫層析試條用封閉劑組合物以及一種背景較低的免疫層析試條。為了解決現有技術問題，本發明提供了一種免疫層析試條用封閉劑組合物，包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和第一緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白、酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保護劑為糖類。優選的，所述表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨
醇單油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚或聚氧乙烯月桂酸醚。優選的，所述第一緩衝溶液為磷酸緩衝溶液、氨基丁三醇-鹽酸緩衝液、硼酸緩衝液、甘氨酸-鹽酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、巴比妥鈉緩衝液、丙二酸-氫氧化鈉緩衝液、順丁烯酸-氫氧化鈉緩衝液，丁二酸-氫氧化鈉緩衝液，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝液，3- (N-嗎啉基)丙磺酸緩衝液，2-嗎啉乙磺酸緩衝液。優選的，所述酪蛋白處理液包括酪蛋白和第二緩衝溶液混合後的溶液經高壓滅菌後得到的處理液。優選的，所述第二緩衝溶液為有機酸緩衝液。優選的，所述糖類為蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、麥芽糖。優選的，所述蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑在所述緩衝溶液中的質量濃度比為 (0. 01 5) (0. 1 20) (0. 05 5)。優選的，所述緩衝溶液的離子濃度為0. 01-lmol/L、pH值為4 9。本發明還提供了一種免疫層析試條，包括塑料板；設置在所述塑料板上的吸水墊；設置在所述吸水墊上的硝酸纖維素膜；設置在所述硝酸纖維素膜上的樣品墊；其中，所述樣品墊包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保護劑為糖類。優選的，所述酪蛋白處理液包括酪蛋白和緩衝溶液混合後的溶液經高壓滅菌後得到的處理液。本發明提供了一種免疫層析試條用封閉劑組合物，包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和第一緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白、酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保護劑為糖類。本發明提供的封閉劑組合物中使用了酪蛋白、酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，這些蛋白具有很好的憎水性，相對於現有技術，能夠在溶膠中更好的使用，在乳液中不會隨溶液的流動而使蛋白溶於水中，牢固的固定在NC膜上，降低了由於使用環境而造成的背景升高。另外，本發明提供的組合物中，還包括蛋白保護劑，使組合物中的蛋白能夠保持更長久的使用，提高了組合物的使用壽命。本發明提供了一種免疫層析試條，包括塑料板；設置在所述塑料板上的吸水墊； 設置在所述吸水墊上的硝酸纖維素膜；設置在所述硝酸纖維素膜上的樣品墊；其中，所述樣品墊包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白處理液、 甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保護劑為糖類。相比較現有技術，本發明提供的免疫層析試條樣品墊中含有封閉劑，所述封閉劑包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和緩衝溶液；所述蛋白為酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保護劑為糖類，使試條中反應位點不變化，封閉效果好，背景低，使用壽命長。


圖1、本發明提供的免疫層析試條結構示意圖。
