酶底物,合成方法和用途的製作方法

2023-12-12 22:12:42 3

專利名稱：酶底物,合成方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的一族酶底物及其用途，特別是檢測微生物的用途。
細菌的檢測和鑑定在藥物或食品工業中是非常重要的，因為已知這種生物體不僅證明是病原體，而且也造成某些類型的汙染。
最近為此目的開發的方法利用有色或螢光化合物的應用，並且例如在M.Manafi等人的綜述「微生物學綜述」(Microbiological Reviews)55(3)，pp.335-348，1991或者更近一些時候M.Manafi的De Ware(n)Chemicus，28，pp.12-17，1998中已經描述的這些化合物的應用。
一般能夠分為四組化合物-螢光標記物，例如吖啶橙，該標記物吸附到微生物細胞的核酸上或者蛋白質上時，其產生螢光的增強；-pH-依賴性指示劑，例如吖啶或者7-羥基香豆素，其強度或顏色範圍或螢光根據pH而不同，因此根據微生物的生物化學活性而不同；-對介質的氧化還原性質敏感的化合物，例如亞甲藍，其在還原介質的作用下產生顏色；-酶的有色或螢光底物，在對一種微生物或一族微生物特異性的酶存在下在水解作用下，其分別產生顏色或螢光。
在後一種類中已經描述過一些特別使得檢測β-D-葡糖苷酶或者β-D-半乳糖苷酶的底物，其是微生物特別是腸桿菌科的重要的taxinomic標記物。這些底物中，可以提到水解後產生黃色鄰-硝基苯酚的鄰-硝基苯基衍生物，或者螢光底物，例如螢光素的衍生物或者4-甲基7-羥基香豆素的衍生物，它們產生螢光標記。這些底物相當大的限制性是擴散到培養基中的現象，這使得更難以區別菌落和本底噪聲。
為了解決這一問題，曾使用過其它在水解之後產生不溶產物的底物。這些底物處於細菌菌落周圍而不擴散到培養物載體上，這有利於實驗的說明。
在這些底物中，已經開發了3-吲哚氧基衍生物(參見例如Kodaka等，臨床微生物學雜誌(J.Clin Microbiol.)33，p.199-201，1995或者專利US5358854和US5364767)或者6，7-二羥基香豆素衍生物(參見例如WO97/41138)。首先，困難的合成大大提高了費用，限制大規模工業應用的發展，另外，這些底物對培養基溫育條件敏感。第二，為了發生顏色反應而向培養基中加入鐵-基複合物試劑的必要性對於某些微生物是一個問題，因為其可以幹擾它們的代謝，特別是幹擾所研究的微生物。
本發明描述了沒有上述缺陷的新的一族酶底物，因為這些化合物的合成操作簡單，這些底物在水解之後不溶解，它們不擴散到培養基中並且它們不需要加入複合物試劑例如鐵或者任何特殊的氧化還原條件。
本發明的一個目的是描述一類通式(I)的化合物 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或對位取代，當X代表碳原子時，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解。
本發明中感興趣的酶是其存在提供了檢測和/或鑑定和/或定量一種或多種微生物或者分析物的信息的酶，例如蛋白質，肽或核酸。特別地，所述酶來自osidases家族，例如β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，6-磷酸半乳糖水解酶，α-半乳糖苷酶，α-澱粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，或者氨基己糖苷酶，例如N-乙醯基-β-氨基葡糖苷酶或者N-乙醯基-β-氨基半乳糖苷酶，或者來自酯酶家族，脂酶家族，磷酸酯酶家族，硫酸酯酶家族，DNA酶家族，肽酶家族和蛋白酶家族。優選地，所述酶來自osidases家族，例如β-D-葡糖苷酶，β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶，或者來自硫酸酯酶家族，磷酸酯酶家族或酯酶家族。
選擇R基團作為要檢測的酶的官能團。R是例如α-或β-糖型殘基，例如木糖，葡萄糖，半乳糖，葡糖醛酸或氨基葡糖的衍生物，或者磷酸根，硫酸根，或者其中R6是具有1-16個碳原子的烷基的羧酸根(R6COO-)，核苷酸或肽。優選地，R基團是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖，β-D-葡糖醛酸根，磷酸根，硫酸根或乙酸根。
當R1和R2一起代表稠合的苯環時，是下面的結構(Ia)，其表明R1和R2拓展的結構式 當Y和Z一起代表醚鍵時，是指通式(Ib)中代表的鍵 當Y和Z一起代表硫醚鍵時，是指通式(Ic)中代表的鍵 當Y和Z一起代表任選被芳基或烷基取代的胺鍵時，是指通式(Id)中代表的鍵 其中A代表芳基或烷基。
