用於治療色盲和其它疾病的啟動子、表達盒、載體、藥盒和方法

2023-12-11 22:42:47 1

用於治療色盲和其它疾病的啟動子、表達盒、載體、藥盒和方法
【專利摘要】本發明提供用於治療影響視網膜視錐細胞的遺傳病的分離的啟動子、轉基因表達盒、載體、藥盒和方法。
【專利說明】用於治療色盲和其它疾病的啟動子、表達盒、載體、藥盒和方法
[0001]相關申請
本發明要求於2011年I月7日提交的美國臨時申請號61/430，710的申請日的權益，其全部內容在此通過引用結合到本文中。
[0002]發明背景
色盲為色覺病症，其通常為先天性常染色體隱性病症。其可為部分的或完全的。參見 Pang, J.-J.等(2010).Achromatopsia as a Potential Candidate for GeneTherapy (色盲作為基因療法的潛在候選).載於JoVaflce1S in Experimental Medicineand Biology,第664卷，第6部分,639-646 (2010)(下文中Pang等)。色盲的症狀包括視敏度降低、色盲(缺乏顏色感知)、晝盲症(在強光中視覺能力減退，伴隨厭光(photoaversion)，意味著厭惡或避免強光)、眼球震顫(不受控的眼睛振蕩運動)、虹膜運行異常和立體視覺損傷(不能感知景物的三維方面)。
[0003]視網膜電流圖顯示在色盲中，視網膜視杆光感受器功能保持完整，而視網膜視錐光感受器無功能。視杆和視錐光感受器在視覺中發揮功能上不同的作用，Pang等。在弱至非常強的光中運行時，視錐光感受器主要負責中央、高解析度和色覺。其集中在視網膜的中央黃斑，並且包含幾乎100%的窩(fovea)。視杆光感受器負責周邊、弱光和夜間視覺，其主要存在於黃斑外的周邊視網膜中。
[0004]每30，000個人中約I個患有全色盲。在全色盲中，色覺完全喪失、中央視覺喪失、視敏度20/200或更差。因此，大部分色盲個體為法定盲人。當前的護理標準包括用有色隱形眼鏡限制視網膜曝光和 提供放大以提高中央視覺。然而，尚無可用的矯正色盲中的視錐功能的治療，Pang等。
[0005]先天性色盲有多種遺傳原因。環核苷酸-門控離子通道β3 (CNGB3，也稱為ACHM3)基因的突變為色盲的一個遺傳原因。最新在狗中的研究提示了在治療CNGB3基因突變導致的色盲中使用基於重組腺伴隨病毒(rAAV)的基因療法的一些前景。Komaromy等，Gene therapy rescues cone function in congenital achromatopsia (基因療法在先天性色盲中搖救視維功能).Human Molecular Genetics, 19(13): 2581-2593 (2010)(下文中Komaromy等)。在犬的研究中，使用的rAAV載體包裝了人CNGB3 (hCNGB3)表達盒，所述表達盒包含包括2.1 kb的視錐紅視蛋白啟動子(PR2.1)和人CNGB3 (hCNGB3) cDNA的元件。該研究的一個限制為由PR2.1啟動子驅動的hCNGB3僅在紅和綠視錐中表達，而內源性hCNGB3在所有三個類型的視錐(紅、綠和藍視錐)中均表達。另一個限制為使用的表達盒的總體大小(5，230 bp)遠超出AAV顆粒的正常包裝能力(〈4.9 kb);過度填充的rAAV顆粒顯著地損傷rAAV包裝效率，導致低產率、較高的空-滿顆粒比率，以及可能較低的載體侵染性。包含較短形式的視錐紅視蛋白啟動子或視錐抑制蛋白啟動子的表達盒在恢復視覺功能上不太有效。本發明解決了這些限制。
[0006]本發明具有如下優點:其提供能夠促進hCNGB3在所有三個類型的視錐中表達的啟動子。此外，本發明啟動子具有這樣的優點，其足夠短，使得hCNGB3表達盒很好地適應rAAV的正常包裝能力。適應rAAV正常包裝能力的啟動子提供益處，例如改善的產率、較低的空-滿顆粒比率和較高的載體侵染性。本發明還提供表達盒、載體和使用這些改善的啟動子的藥盒(kit)，以及用於通過給予載體而治療色盲的方法。
[0007]本發明解決了對有效的色盲治療的需求。
[0008]發明概述
在一個方面，本發明提供分離的啟動子，其包含約1.8 kb的CNGB3基因的5』-NTR。在示例性實施方案中，所述啟動子包含SEQ ID NO:1所示的序列。
[0009]在另一個方面，本發明提供分離的啟動子，其包含約1.6 kb的CNGB3基因的5』-NTR。在示例性實施方案中，所述啟動子包含SEQ ID NO: 2所示的序列。 [0010]在另一個方面，本發明提供分離的啟動子，其包含約400 bp的巨細胞病毒(CMV)增強子和約1.4 kb的CNGB3基因的5』 -NTR0在示例性實施方案中，所述啟動子包含SEQID NO: 3所示的巨細胞病毒(CMV)增強子和SEQ ID NO: 4所示的CNGB3基因的5』 -NTR0
[0011]在本發明的具體實施方案中，所述CNGB3基因為人CNGB3基因。
[0012]在具體實施方案中，本發明啟動子能夠促進S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞中的CNGB3表達。
[0013]在其它具體實施方案中，所述啟動子能夠促進S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞中的CNGA3表達。
[0014]在其它具體實施方案中，所述啟動子能夠促進S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞中的GNAT2表達。
[0015]在另一個方面，本發明提供轉基因表達盒，其包含本文所述啟動子；選自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸和最小調控元件。
[0016]在另一個方面，本發明提供轉基因表達盒，其包含本文所述啟動子、CNGB3核酸和最小調控元件。
[0017]在具體實施方案中，所述核酸為人核酸。
[0018]在另一個方面，本發明提供核酸載體，其包含本文所述表達盒。在一個實施方案中，所述載體為腺伴隨病毒(AAV)載體。在不例性實施方案中，載體包含所述AAV載體的衣殼序列血清型和ITR血清型，其獨立地選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVll和AAV12的。在另一個實施方案中，衣殼序列為突變型衣殼序列。
[0019]在另一個方面，本發明提供用於治療影響視網膜視錐細胞的基因突變、置換或缺失相關疾病的方法，其中所述方法包括給予需要此種治療的受試者包含本文所述啟動子的載體，從而治療受試者。在一個所述方案中，所述疾病為色盲。
[0020]在另一個方面，本發明提供用於治療色盲的方法，包括給予需要此種治療的受試者本文所述載體，從而治療受試者。在一個實施方案中，所述載體經視網膜下給予。
[0021]在另一個方面，本發明提供包括含有本文所述啟動子的載體及其使用說明書的藥盒。
[0022]在另一個實施方案中，本發明提供包括本文所述核酸載體及其使用說明書的藥盒。
[0023]在另一個方面，本發明提供製備重組腺伴隨病毒(rAAV)載體的方法，包括將選自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸插入本文所述腺伴隨病毒載體。在一個實施方案中，所述核酸為人核酸。
[0024]在其它實施方案中，所述AAV載體的衣殼序列血清型和ITR血清型獨立地選自AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVl I 和 AAV12。在具體實施方案中，衣殼序列為突變型衣殼序列。
[0025]附圖簡述
圖1:截短的人紅/綠視蛋白啟動子示意圖。
[0026]圖2:rAAV5-PR2.l_hCNGB3 載體的示意圖。
[0027]圖3:4個包含PR2.1啟動子變體的前病毒質粒的示意圖。PR2.1啟動子(截短的人紅/綠視蛋白啟動子)在其5』-末端截短300 bp,500 bp和1，100 bp，產生較短的啟動子，分別命名為PRl.7、PR1.5和PRl.1。將CMV增強子添加至PRl.1的5』末端，產生雜合啟動子。在這些構建體的每個中，PR2.1的500 bp核心啟動子(以灰色顯示)和基因座控制區(以紅色顯示)保持完整。末端重複用箭頭指出，並且示出SV40剪接信號序列的位置。
[0028]圖4:不同長度的5 』 -NTR序列從hCNGB3基因PCR擴增。
[0029]圖5 列出 SEQ ID NO: 1-4。
[0030]圖6列出典型視網膜切片的圖像。RPE:視網膜色素上皮；PR:光感受器；綠色:GFP蛋白表達染色；紅色:視錐染色；藍色:核染色。
[0031]發明詳述 1.概述和定義
除非另外定義，否則本文使用 的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域技術人員通常理解的含義。下列參考文獻為技術人員提供本文所使用的許多術語的一般定義:Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (微生物學和分子生物學詞典)(第2版.1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(劍橋科技詞典)(Walker主編，1988); The Glossary of Genetics (遺傳詞彙表)，第