具體實施例方式為了進一步了解本發明，下面結合實施例對本發明的優選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特徵和優點而不是對本發明專利要求的限制。本發明提供了一種免疫層析試條用封閉劑組合物，包括包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和第一緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白、酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保護劑為糖類。相比較現有技術，本發明提供的蛋白為疏水性較好的蛋白，在乳液中能夠牢固的在試條位點上起到封閉作用，不會隨著水的流動而發生位點位置變化或位點增多，所述蛋白選用酪蛋白、酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白，人血清白蛋白，優選為酪蛋白或酪蛋白處理液，最優選為酪蛋白處理液。所述酪蛋白處理液的製備方法為，將酪蛋白與PH為6 7的0. lmol/L的第二緩衝溶液混合，溶解，然後經高壓滅菌處理得到酪蛋白處理液。按照本發明，所述蛋白在第一緩衝溶液中的質量濃度優選為0.01^-5%,更優選為0. 04 % -1 %， 最優選為0. 2%。所述第二緩衝溶液優選為甘氨酸-鹽酸緩衝溶液，pH值優選為6. 5。按照本發明，為了使蛋白具有更長的使用壽命，使所述組合物在長時間放置後依然具有很好的封閉效果，以及較低背景，本發明提供的組合物中增加了蛋白保護劑，所述蛋白保護劑為糖類，優選為蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、麥芽糖。更優選為蔗糖、海藻糖、山梨醇。最優選為蔗糖。按照本發明，所述蛋白保護劑在第一緩衝溶液中的質量濃度優選為0. 1 % -20 %，更優選為0.5^-10%,最優選為5 %。糖類都是多羥基化合物，高濃度糖可以與蛋白質、酶類等物質在高溫乾燥過程形成玻璃態，從而使蛋白質活性得以保護。
按照本發明，所述組合物中還包括增加蛋白與乳液混合的表面活性劑和調節封閉劑組合物PH值的第一緩衝溶液。按照本發明，所述表面活性劑優選為非離子型表面活性劑，優選為聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯(Tween20)、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯 (Tween80)、聚氧乙烯辛基苯基醚(Triton χ 100)或聚氧乙烯月桂酸醚(Brij 35)。更優選為聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯或聚氧乙烯辛基苯基醚，最優選為聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯。在第一緩衝溶液中的質量濃度優選為0.05^-5%,更優選為0. 1 % -2 %，最優選為0.5%所述第一緩衝溶液優選為磷酸緩衝溶液、氨基丁三醇-鹽酸緩衝液、硼酸緩衝液、 甘氨酸-鹽酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、巴比妥鈉緩衝液、丙二酸-氫氧化鈉緩衝液、順丁烯酸-氫氧化鈉緩衝液，丁二酸-氫氧化鈉緩衝液，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝液，3- (N-嗎啉基)丙磺酸緩衝液，2-嗎啉乙磺酸緩衝液。更優選為磷酸緩衝液，巴比妥鈉緩衝液，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝液，最優選擇磷酸緩衝液。所述第一緩衝溶液的PH值在4-9之間，優選為 5-8之間，最優選為6. 5，離子強度為0. 005-lmol/L,優選為0. 05-0. 5mol/L,最優為0. Imol/ L，按照本發明，將所述蛋白與蛋白保護劑混合，將表面活性劑混合在第一緩衝溶液中，然後將蛋白與蛋白保護劑均勻混合在第一緩衝溶液中，得到封閉劑組合物。本發明提供的封閉劑組合物能夠在試條樣品墊中使用，也可以與乳膠顆粒混合使用，用於降低免疫層析的背景。按照本發明，將封閉劑加入樣品墊中，然後將NC膜貼到塑料板上，然後到噴膜機上劃線，噴膜後NC膜過夜乾燥，第二天組裝試條，試條按照樣品墊、NC膜、吸水紙的順序黏貼到塑料板上，最後到斬切機上把試條切成試條。本發明還提供了一種免疫層析試條，包括塑料板；設置在所述塑料板上的吸水墊；設置在所述吸水墊上的硝酸纖維素膜；設置在所述硝酸纖維素膜上的樣品墊；其中，所述樣品墊包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保護劑為糖類。按照本發明，如圖1所示，所述免疫層析試條包括樣品墊2、硝酸纖維素膜3、吸水墊4、塑料板5，將樣品溶液1加入試條上，5 10分鐘後得到結果，T和C線均顯色為陰性、 C顯色而T不顯色呈陽性。