下面指明的通式(II)，(III)，(IVa)，(IVb)和(IVc)中給出了通式(I)的特定底物 通式(II)，其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環。優選地，R1和R2一起代表不被取代的稠合苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的。優選地，R3和R4代表H，R5代表間位或對位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，優選地，R5代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基，或者乙酸根或硫酸根。 通式(III)，其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環。優選地，R1和R2一起代表不被取代的稠合苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的。優選地，R3和R4代表H，R5代表間位或對位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，優選地，R5代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
通式(IVa)，其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環。優選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的。優選地，R3和R4代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基或者乙酸根或硫酸根。 通式(IVb)，其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環。優選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的。優選地，R3和R4代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基或者乙酸根或硫酸根。 通式(IVc)，其中
A代表芳基或烷基，R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環。優選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的。優選地，R3和R4代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解。特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基，或者乙酸根或硫酸根。
本發明還涉及通式(I)的酶底物的合成方法，其中製備具有通式(V)的中間體 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或對位取代，當X代表碳原子時，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，並且適當地被保護的R基團接枝到羥基上。
特別地，通過糖基化作用，酯化作用或磷酸化作用反應發生接枝。
在糖基化作用的情況下，有必要保護糖的羥基，例如用乙醯基。從相應的α-乙醯溴六糖衍生物獲得β-D-葡糖苷或β-D-半乳糖苷的四乙醯化衍生物。
對於乙醯化衍生物，在接枝之後，在鹼性試劑例如甲醇中的甲醇鈉的存在下，進行糖的羥基的去保護。本領域技術人員特別是通過丙酮中的氫氧化鉀的作用來選擇糖基化條件。
通過在吡啶中在冷卻條件下使通式(V)的衍生物與乙酸酐反應來進行有機酯例如乙酸酯的形成。通過在吡啶/二甲基甲醯胺型溶劑混合物中，任選地在催化劑例如4-二甲基氨基吡啶的存在下，反應醯氯衍生物，進行CH3(CH2)nCOOR型酯的形成。通過在POCl3的存在下在吡啶的存在下處理通式(V)的衍生物來進行磷酸酯的形成。
通過在吡啶中冷卻條件下用氯磺酸處理通式(V)的衍生物來進行硫酸酯的形成。本發明的底物，在磷酸酯和硫酸酯的情況下，是鹽的形式，例如鉀鹽或鈉鹽。
有利地，製備相應於下面結構式(Va)，(Vb)和(Vc)中任一個的中間體 本發明還涉及用於檢測和/或鑑定和/或定量測定至少一種微生物的組合物，其含有至少一種通式(I)的酶底物和用於所述微生物的反應介質。