5版，R.Rieger 等(主編)，Springer Verlag (1991)和 Hale & Marham, The HarperCollins Dictionary of Biology (生物學哈拍柯林斯詞典)(1991)。如本文所使用的，下列術語具有下文歸於其的含義，除非另外指明。
[0032]本文使用的冠詞「一個」和「一種」指一個或多於一個(即至少一個)該冠詞的語法對象。舉例來說，「一個元件」意指一個元件或多於一個元件。
[0033]本文使用的術語「包括」意指短語「包括但不限於」，並且與之可互換地使用。
[0034]本文使用的術語「或」意指術語「和/或」，並與之可交換地使用，除非上下文另外清楚地指明。
[0035]本文使用的術語「例如」意指短語「例如但不限於」，並與之可互換地使用。
[0036]待通過本發明方法治療的「受試者」或「患者」可意指人或非-人動物。「非人動物，，包括任何脊椎或無脊椎生物。
[0037]「色盲」為色覺病症。色盲的症狀包括色盲(缺乏顏色感知)、弱視(視敏度降低)、晝盲症(在強光中視覺能力減退，伴隨厭光，意味著厭惡或避免強光)、眼球震顫(不受控的眼睛振蕩運動)、虹膜運行異常和立體視覺損傷(不能感知景物的三維方面)。如本文所使用的，術語「色盲」是指基因突變、置換或缺失導致的色盲形式。
[0038]「治療」疾病(例如，色盲)意指減輕、預防或延遲該疾病至少一個病徵或症狀的發生。
[0039]DNA和RNA鏈的不對稱末端稱為5!(五撇)和:V (三撇)末端，5』末端具有末端磷酸基團，3』末端具有末端羥基。五撇(5』 )末端在其末端脫氧核糖或核糖的糖-環中具有第五個碳原子。核酸在體內按5』 -至3』 -方向合成，這是因為用於組裝新鏈的聚合酶經由磷酸二酯鍵將每個新核苷酸連接到3』 -羥基(-0H)。
[0040]術語「5』_NTR」是指不轉錄為RNA的基因區域。該區域有時還稱為5』 -側翼區，其通常在轉錄起始位點前或上遊(即，朝向DNA的5』末端)。5』 -NTR包含基因啟動子，並且可還包含增強子或其它蛋白結合位點。
[0041]「啟動子」為促進特定基因轉錄的DNA區域。作為轉錄過程的一部分，合成RNA的酶，稱為RNA聚合酶，附著在基因附近的DNA上。啟動子包含提供RNA聚合酶和轉錄因子(其招募RNA聚合酶)起始結合位點的特定DNA序列和反應元件。
[0042]視網膜包含三種光感受器:視杆細胞、視錐細胞和光感神經節細胞。視錐細胞有三種類型:S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞。S-視錐細胞對短波長光(峰值接近420-440 nm)反應最強，也稱為藍視錐。M-視錐細胞對中波長光(峰值接近534-545 nm)反應最強，也被稱為綠視錐。L-視錐細胞對長波長光(峰值接近564 - 580 nm)反應最強，也被稱為紅視錐。自三個視錐類型信號接收的信號差異允許腦感知所有可能的顏色。
[0043]「轉基因表達盒」或「表達盒」包含被核酸載體遞送至靶細胞的基因序列。這些序列包括目的基因(例如，CNGB3核酸)、一個或多個啟動子和最小調控元件。
[0044]「最小調控元件」為基因在靶細胞中有效表達所必需的調控元件，因此應包含在轉基因表達盒中。這樣的序列可包括，例如啟動子或增強子序列、便於DNA片段插入質粒載體中的多聚接頭序列以及負責內含子剪接和mRNA轉錄物多腺苷酸化的序列。在最近的用於色盲的基因療法治療的實例中，表達盒包括多腺苷酸化位點的最小調控元件、剪接信號序列和AAV末端反向重複。參見,例如，Komaromy等。
[0045]「核酸」或「核酸分子」為由單體核苷酸鏈組成的分子，例如DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)。核酸可編碼，例如，啟動子、CNGB3基因或其部分或調控元件。核酸分子可為單鏈或雙鏈。「CNGB3核酸」指包含CNGB3基因或其部分或CNGB3基因的功能變體或其部分的核酸。相似地，「CNGA3核酸」指包含CNGA3基因或其部分或CNGA3基因的功能變體或其部分的核酸，「GNAT2核酸」指包含GNAT2基因或其部分或GNAT2基因的功能變體或其部分的核酸。基因的功能變體包括具有微小變化，例如，沉默突變、單核苷酸多態性、錯義突變和其它不顯著改變基因功能的突變或缺失的基因變體。
[0046]「分離的」核酸分子(例如，分離的啟動子)是指從核酸天然來源中存在的其它核酸分子中分離的核酸分子。例如，關於基因組DNA，術語「分離的」包括從與基因組DNA天然結合的染色體中分離的核酸分子。優選「分離的」核酸分子不含在衍生該核酸分子的生物基因組DNA中天然地位於核酸分子兩側的序列。
[0047]II.發明方法
本發明提供可用於治療影響視網膜視錐細胞的遺傳病的啟動子、表達盒、載體、藥盒和方法。影響視網膜視錐細胞的遺傳病包括色盲、Leber先天性黑蒙、視錐-視杆營養不良、色素性視網膜炎(包括X-連鎖色素性視網膜炎)、黃斑病變和年齡相關性黃斑變性。在優選的實施方案中，所述疾病為色盲。[0048]色盲為色覺病症。常染色體隱性突變或三個基因中其它類型的序列改變是先天性色盲的主要原因。參見 Pang，J.-J.等(2010).Achromatopsia as a PotentialCandidate for Gene Therapy (色盲作為基因療法的潛在候選).載於inExperimental Medicine and Biology,第664卷，第6部分，639-646 (2010)。色盲已經與環核苷酸門控通道(CNG) α或β亞基(分別被稱為CNGA3和CNGB3)的突變相關聯。與色盲相關的CNGA3基因突變在以下文獻中報導:Patel KAj等Transmembrane SI mutationsin CNGA3 from achromatopsia 2 patients cause loss of function and impairedcellular trafficking of the cone CNG channel (色盲 2 患者中 CNGA3 跨膜 SI 突變導致視錐CNG通道功能喪失和細胞運輸損傷).1nvest.0phthalmol.Vis.ScL 46 (7):2282 - 90.(2005)., Johnson S，等 Achromatopsia caused by novel mutations in bothCNGA3 and CNGB3 (CNGA3和 CNGB3 二者中新型突變引起的色盲).J.Med.Genet.41 (2):e20.(2004).， Wissinger B，等 CNGA3 mutations in hereditary cone photoreceptordisorders (遺傳性視錐光感受器病症中的CNGA3突變).Am.J.Hum.Genet.69 (4):722 - 37.(2001).,和 Kohl S，等 Total colourblindness is caused by mutations inthe gene encoding the alpha—subunit of the cone photoreceptor cGMP-gated cationchannel (全色盲由編碼視錐光感受器cGMP-門控陽離子通道α亞基的基因突變引起).Nat.Genet.19 (3): 257 - 9.(1998)。與色盲相關的CNGB3基因突變在以下文獻中報導:Johnson S，等 Achromatopsia caused by novel mutations in both CNGA3 and CNGB3(CNGA3 和 CNGB3 二者中新型突變引起的色盲).J.Med.Genet.41 (2): e20.(2004).，Peng Cj 等 Achoromatopsia-associated mutation in the human cone photoreceptorcyclic nucleotide-gated channel CNGB3 subunit alters the ligand sensitivityand pore properties of heteromeric channels (人視維光感受器環核苷酸-門控通道CNGB3亞基中的色盲相關突變改變異測通道的配體敏感性和孔性質).J.BioL Chem.278 (36): 34533 - 40 (2003).，Bright SR，等 Disease-associated mutations in CNGB3produce gain of function alterations in cone cyclic nucleotide-gated channels(CNGB3的疾病相關突變引起視錐環核苷酸-門控通道的功能獲得性改變).MoL Vis.11: 1141 - 50 (2005).