以下為具體實施例1、蛋白質封閉效果的比較顆粒標記實驗首先對螢光乳膠顆粒經過EDC與NHS活性，然後顆粒與抗人血清白蛋白的單克隆抗體反應，經離心、洗脫後，把標記有抗體的顆粒懸浮在以下5種不同的蛋白質封閉液中1、空白組，2、0. 5%明膠的封閉液；3、0. 5% B SA的封閉液；4、0. 5%酪蛋白的封閉液；5、0. 5%脫脂奶粉的封閉液；6、酪蛋白處理液；7、1%甲基化牛血清白蛋白。酪蛋白處理液的配製方法首先配製pH值=6. 5的0. lmol/1的甘氨酸-鹽酸緩衝液，然後把酪蛋白溶解在該緩衝液中，最後經高壓滅菌處理得到酪蛋白處理液。試條製作先將NC膜貼到塑料板上，然後到噴膜機上劃線，噴膜後NC膜過夜乾燥， 第二天組裝試條，試條按照樣品墊、NC膜、吸水紙的順序黏貼到塑料板上，最後到斬切機上把試條切成4mm寬的試條。
試條檢測試條分為7組，每組又分成2份，一份是陰性樣本(本檢測項目是尿微量白蛋白，cutoff值是20mg/l，陰性樣本的白蛋白濃度是5mg/l.)；另一份是陽性樣本(即白蛋白濃度為25mg/l).每組40根試條，陽性樣本20根，陰性樣本20根。試條檢測時，先將儲存在不同蛋白質封閉液中的顆粒溶液與陽性或者陰性樣本按照10 1的比例混合，即最終顆粒固含濃度為0.05%。然後加入到樣品墊中，每根試條溶液加入量為SOul。實驗測試結果如下
[004權利要求
1.一種免疫層析試條用封閉劑組合物，其特徵在於，包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和第一緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白、酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保護劑為糖類。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯辛基苯基醚或聚氧乙烯月桂酸醚。
3.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述第一緩衝溶液為磷酸緩衝溶液、氨基丁三醇-鹽酸緩衝液、硼酸緩衝液、甘氨酸-鹽酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、巴比妥鈉緩衝液、丙二酸-氫氧化鈉緩衝液、順丁烯酸-氫氧化鈉緩衝液，丁二酸-氫氧化鈉緩衝液，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩衝液，3- (N-嗎啉基)丙磺酸緩衝液，2-嗎啉乙磺酸緩衝液。
4.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述酪蛋白處理液包括酪蛋白和第二緩衝溶液混合後的溶液經高壓滅菌後得到的處理液。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於，所述第二緩衝溶液為有機酸緩衝液。
6.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述糖類為蔗糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、甘油、麥芽糖。
7.根據權利要求1所述的組合物，其特徵在於，所述蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑在所述緩衝溶液中的質量濃度比為(0. 01 5) (0.1 20) (0.05 5)。
8.根據權利要求1、3、5任意一條所述的組合物，其特徵在於，所述緩衝溶液的離子濃度為 0. 01-lmol/L、pH 值為 4 9。
9.一種免疫層析試條，其特徵在於，包括塑料板；設置在所述塑料板上的吸水墊；設置在所述吸水墊上的硝酸纖維素膜；設置在所述硝酸纖維素膜上的樣品墊；其中，所述樣品墊包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白，所述蛋白保護劑為糖類。
10.根據權利要求9所述的免疫層析試條，其特徵在於，所述酪蛋白處理液包括酪蛋白和緩衝溶液混合後的溶液經高壓滅菌後得到的處理液。
全文摘要
本發明提供了一種免疫層析試條用封閉劑組合物，包括蛋白、蛋白保護劑、表面活性劑和第一緩衝溶液；其中，所述蛋白為酪蛋白、酪蛋白處理液、甲基化牛血清白蛋白、人血清白蛋白；所述蛋白保護劑為糖類。本發明提供的封閉劑組合物能夠有效降低免疫層析試條的背景、使用壽命長，檢測靈敏度高。本發明還提供了一種免疫層析試條。
文檔編號G01N33/558GK102426231SQ20111027293
公開日2012年4月25日 申請日期2011年9月15日 優先權日2011年9月15日
發明者聶海龍 申請人:長沙三諾生物傳感技術股份有限公司