根據本發明，術語「反應介質」意指使得至少一種微生物的至少一種酶活性發生的介質，例如培養基。
反應介質是固體，半固體或液體。術語「固體介質」意指例如瓊脂培養基。瓊脂是微生物學中用於培養微生物的常規固體培養基，但是也可以使用明膠或瓊脂糖。很多製劑是可獲得的，例如哥倫比亞瓊脂，胰腖豆腖瓊脂，麥氏瓊脂，沙氏瓊脂，本申請人在「培養基技術手冊」(Livrettechnique MILIEU DE CULTURE)中描述的那些，更一般地，在微生物培養基手冊(Handbook of Microbiological Media)(CRC出版)中描述的那些。
有利地，所述反應介質是含有2至40克/升，優選地9至25克/升瓊脂的瓊脂培養基。
本發明的底物可以在寬pH範圍中使用，特別地，在pH5.5和10.0之間，並且有利地在pH6.0和8.5之間。
所述反應介質混合物中還可以含有一種或多種成分，例如胺基酸，蛋白腖，碳水化合物，核苷酸，礦物質，維生素，抗生素，表面活性劑，緩衝液或者磷酸的銨鹽，鈉鹽或金屬鹽。培養基的例子描述於本申請人的下面的專利，EP0656421或WO99/09207。
本發明的另一方面，所述反應介質含有至少兩種酶底物來自本發明一族的第一酶底物和至少一種來自本發明一族的另一種酶底物和/或來自其它底物家族的另一種酶底物。其他底物的酶解產生可檢測信號，其與第一底物產生的信號不同，例如不同的有色或螢光產品，以便能夠證明例如一種或多種微生物的檢測和/或鑑定和/或定量測定。
舉例來說，可以提到下面的組合-對於尿樣品的培養基的根據本發明的β-葡糖醛酸酶底物和X-β-D-葡糖苷(X是5-溴-4-氯-3-吲哚基)(CPS ID2型，bioMerieuz，Marcyl』Etoile，法國)；-對於尿樣品的培養基的根據本發明的β-半乳糖苷酶底物和X-β-D-葡糖苷(法國巴黎CHROMagar公司出售的CHROMagar型定向(商標)，或者英國Hamspshire OXOID公司出售的Oxoid UTI)；-對於大腸埃希氏桿菌和大腸桿菌類的培養基的根據本發明的β-葡糖醛酸酶底物和X-β-D-半乳糖苷(Coli ID型，bioMerieuz，Marcyl』Etoile，法國)；舉例來說，對於酵母和鑑定白色假絲酵母，可以使用根據本發明的氨基己糖苷酶底物。
根據本發明的底物可以加給bioMerieuz(Marcy l』Etoile，法國)出售的並且包括它們的酶底物的全部或部分的介質CSP ID2，SM ID，Albicans ID2，Coli ID和0157H7 ID，還可以加給含有七葉苷例如膽汁七葉苷瓊脂並且有或沒有選擇性試劑的介質。
反應介質中酶底物的濃度在0.02和1克/升之間，有利地在0.03和0.30克/升之間，優選地在0.04和0.10克/升之間。
本發明還涉及包括如上定義的組合物和用於反應介質的容器的診斷試劑盒。術語「容器」意指任何固體載體，例如瓶，管，皿，微量滴定板或者用於自動機器的消耗品，例如API濾槽或VITEK卡(商標名，bioMerieuz，Marcy l』Etoile，法國)。
本發明的另一方面涉及在樣本中檢測和/或鑑定和/或定量測定至少一種微生物的方法，其中使來自樣本的微生物接觸含有通式(I)的酶底物的反應介質，並且檢測所述酶底物水解形成的有色或螢光產物。
通式(I)的底物具有這樣優點，即它們可以獨立於大氣條件用於溫育。因此，通過溫育含有酶底物的反應介質，並且在控制的大氣中例如在需氧，厭氧或微需氧條件下或者在二氧化碳氣下，優選在需氧或微需氧條件下或者在二氧化碳氣下，接種至少一種微生物。
要分析的樣本是臨床樣本，例如唾液，血液，尿液或大便樣品或者任何其它樣本，其分析有助於醫生的診斷。所述樣本也可以是來自食品工業和/或製藥工業的產品樣本或者是食品工業和/或製藥工業的基本產品，需要保證不存在病原體微生物，或者需要計數汙染菌叢或者檢測具體的微生物。所述樣本可以直接或者在預培養步驟之後，例如在食品樣品的情況下，在含有通式(I)的底物的培養基上培養。