，Kohl S，等 CNGB3 mutations account for 50% of all caseswith autosomal recessive achromatopsia (常染色體隱性色盲所有病例的50%起因於CNGB3突變).Eur.J.Hum.Genet.13 (3): 302 - 8 (2005).，Rojas CV，等A frameshiftinsertion in the cone cyclic nucleotide gated cation channel causes completeachromatopsia in a consanguineous family from a rural isolate (在農村隔離群的一個血緣家庭中視錐環核苷酸門控陽離子通道的移碼插入導致全色盲).Eur.J.Hum.Genet.10 (10): 638 - 42 (2002).，Kohl S，等 Mutations in the CNGB3 gene encodingthe beta—subunit of the cone photoreceptor cGMP-gated channel are responsiblefor achromatopsia (ACHM3) linked to chromosome 8q21 (編碼視維光感受器 cGMP-門控通道的CNGB3基因突變導致染色體8q21連鎖的色盲(ACHM3)).Hum.MoL Genet.9(14): 2107 - 16 (2000).，Sundin OHj 等.Genetic basis of total colourblindnessamong the Pingelapese islanders (Pingelapese 島民中全色盲的遺傳基礎).Nat.Genet.25 (3): 289 - 93 (2000)。視錐細胞轉導蛋白基因(被稱為GNAT2)的序列改變也可導致色盲。參見Kohl S，等，Mutations in the cone photoreceptor G-proteinalpha-subunit gene GNAT2 in patients with achromatopsia (色盲患者中視維光感受器 G-蛋白 α 亞基基因 GNAT2 的突變).Am J Hum Genet 71 (2): 422-425 (2002)(下文中Kohl等)。這些蛋白突變的嚴重度與色盲表型的嚴重度相關。http://en.wikipedia.0rg/wiki/Achromatopsia。約50%的色盲病例起因於CNGB3突變。Kohl等，約23%的病例起因於CNGA3突變，約2%的病例起因於GNAT2突變。
[0049]「CNGB3基因」為編碼環核苷酸-門控通道β3 (CNGB3)的基因。「CNGA3基因」為編碼環核苷酸-門控通道α 3 (CNGA3)的基因。CNGB3和CNGA3基因在視網膜的視錐細胞中表達。天然的視網膜環核苷酸門控通道(CNG)關鍵性地參與光轉導。CNG為由兩個α和兩個β亞基組成的陽離子通道。在黑暗中，視錐具有相對高濃度的環鳥嘌呤核苷3』-5』 一磷酸(cGMP)，其導致CNG打開，造成去極化和連續的穀氨酸釋放。曝光激活降解cGMP的信號轉導通路。cGMP濃度的降低導致CNG關閉，阻止正離子流入、使細胞超極化並終止穀氨酸的釋放。CNGB3或CNGA3基因的突變可導致視錐光感受器功能缺陷，引起色盲。CNGB3基因突變已經與除色盲外的其它疾病相關聯，這些疾病包括進行性視錐營養不良和青少年性黃斑變性。
[0050]GNAT2基因編碼鳥嘌呤核苷酸結合蛋白的α -2亞基，也稱為視錐-特異性α轉導蛋白。鳥嘌呤核苷酸-結合蛋白(G蛋白)由α、β和Y亞基組成。在光感受器中，G蛋白在視覺信號的擴增和轉導中是關鍵的。多種類型的GNAT2序列變化可導致人色盲:無義突變、小缺失和/或插入突變、移碼突變和大的基因內缺失。Pang等。
[0051]當前，沒有有效的色盲治療。動物研究提示使用基因療法來治療色盲和其它視網膜疾病是可能的。對於隱性基因缺陷，目標為將缺陷基因的野生型拷貝遞送至受影響的視網膜細胞類型。將基因遞送至一些視錐細胞亞群的能力在例如Mauck，M.C.等，Longitudinal evaluation of expression of virally delivered transgenes in gerbilcone photoreceptors `(病毒遞送的轉基因在沙鼠視錐光感受器中的表達的縱向評估).Visual Neuroscience 25(3): 273-282 (2008)中證明。作者表明重組AAV載體可用於實現編碼綠色螢光蛋白的報導基因在特定類型的沙鼠視錐細胞中的長期表達。作者進一步證明可將人長-波長視蛋白基因遞送至特定的沙鼠視錐，引起視錐對長-波長光的反應。
[0052]其它研究證明用重組AAV載體的基因療法可用於通過將人L-視蛋白基因引入松鼠猴視網膜而將二色視猴轉化為三色視者。Mancuso, K.，等Gene therapy for red-greencolour blindness in adult primates (用於成年靈長類紅-綠色盲的基因療法).Nature 461: 784-787 (2009)。視網膜電流圖證實引入的感光色素是有功能的，並且在行為測試中猴子顯示色覺改善。
[0053]存在幾種色盲動物模型，對其的基因療法已經證明了恢復視錐功能的能力。參見Pang等。首先，小鼠具有視錐特異性α轉導蛋白基因的隱性突變，導致弱視敏度和很少或無視錐-特異性ERT反應。通過單次視網膜下注射攜帶野生型小鼠GNAT2 cDNA和人紅視錐視蛋白啟動子的AAV血清型5載體來治療純合Gnat2@m小鼠恢復了視錐_特異性 ERG 反應和視敏度。Alexander 等 Restoration of cone vision in a mouse model ofachromatopsia (色盲小鼠模型中視維視覺的恢復).Nat Med 13:685-687 (2007)(下文中Alexander等)。其次，cpfl5 (視錐光感受器功能喪失5)小鼠具有CNGA3基因常染色體隱性錯義突變，無視錐-特異性ERG反應。通過視網膜下注射攜帶野生型小鼠CNGA3基因和人藍視錐啟動子(HB570)的AAV載體來治療印/75小鼠引起視錐-特異性ERG反應的恢復，Pang等。第三,有一種Alaskan Malmute狗,其具有天然存在的CNGB3突變,導致日間視覺喪失和視網膜視錐功能缺乏。在該類型的狗中，視網膜下注射包含人CNGB3 cDNA和人紅視錐視蛋白啟動子的AAV5載體恢復視錐-特異性ERG反應。參見例如,Komaromy等。[0054]先前使用基因療法治療色盲的方法受這一事實限制:使用的啟動子導致轉基因僅在某些類型的視錐細胞光感受器中表達。本發明啟動子可驅動基因在存在於人類中的所有三種類型視錐細胞(S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞)中表達。
[0055]Komaromy等進行的研究的另一個限制在於所使用表達盒的總大小(5,230 bp)遠超出AAV顆粒的正常包裝能力(〈4.9 kb);過度填充的rAAV顆粒顯著地損傷rAAV包裝效率，導致低產率、較高的空-滿顆粒比率，以及可能較低的載體侵染性。包含較短形式視錐紅視蛋白啟動子或視錐抑制蛋白啟動子的表達盒在恢復視覺功能上不太有效。本發明啟動子具有這樣的優點，由於其縮短的長度，使得hCNGB3表達盒有效包裝在AAV顆粒中。適應rAAV正常包裝能力的啟動子提供益處，例如改善的產率、較低的空-滿顆粒比率、較高的載體侵染性以及最後，治療所需病況的較高功效。
[0056]II1.本發明的啟動子、表達盒、核酸和載體
本發明的啟動子、CNGB3核酸、調控元件、表達盒和載體可使用本領域已知方法生產。下文所描述方法作為這樣的方法的非限制性實例提供。
[0057]啟動子
本發明提供分離的啟動子。在一些方面，這些啟動子包含CNGB3基因的5』 -NTR區段。在相關方面，這些啟動子包含CNGB3基因的5』-NTR區段以及衍生自其它基因的一個或多個增強子序列。
[0058]在一個實施方案中，啟動子為包含約1.8 kb的CNGB3基因5』_NTR的分離啟動子。在具體實施方案中，啟動子具有序列SEQ ID NO:1。
[0059]在另一個實施方案中，啟動子為包含約1.6 kb的CNGB3基因5』 -NTR的分離啟動子。在具體實施方案中，啟動子具有序列SEQ ID NO: 2。
[0060]在另一實施方案中，本發明提供分離的啟動子，包含(a)衍生自除CNGB3外的基因的增強子序列和(b)約1.4 kb的CNGB3基因5』 -NTR0
[0061]在一個實施方案中，啟動子為分離的啟動子，包含(a)約400 bp的巨細胞病毒(CMV)增強子和(b)約1.4 kb的CNGB3基因5』_NTR。巨細胞病毒(CMV)增強子為衍生自巨細胞病毒的立即早期啟動子。其用於增加轉基因表達。在一個這樣的實施方案中，啟動子包含下列序列:(a) [SEQ ID NO: 3]和(b) [SEQ ID NO: 4]。
[0062]在另一實施方案中，啟動子為分離的啟動子,包含(a)選自CBA啟動子、勞斯肉瘤病毒-RSV啟動子、近側小鼠視蛋白啟動子(mOP)、人G-蛋白-偶聯受體蛋白激酶I啟動子(hGRKl)的啟動子序列；和(b)約1.4 kb的CNGB3基因5』 -NTR0 CBA啟動子為雞-肌動蛋白啟動子和CMV立即-早期增強子的融合物，其允許在視網膜下注射後GFP報導基因在光感受器細胞中穩定表達。Dinculescu, A等，Adeno-associated virus-vector genetherapy for retinal disease (用於視網膜疾病的腺伴隨病毒-載體基因療法).HumanGene Therapy 2005; 16:649-663。RSV啟動子已經被成功用於促進視網膜中的體內轉基因表達。Lei B 等 Molecular Vision 15:1374-1382 (2009)。
[0063]在其它實施方案中，本發明啟動子包含CNGB3基因區段，所述CNGB3基因為人CNGB3 (hCNGB3)基因。在其它實施方案中，CNGB3基因為來自非-人類動物的CNGB3基因。
[0064]在本發明啟動子的一些實施方案中，啟動子能夠促進轉基因在S-視錐、M-視錐和L-視錐細胞中表達。「轉基因」是指包含已經從一種生物分離並且引入不同生物的基因序列的DNA區段。例如，為了治療患有人CNGB3基因突變所導致的色盲的個體，可使用適當的載體給予野生型(即，非-突變的，或功能變體)人CNGB3基因。野生型基因被稱為「轉基因」。在優選的實施方案中，轉基因為編碼通常在視網膜視錐細胞中表達的蛋白的基因的野生型形式。在一個這樣的實施方案中，轉基因衍生自人基因。在第一個具體實施方案中，啟動子能夠促進CNGB3核酸在S-視錐、M-視錐和L-視錐細胞中表達。在第二個具體實施方案中，啟動子能夠促進CNGA3核酸在S-視錐、M-視錐和L-視錐細胞中表達。在第三個具體實施方案中，啟動子能夠促進GNAT2核酸在S-視錐、M-視錐和L-視錐細胞中表達。在這三個具體實施方案中，CNGB3、CNGA3或GNAT2優選人CNGB3、CNGA3或GNAT2.在另一個方面，本發明提供這樣的啟動子，其為PR2.1啟動子的縮短形式(參見例如，實施例1)，其可任選包含額外的增強子序列。這樣的啟動子具有更好地適應AAV載體包裝能力的優點，因此提供優勢，例如，改善的產率、較低的空-滿顆粒比率和較高的載體侵染性。在一些實施方案中，這些啟動子通過截短PR2.1的5』-末端同時保留500 bp核心啟動子和600 bp基因座控制區(LCR)完整而產生。在一些這樣的實施方案中，截短的長度選自約300 bp,500 bp和1,100 bp (分別參見，例如，PRl.7、PRl.5和PRl.1，如在實施例1中所描述)。在一個具體實施方案中，本發明提供縮短的啟動子，其包含添加至PRl.1 5』-末端的CMV增強子。在本發明其它實施方案中，本發明提供包含上文所述其它類型的增強子序列(其被加入到縮短形式PR2.1啟動子)的啟動子。
[0065]表汰盒
在另一個方面，本發明提供轉基因表達盒，其包括(a)本發明的啟動子；(b)選自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸；和(c)最小調控元件。本發明啟動子包括上文討論的啟動子。
[0066]「CNGB3核酸」指包含CNGB3基因或其部分或CNGB3基因的功能變體或其部分的核酸。相似地，「CNGA3核酸」指包含CNGA3基因或其部分或CNGA3基因的功能變體或其部分的核酸，「GNAT2核酸」指包含GNAT2基因或其部分或GNAT2基因的功能變體或其部分的核酸。基因的功能變體包括具有微小變化，例如，沉默突變、單核苷酸多態性、錯義突變和其它不顯著改變基因功能的突變或缺失的基因變體。
[0067]在某些實施方案中，核酸為人核酸(即衍生自人CNGB3、CNGA3或GNAT2基因的核酸)。在其它實施方案中，核酸為非-人核酸(即衍生自非-人CNGB3、CNGA3或GNAT2基因的核酸)。
[0068]「最小調控元件」為基因在靶細胞中有效表達所必需的調控元件。這樣的調控元件可包括，例如，啟動子或增強子序列、便於DNA片段插入質粒載體中的多聚接頭序列以及負責內含子剪接和mRNA轉錄物多腺苷酸化的序列。在最近的用於色盲的基因療法治療的實例中，表達盒包括多腺苷酸化位點的最小調控元件、剪接信號序列和AAV末端反向重複。參見，例如，Komaromy等。本發明表達盒還可任選包括基因有效併入祀細胞非必需的額外調控元件。
[0069] 載體
本發明還提供包含前述部分所討論的任一表達盒的載體。在一些實施方案中，載體為包含表達盒序列的寡核苷酸。在具體實施方案中，寡核苷酸的遞送可通過以下實現:體內電穿孔(參見，例如，Chalbergj TWj 等 phiC31 integrase confers genomicintegration and long-term transgene expression in rat retina (在大鼠視網膜中phiC31整合酶賦予基因組整合和長期轉基因表達).1nvestigative Ophthalmology&Visual Science, 46，2140 - 2146 (2005)(下文中 Chalberg 等，2005))或電子雪崩轉染(參見，例如，Chalbergj TWj 等 Gene transfer to rabbit retina with electronavalanche transfection (用電子雪崩轉染將基因轉移至兔視網膜).1nvestigativeOphthalmology &Visual Science, 47，4083 - 4090 (2006)(下文中 Chalberg 等，2006)) ο在進一步的實施方案中，載體為DNA-緻密化(compacting)肽(參見，例如，Farjoj Rj 等 Efficient non-viral ocular gene transfer with compacted DNAnanoparticles (使用緻密DNA毫微粒的有效非-病毒眼部基因轉移).PLoS ONE, 1，e38 (2006)(後文中Farjo等，2006)，其中使用CK30，一種包含偶聯至聚乙二醇的半胱氨酸殘基並且隨後為30個賴氨酸的肽，將基因轉移至光感受器)、具有細胞穿透性質的月太(參見 Johnson，LNj 等，Cell-penetrating peptide for enhanced delivery ofnucleic acids and drugs to ocular tissues including retina and cornea (用於提高核酸和藥物遞送至眼部組織包括視網膜和角膜的細胞-穿透肽).Molecular Therapy,16(1)，107 - 114 (2007)(下文中 Johnson 等，2007)，Barnett, EMj 等 Selectivecell uptake of modified Tat peptide-fluorophore conjugates in rat retina inex vivo and in vivo models (修飾的Tat肽-焚光綴合物在大鼠視網膜體外和體內模型中的選擇性細胞攝取).Investigative Ophthalmology & Visual Science, 47，2589 - 2595 (2006)(下文中Barnett等，2006)，Cashmanj SM，等 Evidence of proteintransduction but not intercellular transport by proteins fused to HIV tat inretina cell culture and in vivo (與HIV tat融合的蛋白在視網膜細胞培養物中和體內蛋白轉導而非細胞間轉運的證據).Molecular Therapy, 8，130 - 142 (2003)(下文中 Cashman 等，2003)，Schorderetj DFj 等 D-TAT transporter as an ocular peptidedelivery system (作為眼部肽遞送系統的 D-TAT 運載體).Clinical and ExperimentalOphthalmology, 33，628 - 635 (2005)(下文中 Schorderet 等，2005)，Kretzj A，等.HSV-1 VP22 augments adenoviral gene transfer to CNS neurons in the retina andstriatum in vivo (HSV-1 VP22體內增加腺病毒基因轉移至視網膜和紋狀體中的CNS神經兀).Molecular Therapy, 7，659 - 669 (2003)(下文中 Kretz 等 2003)，例如至眼部細胞的肽遞送)，或DNA-包封脂複合物(Iipoplex)、polyplex、脂質體或免疫脂質體(參見例如，Zhang，Y，等 Organ-specific gene expression in the rhesus monkeyeye following intravenous nonviral gene transfer (靜脈內非病毒基因轉移後稱猴眼中的器官-特異性基因表達).Molecular Vision, 9，465 - 472 (2003)(下文中Zhang 等 2003)，Zhuj C，等 Widespread expression of an exogenous gene in theeye after intravenous administration.