本發明中可以鑑定，檢測或定量測定的微生物是細菌，酵母和真菌，特別是屬於下面的種或分類單位的那些腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae)，奈瑟氏球菌科(Nesseriaceae)，Vibrionaceae，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，彎曲桿菌屬(Campylobacter)；細球菌科(Micrococcaceae)，鏈球菌科(Streptococcaceae)，芽胞桿菌屬(Bacillus)，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，李司忒氏菌屬(Listeria)，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)，加德納氏菌屬(Gardnerella)，諾卡氏菌屬(Nocardia)，念珠菌屬(Candida)，隱球菌屬(Cryptococcus)，麴黴屬(Aspergillus)，更特別地大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)，大腸埃希氏桿菌0157H7(E.coli 0157H7)，志賀氏菌屬(Shigella)，沙門氏菌屬(Salmonella)，Proteeae，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，腸球菌(Enterococcus)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，單核細胞增生利斯特氏菌(Listeramonocytogenes)，化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)，酵母，例如白色假絲酵母(Candidaalbicans)，團假絲酵母(Candida glabrata)，熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)，新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)和煙麴黴(Aspergillus fumigatus)。這些微生物可以是需氧的，空氣厭氧的，微需氧的或厭氧的。
本發明的另一方面，酶底物用於檢測一種分析物的反應中，其中利用了酶活性(特別是鹼性磷酸酯酶或β-半乳糖苷酶)，例如利用ELISA型方法檢測抗體或抗原或核酸的反應(參見例如「從理論到實踐的免疫劑量」(″les immunodosages de la théo rie àla pratique″)，並列由Barbier Y.，ACOMEN，Lyon，編著，p109-133，1988)；在證明β-半乳糖苷酶型基因的分子生物學技術中(參見例如「分子克隆實驗手冊」(″Molecular cloning a laboratory manual″)，第二版，Sambrook，Fritsch，Maniatis，冷泉港實驗出版社，16.56和1.85章節，1989)；用於檢測核酸(參見例如「DNA探針」"DNA probes"，第二版，Keller G.H.，Manak，M.M.，Stockton出版，5至9章節，1993)；或者在組織化學，細胞化學或者流式細胞儀技術。
下面的實施例使得有可能詳細解釋本發明的一些優點但是不管怎樣不限制其範圍。
實施例1對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷，PNB-gal產物(1) 從Acros Organics(Geel，比利時)獲得對-萘酚benzein。其它試劑從Sigma Aldrich Chimie(St Quentin Fallavier，法國)獲得。劇烈攪拌下將對-萘酚benzein(1.87毫克，5毫摩爾)溶解於20毫升丙酮。向該溶液加入1.4摩爾/升濃度的5毫升氫氧化鉀，接著加入10毫升丙酮。然後滴加5毫升水以產生深蘭色溶液。向該溶液加入10毫升丙酮中的10毫摩爾α-溴乙醯半乳糖(4.1克)。為了保持pH為大於11的值，在攪拌30分鐘之後第一次加入20摩爾/升的氫氧化鉀溶液2毫升並且在攪拌90分鐘之後第二次加入20摩爾/升的氫氧化鉀溶液2毫升。3.5小時之後第三次加入鹼溶液，接著加入5毫升濃度和以前一樣的α-溴乙醯半乳糖丙酮溶液。4.5小時之後最後一次加入鹼溶液並且將該溶液攪拌過夜。
減壓去除丙酮，0℃攪拌下將殘留溶液加給300毫升0.06摩爾/升的碳酸鈉溶液。抽真空過濾慄棕色沉澱，用水洗滌並且風乾。將該固體溶解於100毫升二氯甲烷並且用氫氧化鉀溶液在0℃下充分洗滌以去除過量對-萘酚benzein。在100毫升水中在pH11下在Dowex Marathon樹脂上，通過攪拌2-3小時，去除殘留的對-萘酚benzein。純化之後是薄層色譜，使用乙酸乙酯/甲苯(3∶1)為溶劑，用氨水展開。用無水硫酸鎂將暗黃色溶液乾燥過夜，減壓蒸發，用甲醇再配製後再次蒸發以獲得一種泡沫體。將該泡沫體溶解於50毫升甲醇，並且在甲醇中使用20毫升0.4摩爾/升的甲醇鈉將產物去保護5小時。然後用IR120(H+)樹脂將溶液調至pH6.5並且通過靜置而分離，並且減壓去除溶劑。生成的糖苷對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(1.5克)是黃慄棕色粉末形式。