(靜脈內給予後外源基因在眼中的廣泛表達)Investigative Ophthalmology & Visual Science, 43, 3075 - 3080 (2002)(下文中 Zhu等 2002), Zhu, C.,等 Organ-specific expression of the IacZ gene controlled bythe opsin promoter after intravenous gene administration in adult mice (成年小鼠中靜脈內基因給予後視蛋白啟動子控制的IacZ基因的器官-特異性表達).Journalof Gene Medicine, 6，906 - 912.(2004)(下文中 Zhu 等 2004))。
[0070]在優選的實施方案中，載體為病毒載體，例如衍生自腺伴隨病毒、腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒(HSV))的載體。參見例如，Howarth。在最優選的實施方案中,載體為腺伴隨病毒(AAV)載體。
[0071]目前已經鑑定了多種腺伴隨病毒(AAV)血清型，包括12種人血清型(AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVlI 和 AAV12)和多於 100 種的非人靈長類血清型。Howarth JL等，Using viral vectors as gene transfer tools (使用病毒載體作為基因轉移工具).Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010)(下文中Howarth等)。在其中載體為AAV載體的本發明實施方案中，AAV載體的末端反向重複(ITR)的血清型可選自任何已知的人或非人AAV血清型。在優選的實施方案中，AAV載體的AAV ITR血清型選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVIO、AAV11 和 AAV12。此外，在其中載體為AAV載體的本發明實施方案中，AAV載體的衣殼序列血清型可選自任何已知的人或動物AAV血清型。在一些實施方案中，AAV載體的衣殼序列血清型選自AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVlI和AAV12。在優選的實施方案中，衣殼序列的血清型為AAV5。在一些其中載體為AAV載體的實施方案中，使用假分型(pseudotyping)方法，其中一種ITR血清型的基因組被包裝入不同血清型衣殼中。參見例如，Zolutuhkin S.等Production and purification of serotype I, 2, and 5 recombinant adeno-assiciatedviral vectors (血清型1、2和5重組腺伴隨病毒載體的生產和純化).Methods 28(2):158-67 (2002)。在優選的實施方案中，AAV載體的AAV ITR血清型和AAV載體的衣殼序列血清型獨立地選自 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVll 和AAV12。
[0072]在一些其中載體為rAAV載體的本發明實施方案中，使用突變型衣殼序列。在本發明中可使用突變型衣殼序列，以及其它技術例如合理誘變(rational mutagenesis)、革巴向肽工程、嵌合顆粒的產生、文庫和定向進化方法和免疫逃避修飾，以優化AAV載體，用於例如達到免疫逃避和增強治療輸出的目的。參見例如，Mitchell A.M.等AAV』 s anatomy:Roadmap for optimizing vectors for translational success (AAV 剖析:為番羽譯成功優化載體的路線圖).Curr Gene Ther.10(5): 319-340。
[0073]製備本發明的核酸
本發明的核酸分子(包括，例如，啟動子、CNGB3核酸、CNGA3核酸、GNAT2核酸或調控元件)可使用標準分子生物學技術分離。使用目的核酸序列的全部或部分作為雜交探針，核酸分子可使用標準雜交和克隆技術(例如，如Sambrook, J., Fritsh, E.F.，和Maniatis,T.Molecular Cloning.A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊).第 2版，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y.，1989 中所述)分離。
[0074]用於本發明方法的核酸分子也可使用合成的寡核苷酸引物(基於目的核酸分子序列設計)通過聚合酶鏈反應(PCR)分離。本發明方法使用的核酸分子可使用cDNA、mRNA或備選地基因組DNA (作為模板)和適當的寡核苷酸引物根據標準PCR擴增技術擴增。
[0075]此外，目的核苷酸序列相應的寡核苷酸也可使用標準技術化學合成。已經知道多種化學合成多聚脫氧核苷酸的方法，包括固相合成，其已經在可市售獲得的DNA合成儀上自動化(參見例如，Itakura等，美國專利號4，598，049; Caruthers等，美國專利號
4,458,066;和Itakura，美國專利號4，401，796和4，373，071，通過引用結合到本文中)。用於設計合成寡核苷酸的自動化方法是可得到的。參見例如，Hoover, D.Μ.& Lubowski,J.Nucleics Research, 30(10): e43 (2002)。
[0076]本發明許多實施方案涉及CNGB3核酸、CNGA3核酸或GNAT2核酸。本發明一些方面和實施方案涉及其它核酸，例如分離的啟動子或調控元件。核酸可為，例如，cDNA或化學合成的核酸。cDNA可例如,通過使用聚合酶鏈反應(PCR)擴增或通過篩選合適的cDNA文庫獲得。備選地，核酸可化學合成。
[0077]IV.本發明的方法和藥盒 治療方法
本發明提供用於治療影響視網膜視錐細胞的基因突變、置換或缺失相關疾病的方法，其中所述方法包括給予需要此種治療的受試者包含一種本發明啟動子的載體，從而治療受試者。在一個實施方案中，所述疾病影響視網膜色素上皮(PRE)。在一個具體實施方案中，所述疾病為色盲。影響視網膜視錐細胞的基因突變、置換或缺失相關的其它疾病包括色盲、Leber先天性黑蒙、視錐-視杆營養不良、黃斑病變、年齡相關性黃斑變性和色素性視網膜炎(包括X-連鎖色素性視網膜炎)。
[0078]本發明進一步提供用於治療色盲的方法，包括給予需要此種治療的受試者任一本發明載體，從而治療受試者。
[0079]待通過本發明方法治療的「受試者」可意指人或非-人動物。「非人動物」包括任何脊椎或無脊椎生物。在一些實施方案中，非人動物為視網膜疾病或特別是色盲的動物模型。參見例如，Pang等、Alexander等、Komaromy等。多種大型動物模型可用於視網膜中AAV-介導的基於基因的療法研究。Stieger K.等 AAV-mediated gene therapy for retinaldisorders in large animal models (大型動物模型中用於視網膜病症的AAV-介導的基因療法).1LAR J.50(2): 206-224 (2009)。本發明啟動子在上文中描述。「治療」疾病(例如，色盲)意指減輕、預防或延遲至少一種疾病病徵或症狀的發生。疾病的「病徵」是可被其他人觀察到的或通過客觀方法例如視網膜電描記法或行為測試測量的疾病表現。疾病的「症狀」為受試者主觀感知的疾病特徵。
[0080]在這兩種治療方法的任一種中，載體可為本領域已知的任何類型的載體。在一些實施方案中，載體為非-病毒載體，例如裸露的DNA質粒、寡核苷酸(例如反義寡核苷酸、小分子RNA (siRNA)、雙鏈寡聚脫氧核苷酸或單鏈DNA寡核苷酸)。在涉及寡核苷酸載體的具體實施方案中，遞送可通過體內電穿孔(參見例如，Chalberg等，2005)或電子雪崩轉染(參見例如，Chalberg等2006)實現。在進一步的實施方案中,載體為可任選包封在水溶性聚合物中的樹枝狀大分子(dendrimer)/DNA複合體、DNA-緻密化肽(參見例如,Farjo等2006，其中使用CK30，一種包含偶聯至聚乙二醇的半胱氨酸殘基並且隨後為30個賴氨酸的肽，將基因轉移至光感受器)、具有細胞穿透性質的肽(參見Johnson等2007; Barnett等，2006; Cashman 等，2003; Schorderet 等，2005; Kretz 等 2003,例如至眼部細胞的肽遞送)或DNA-包封脂複合物(Iipoplex)、polyplex、脂質體或免疫脂質體(參見例如，Zhang等2003;Zhu等2002 ;Zhu等2004)。在許多額外的實施方案中，載體為病毒載體，例如衍生自腺伴隨病毒、腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒(HSV))的載體。參見例如，Howarth。在優選的實施方案中，載體為腺伴隨病毒(AAV)載體。
[0081]在本發明的治療方法中，載體的給予可通過本領域已知的任何方法實現。在優選的實施方案中，通過視網膜下注射給予。在某些實施方案中，視網膜下注射優先遞送至一個或多個其中視錐密度特別高的區域(例如，視盤上面的毯區(tapetal zone))。在其它實施方案中，通過眼內注射、玻璃體內注射或靜脈內注射給予。將載體給予視網膜可為單邊的或雙邊的，並且可使用或不使用全身麻醉完成。
[0082]在本發明的治療方法中，所遞送載體的體積可基於接受治療的受試者的特徵(例如受試者的年齡和載體遞送區域的體積)確定。已經知道個體間眼睛大小和視網膜下空間的體積不同，並且可隨著受試者的年齡改變。在其中經視網膜下給予載體的實施方案中，可選擇載體體積，目的是覆蓋視網膜下空間的全部或一定比例，或使得遞送特定數量的載體基因組。
[0083]在本發明的治療方法中，給予載體的濃度可根據生產方法而不同，並且可基於確定為對特定給藥途徑治療有效的濃度進行選擇或優化。在一些實施方案中，每毫升的載體基因組中的濃度(vg/ml)選自約 IO8 vg/ml、約 IO9 vg/ml、約 101° vg/ml、約 IO11 vg/ml、約IO12 vg/ml、約IO13 vg/ml和約IO14 vg/ml。在優選的實施方案中，所述濃度在101° vg/ml-1O13 vg/ml 的範圍內， 以約 0.1 mL、約 0.2 mL、約 0.4 mL、約 0.6 mL、約 0.8 mL 和約 1.0HlL的體積通過視網膜下注射或玻璃體內注射遞送。
[0084]MA
本發明還提供藥盒。在一方面，本發明藥盒包括(a)包含任一本發明啟動子的載體和
(b)其使用說明書。在另一方面，本發明藥盒包括(a)任一本發明的載體和(b)其使用說明書。本發明啟動子和載體如上文所述。在一些實施方案中，本發明載體可為本領域已知的任何類型的載體，包括非-病毒或病毒載體，如上文所述。在優選的實施方案中，載體為病毒載體，例如衍生自腺伴隨病毒、腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒、牛痘/痘病毒或皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒(HSV))的載體。在最優選的實施方案中，載體為腺伴隨病毒(AAV)載體。
[0085]隨藥盒提供的說明書可描述啟動子可如何併入載體內或載體可如何給予用於治療目的，例如，用於治療影響視網膜視錐細胞的基因突變、置換或缺失相關的疾病。在其中使用藥盒用於治療目的的一些實施方案中，說明書包括關於推薦劑量和給藥途徑的細節。
[0086]製備重組腺伴隨病毒載體(AAV載體)的方法
本發明還提供製備重組腺伴隨病毒(rAAV)載體的方法，包括將任一本發明啟動子(上文中描述)和選自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸(也在上文中描述)插入腺伴隨病毒載體中。在一些實施方案中，核酸為人核酸，即，衍生自人CNGB3、CNGA或GNAT基因的核酸，或其功能變體。在備選的實施方案中，核酸為衍生自非-人基因的核酸。
[0087]在製備本發明提供的rAAV載體的方法中，所述AAV載體的衣殼序列血清型和ITR 血清型獨立地選自 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVll和AAV12。因此，本發明包括使用假分型方法的載體，其中將一種ITR血清型的基因組包裝入不同血清型衣殼中。參見例如，Daya S.和Berns, K.1., Gene therapyusing adeno-associated virus vectors (使用腺伴隨病毒載體的基因療法).ClinicalMicrobiology Reviews, 21(4): 583-593 (2008)(下文中 Daya 等)。此外，在一些實施方案中，衣殼序列為突變型衣殼序列。
[0088]AAV 載體
AAV載體衍生自腺伴隨病毒，其具有這樣的名字是由於最初被描述為腺病毒製備物的汙染物。AAV載體提供多種眾所周知的超過其它類型載體的優點:野生型毒株感染人和非人靈長類而無疾病或有害作用跡象；AAV衣殼顯示非常低的免疫原性以及允許嚴格的病毒純化和濃縮方法的高化學和物理穩定性；AAV載體轉導導致有絲分裂期後、不分裂細胞中持續的轉基因表達，並且提供長期的功能獲得；以及AAV亞型和變體的多樣性提供靶向選擇組織和細胞類型的可能性。Heilbronn R & Weger S，Viral Vectors for GeneTransfer: Current Status of Gene Therapeutics (用於基因轉移的病毒載體:基因療法現狀)，載於M.Schafer-Korting (主編)，Drug delivery, Handbook of ExperimentalPharmacology (藥理學實驗手冊)，197: 143-170 (2010)(下文中 Heilbronn)。AAV 載體的主要限制為，對於包含單鏈DNA的常規載體AAV僅提供有限的轉基因能力(〈4.9 kb)。
[0089]AAV為無包膜的、小的、包含單鏈DNA的病毒，被直徑20 nm的二十面體衣殼殼體化。人血清型AAV2用於大多數的早期AAV研究。Heilbronn。其包含4.7 kb線性的單鏈DNA基因組，所述基因組具有兩個開放閱讀框r印和cap ( 「r印」用於複製，「cap」用於衣殼)。Rep編碼四個重疊的非結構蛋白:Rep78、R印68、R印52和R印40。AAV生命周期的大多數步驟，包括AAV DNA複製在髮夾-結構的末端反向重複(ITR)處的起始(生產AAV載體的必需步驟)，需要R印78和R印69。cap基因編碼三種衣殼蛋白，VPl、VP2和VP3。Rep和cap兩側為145 bp ITR0 ITR包含DNA複製起點和包裝信號，並且其用於介導染色體整合。ITR通常為AAV載體構建中唯一保持的AAV元件。
[0090]為了完成複製，AAV必須與輔助病毒共同感染進入祀細胞。Grieger JC & SamulskiRJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development,production, and clinical applications (腺伴隨病毒作為基因療法載體:載體開發、生產和臨床應用).Adv Biochem Engin/Biotechnol 99:119-145 (2005)。典型地，輔助病毒為腺病毒(Ad)或單純皰疹病毒(HSV)。在不存在輔助病毒的情況下，AAV可通過整合到人染色體19上的位點建立潛伏性感染。Ad或HSV感染潛伏性感染AAV的細胞將拯救整合的基因組並開始生產性感染。輔助功能(helper function)所需的四個Ad蛋白為E1A、E1B、E4和E2A。此外，還需要Ad病毒-相關(VA)RNA的合成。皰疹病毒也可用作生產性AAV複製的輔助病毒。已經發現編碼解旋酶-引發酶複合物(UL5、UL8和UL52)和DNA-結合蛋白(UL29)的基因足以介導HSV輔助作用。在一些使用rAAV載體的本發明實施方案中，輔助病毒為腺病毒。在其它使用rAAV載體的實施方案中，輔助病毒為HSV。
[0091]制各重組AAV (rAAV)載體
本發明rAAV載體的生產、純化和表徵可使用許多本領域已知方法中的任一種進行。對於實驗室-規模生產方法的綜述，參見，例如，Clark RK, Recent advances inrecombinant adeno-associated virus vector production (重組腺伴隨病毒載體生產的最新進展).Kidney Int.61s:9-15 (2002) ; Choi VW 等，Production ofrecombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use (用於體外和體內用途的重組腺伴隨病毒載體的生產).Current Pro toco Is in MolecularBiology 16.25.1-16.25.24 (2007)(下文中 Choi 等)；Grieger JC & SamulskiRJj Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development,production, and clinical applications (腺伴隨病毒作為基因療法載體:載體開發、生產和臨床應用).Adv Biochem Engin/Biotechnol 99:119-145 (2005)(下文中 Grieger
&Samulski) ；Heilbronn R & Weger S， Viral Vectors for Gene Transfer: CurrentStatus of Gene Therapeutics (用於基因轉移的病毒載體:基因療法現狀)，載於M.Schafer-Korting (主編)，Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology(實驗藥理學手冊)，197: 143-170 (2010)(下文中 Heilbronn) ；Howarth JL 等，Usingviral vectors as gene transfer tools (使用病毒載體作為基因轉移工具).Cell BiolToxicol 26:1-10 (2010)(下文中Howarth)。下文所述生產方法意在作為非限制性實例。
[0092]AAV載體生產可通過包裝質粒的共轉染完成。Heilbronn。細胞系提供缺失的AAV基因rep和cap以及所需的輔助病毒功能。腺病毒輔助基因，VA-RNA、E2A和E4與AAV rep和cap基因在兩個分開的質粒上或在單個輔助構建體上一起轉染。還轉染重組AAV載體質粒，其中AAV衣殼基因置換為被ITR框入的轉基因表達盒(包含目的基因例如CNGB3核酸、啟動子和最小調控元件)。這些包裝質粒通常轉染進293細胞，一種組成型表達其餘所需Ad輔助基因ElA和ElB的人細胞系。這導致攜帶目的基因的AAV載體的擴增和包裝。
[0093]現已鑑定了 AAV的多種血清型，包括12種人血清型和超過100種非人靈長類血清型。Howarth等。本發明AAV載體可包含衍生自AAV任何已知血清型的衣殼序列。如本文所使用的，「已知的血清型」包括可使用本領域已知方法生產的衣殼突變型。這樣的方法，包括，例如，病毒衣殼序列的遺傳操作、不同血清型衣殼區所暴露表面的結構域交換和使用技術例如標記獲救產生AAV嵌合`體。參見Bowles等Marker rescue of adeno-associatedvirus (AAV) capsid mutants: A novel approach for chimeric AAV production (腺伴隨病毒(AAV)衣殼突變型的標記獲救:用於嵌合AAV生產的新方法).Journal ofVirology, 77(1): 423-432 (2003)，以及其中引用的參考文獻。此外，本發明AAV載體可包含衍生自AAV任何已知血清型的ITR。ITR優先衍生自人血清型AAV1-AAV12中的一種。在本發明一些實施方案中，使用假分型方法，其中將一種ITR血清型的基因組包裝到不同血清型衣殼中。
[0094]本發明中使用的衣殼序列優先衍生自人血清型AAV1-AAV12中的一種。已經證明包含AAV5血清型衣殼序列的重組AAV載體在體內靶向視網膜細胞。參見，例如，Komaromy等。因此，在本發明優選實施方案中，AAV載體衣殼序列的血清型為AAV5。在其它實施方案中，AAV 載體衣殼序列的血清型為 AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVll或AAV12。即使當衣殼序列的血清型不天然靶向視網膜細胞時，可使用其它特異性組織靶向的方法。參見，Howarth等。例如，通過病毒衣殼序列(特別是在AAV三維結構的環出(looped out)區域)的遺傳操作，或通過不同血清型衣殼區域所暴露表面的結構域交換，或通過使用技術例如標記獲救產生AAV嵌合體,可直接IE向重組AAV載體。參見Bowles等Marker rescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: A novel approachfor chimeric AAV production (腺伴隨病毒(AAV)衣殼突變型的標記獲救:用於嵌合AAV生產的新方法).Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003)，以及其中引用的參考文獻。
[0095]Choi等提供了一種用於生產、純化和表徵重組AAV (rAAV)載體的可能方案。一般包括下列步驟:設計轉基因表達盒、設計用於靶向特異性受體的衣殼序列、產生無腺病毒rAAV載體、純化和滴度(titer)。這些步驟在下文概述,在Choi等中詳述。 [0096]轉基因表達盒可為作為假-雙鏈轉基因包裝的單鏈AAV (ssAAV)載體或「二聚」或自身互補AAV (scAAV)載體。Choi等、Heilbronn、Howarth。由於需要將單鏈AAV DNA轉化為雙鏈DNA，使用傳統的ssAAV載體通常導致基因表達起始緩慢(數日至數周直至達到轉基因表達穩定期)。相比之下，scAAV載體顯示在轉導休眠細胞後數小時內基因表達起始，數日內達到穩定期。Heilbronn。然而,scAAV載體的包裝能力約為傳統ssAAV載體的一半。Choi等。備選地，轉基因表達盒可在兩個AAV載體之間分開，這允許遞送較長的構建體。參見例如，Daya等。ssAAV載體可如下構建:用限制性內切核酸酶消化適當的質粒(例如，包含hCNGB3基因的質粒)以除去rep和cap片段，以及凝膠純化包含AAVwt-1TR的質粒骨架。Choi等。隨後，可將所需轉基因表達盒插入適當的限制性位點之間，以構建單鏈rAAV載體質粒。scAAV載體可如Choi等中所描述構建。
[0097]然後，可通過雙重CsCl梯度分級，純化pTR前病毒質粒和適當的AAV輔助質粒以及pXX6 Ad輔助質粒的大規模質粒製備物(至少I mg)。Choi等。適當的AAV輔助質粒可選自pXR系列，pXRl_pXR5，其分別允許將AAV2 ITR基因組交叉-包裝(cross-packaging)到AAV血清型1-5的衣殼中。適當的衣殼可基於衣殼靶向目的細胞的效率選擇。例如，在本發明優選的實施方案中，rAAV載體的衣殼序列血清型為AAV5，這是因為已知該衣殼類型有效靶向視網膜細胞。可使用已知的改變基因組(即，轉基因表達盒)長度和AAV衣殼的方法改善表達和/或基因至特定細胞類型(例如，視網膜視錐細胞)的轉移。參見，例如，YangGS, Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus:Effects of viral capsid and genome size (使用腺伴隨病毒的病毒-介導性鼠視網膜轉導:病毒衣殼和基因組大小的影響).Journal of Virology, 76(15): 7651-7660。
[0098]接著，用pXX6輔助質粒、rAAV載體質粒和AAV輔助質粒轉染293細胞。Choi等。隨後分級的細胞裂解物經受rAAV純化的多步過程，然後CsCl梯度純化或肝素瓊脂糖柱純化。rAAV病毒體的生產和定量可使用斑點-印跡測定確定。rAAV在細胞培養物中的體外轉導可用於驗證病毒的侵染性和表達盒的功能性。
[0099]除了 Choi等描述的方法外，在本發明上下文中，可使用多種其它用於生產AAV的轉染方法。例如，瞬時轉染方法，包括依賴磷酸鈣沉澱方案的方法，為可用的。
[0100]除了用於生產rAAV載體的實驗室-規模方法外，本發明可使用本領域已知用於AAV載體的生物反應器-規模製造的技術，包括，例如，Heilbronn; Clement, N.等Large-scale adeno-associated viral vector production using a herpesvirus-basedsystem enables manufacturing for clinical studies (使用基於皰疫病毒的系統的大規模腺伴隨病毒載體生產使得能夠進行用於臨床研究的製造).Human Gene Therapy,20: 796-606。[0101]本發明通過下列實施例進一步說明，所述實施例不應認為是進一步限制。所有圖以及本申請各處引用的所有參考文獻、專利和出版專利申請的內容以及附圖通過引用以其整體明確地結合到本文中。
實施例
[0102]實施例1:較短形式PR2.1啟動子的產生和測試
先前的研究者基於藍視錐單色視者中存在的6個不同缺失的定位(0.6-55 kb)產生了截短的人紅/綠視錐視蛋白啟動子。Wang, Y.,等A locus control region adjacentto the human red and green pigment genes (臨近人紅和綠色素基因的基因座控制區).Neuron 9: 429-440 (1992); Nathans, J.,等Molecular genetics of human bluecone monochromacy (人藍視維單色視的分子遺傳學).Science 245: 831-838 (1989);Shaaban, S.等 Functional analysis of the promoters of the human red and greenvisual pigment genes (人紅和綠視覺色素基因啟動子的功能分析)；IntegrativeOpthalmology & Visual Science: 39(6): 885-896 (1998).該截短的紅/綠視蛋白啟動子在圖1中不出。
[0103]Komaromy等中使用了重組腺伴隨病毒(rAAV)載體，如圖2所示。該載體衍生自人血清型5腺伴隨病毒，因此包含AAV5的衣殼序列。其包裝了包含2064 bp的PR2.1視錐紅視蛋白啟動子(PR2.1)和2430 bp的人CNGB3 (hCNGB3)序列的表達盒。此外，表達盒包含SV40多聚(A)和剪接信號序列，兩側為AAV2末端反向重複(ITR)。表達盒的總大小為5231bp，這遠遠超出AAV載體的正常包裝能力。在兩個生產運行中，發現與包裝3843 bphAAT表達盒(遠遠小於hCNGB3表達盒的長度(5231 bp))的rAAVl_hAAT的生產運行相比，rAAV5-PR2.l_hCNGB3的產率約為1/5-1/3。使用銀染和電子顯微術(EM)還觀察到比使用相同的HSV互補系統製造的rAAVl-hAAT高的空-滿顆粒比率。PR2.1啟動子的另一個限制為其促進hCNGB3轉基因在紅/綠 視錐中的表達，而在藍視錐中很少表達。
[0104]在本實施中，創建並測試了縮短形式的PR2.1啟動子。
[0105]材料和方法
通過從PR2.1的5』 -末端開始進行截短，縮短PR2.1啟動子。PR2.1的500 bp核心啟動子和600 bp基因座控制區(LCR)保持完整。產生了 3個縮短形式的PR2.1啟動子:PRl.7、PRl.5 和 PRl.1。其分別通過在 5，末端截短 PR2.1 約 300 bp,500 bp 和 I, 100 bp而產生。將CMV增強子加入PRl.1的5』末端，產生雜合啟動子。產生包含這些啟動子的每個的前病毒質粒，如圖3所示。這些前病毒質粒(P)包含AAV末端重複(TR)、合成的啟動子(PR2.Ι-syn)或其截短(有或無CMV增強子(CMVenh))和綠色螢光蛋白(GFP)轉基因。構建下列4個前病毒質粒並測序:
(1)pTR-PR2.1syn-GFP
(2)pTR-PRl.8-GFP
(3)pTR-PRl.6-GFP
(4)pTR-CMVenh-PRl.1-GFP。
[0106]為了構建pTR_PR2.lsyn-GFP,首先通過用enh_hGFP序列置換CBA和hRSl序列從 pTR-CBA-hRSl 構建親本質粒 pTR_CMVenh_hGFP。人 GFP (hGFP) DNA 序列從pTR-CBA-hGFP(—種包含hGFP開放閱讀框的質粒)用兩末端均具有內切核酸酶限制位點(Not I和BspHI)的寡核苷酸引物PCR擴增，用Notl/BspHI消化，連接到已經用NotI/NcoI消化以除去所有不必要DNA序列(包括雞β肌動蛋白啟動子和hRSl (但非CMV增強子))的pTR-CBA-hRSl質粒中。所得質粒pTR_CMVenh_hGFP包含CMV增強子、hGFP開放閱讀框(0RF)，和AAV2 ITR兩側的SV40多聚(A)序列。PR2.1 DNA序列根據人紅視錐視蛋白 5，DNA 序列合成(Wang Y.等，A locus control region adjacent to the humanred and green visual pigment genes (臨近人紅和綠色視覺色素基因的基因座控制區)，Neuron,第9卷，第429-440頁，1992)。合成的PR2.1由跨越-4564至-3009的鹼基連接到鹼基-496至O組成，並且包含L和N視蛋白基因兩者在人中表達所必需的LCR (KomaromyAM 等，Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters inrecombinant AAV (使用重組AAV中的人視錐視蛋白啟動子將基因表達祀向至視錐)，GeneTherapy,第15卷，第1049-1055頁，2008)。此外，將97個鹼基對的SV40剪接供體/剪接受體(SD/SA)連接到PR2.1啟動子的末端。將合成的包含SD/SA序列的PR2.1插入PJ206克隆載體中，產生pJ206-PR2.1syn0 PR2.1syn DNA序列，包括SV40 SD/SA序列，通過HindIII/Acc65I消化從pJ206_PR2.1syn釋放，並插入已經用HindIII/Acc65I消化以除去不必要CMV增強子序列的pTR-CMVenh-hGFP，產生質粒pTR_PR2.lsyn_hGFP。
[0107]為了構建具有較短形式PR2.1啟動子的質粒，從PJ206-PR2.1 syn PCR擴增從PR2.1的5』末端截短300 bp,500 bp或1，100 bp的PR2.1序列。設計了 4個寡核苷酸引物:
1)PR 右-Hind:
【權利要求】
1.一種分離的啟動子，其包含約1.8 kb的CNGB3基因的5』 -NTR0
2.權利要求1的啟動子，其包含序列SEQID NO:1。
3.一種分離的啟動子，其包含約1.6 kb的CNGB3基因的5』 -NTR0
4.權利要求2的啟動子，其包含SEQID NO: 2。
5.一種分離的啟動子，其包含 約400 bp的巨細胞病毒(CMV)增強子和 約 1.4 kb 的 CNGB3 基因的 5』 -NTR0
6.權利要求5的啟動子，其包含下列序列: SEQ ID NO: 3所示的巨細胞病毒(CMV)增強子和 SEQ ID NO: 4 所示的 CNGB3 基因的 5』 -NTR0
7.權利要求1、3或5中任一項的啟動子，其中所述CNGB3基因為人CNGB3基因。
8.權利要求1-7中任一項的啟動子，其中所述啟動子能夠促進S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞中的CNGB3表達。
9.權利要求1-7中任一項的啟動子，其中所述啟動子能夠促進S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞中的CNGA3表達。
10.權利要求1-7中任一項的啟動子，其中所述啟動子能夠促進S-視錐細胞、M-視錐細胞和L-視錐細胞中的GNAT2`表達。
11.一種轉基因表達盒，其包含 (a)權利要求1-6中任一項的啟動子； (b)選自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸；和 (c)最小調控元件。
12.—種轉基因表達盒，其包含 (a)權利要求1-4中任一項的啟動子； (b)CNGB3核酸；和 (C)最小調控元件。
13.權利要求11或12的表達盒，其中所述核酸為人核酸。
14.包含權利要求11-13中任一項的表達盒的核酸載體。
15.權利要求14的載體，其中所述載體為腺伴隨病毒(AAV)載體。
16.權利要求15的載體，其中所述AAV載體的衣殼序列血清型和ITR血清型獨立地選自 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVIO、AAV11 和 AAV12。
17.權利要求15的載體，其中衣殼序列為突變型衣殼序列。
18.用於治療影響視網膜視錐細胞的基因突變、置換或缺失相關疾病的方法，其中所述方法包括給予需要此種治療的受試者包含權利1-6中任一項的啟動子的載體，從而治療受試者。
19.權利要求18的方法，其中所述疾病為色盲。
20.用於治療色盲的方法，包括給予需要此種治療的受試者權利要求14-17中任一項的載體，從而治療受試者。
21.權利要求18-20中任一項的方法，其中所述載體經視網膜下給予。
22.權利要求18的方法，其中所述疾病影響視網膜色素上皮(RPE)。
23.一種藥盒，其包含 (a)包含權利要求1-6中任一項的啟動子的載體，和 (b)其使用說明書。
24.—種藥盒，其包含 (a)權利要求14-17中任一項的核酸載體,和 (b)其使用說明書。
25.製備重組腺伴隨病毒(rAAV)載體的方法，其包括將權利要求1_10的啟動子中的任一個和選自CNGB3核酸、CNGA3核酸和GNAT2核酸的核酸插入腺伴隨病毒載體。
26.權利要求25的方法，其中所述核酸為人核酸。
27.權利要求25或權利要求26的方法，其中所述AAV載體的衣殼序列血清型和ITR血清型獨立地選自 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVll 和AAV12。
28.權利要求25的 方法，其中衣殼序列為突變型衣殼序列。
【文檔編號】C12N15/12GK103608455SQ201280012016
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年1月6日 優先權日:2011年1月7日
【發明者】葉國傑, J.D.丘萊 申請人:應用遺傳科技公司