實施例2對-萘酚benzein的乙酸酯衍生物的合成將對-萘酚benzein溶解於無水吡啶之後冷卻到0℃，冷卻條件下向該溶液加入溶解於吡啶的乙酸酐(5倍摩爾過量)。室溫下24小時之後，為了分解過量的醯化試劑，攪拌下滴加冷水處理溶液。抽真空過濾分離酯形式的沉澱，用乙酸洗滌並且在熱條件下在乙酸中重結晶。
實施例3對-萘酚benzein的鉀鹽形式的硫酸鹽衍生物的合成-15℃攪拌下，向冷的對-萘酚benzein的無水吡啶溶液加入1.2摩爾過量的氯磺酸。-15℃ 1小時並且室溫下30分鐘之後，減壓蒸發去除過量吡啶，通過溶解於乙醇並且用氫氧化鉀的乙醇溶液處理直到達到pH10來分解吡啶鎓鹽。真空過濾出鉀鹽並且用乙醇洗滌之後用二乙醚洗滌。
實施例48-氯-1，2-苯並-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-葡糖苷，(CBR-glu)產物(2)的合成 將6-亞硝基-4-氯間苯二酚(2.94克，20毫摩爾)和1，3-二羥基萘(3.20克，20毫摩爾)分別溶解於1-丁醇(30毫升)並且混合。用水浴在50℃和60℃之間加熱反應混合物並且在攪拌下用30秒滴加硫酸(1.0克)。溶液變成深紅色並且快速形成結晶。50℃ 15分鐘和室溫下1小時之後，真空過濾產物並且從熱的1-丁醇中重結晶，得到2.8克8-氯-1，2-苯並-9-羥基-3-異吩噁唑酮亮深紅色結晶。
和前面對於對-萘酚benzein衍生物描述的一樣通過Koenigs-Knorr反應製備葡糖苷衍生物(2)。通過旋轉蒸發從二氯甲烷分離四乙醯化保護形式的葡糖苷並且使用催化量的甲醇鈉的無水甲醇溶液直接去保護。該糖苷是橘黃色粉末。
實施例58-氯-1，2-苯並-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷，(CBR-gal)產物(3)的合成製備該β-D-半乳糖苷衍生物(3)的方法和實施例中的描述相同，使用四乙醯化保護形式的β-D-半乳糖苷衍生物代替葡糖苷等價物。
實施例63-羥基-9-苯基-1，27，8-二苯並-6-螢光酮-β-D-半乳糖苷產物(4)的合成 通過在高沸點溶劑例如氯苯或二甲苯中，在路易斯酸例如SnCl4或ZnCl2存在下，通過在熱條件下使1，3-二羥基萘(Aldrich，14529-7)與α，α，α-三氟甲苯(Aldrich，T6370-3)縮合製備3-羥基-9-苯基-1，27，8-二苯並-6-螢光酮。路易斯酸水解並且純化中間體化合物之後，如實施例1所述製備半乳糖苷衍生物(4)。實施例6a:萘並藏花醇(9-羥基-7-苯酚-5-苯並[a]吩嗪酮)的合成 產物(5)保持0℃並且攪拌下，向苯酚(20克)，亞硝酸鈉(18克)和氫氧化鈉(9克)的500毫升水的溶液中緩慢加入50克硫酸和130毫升水的混合物。反應2小時之後，收集產物並且用冰冷卻的水洗滌。用水重結晶之後，分離純形式的對-亞硝基苯酚產物(13.4克)。
將這樣製備的對-亞硝基苯酚產物(12.3克，0.1摩爾)還有N-苯基-2-萘胺(14.5克，0.067摩爾，Aldrich，17805-5)溶解於乙醇(400毫升)並且將該混合物冷卻到15℃。向該溶液中加入濃鹽酸(15克)。溫度自發升高，並且通過過濾分離異繞森酮產物(鹽酸鹽形式)並且從乙醇-水(50％-50％)混合物中重結晶。重結晶的產物通過首先溶解於乙醇，然後加入羥胺，以及最後將該溶液加到熱水中而可以轉化為其游離鹼形式。
將溶液冷卻時游離鹼(異繞森酮)以深慄棕色結晶的形式沉澱出。真空下過濾產生15克純產物。
通過在濃KOH的1-丁醇的溶液中回流異繞森酮而獲得目的產物(5)。通過在二氧化矽上進行閃式層析來純化產物，用乙酸乙酯作為洗脫劑。
實施例6b根據和實施例1描述的相同的方法製備苯並藏花醇的半乳糖苷衍生物。
實施例7:對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(PNB-gal)檢測具有β-D-半乳糖苷酶活性的微生物的用途如下製備含有PNB-gal的固體瓊脂培養基向含有100毫克PNB-gal和30毫克IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的1升蒸餾水加入41克哥倫比亞瓊脂以有利於誘導β-半乳糖酶活性。在116℃下將瓊脂高壓滅菌10分鐘。在分布到20毫升培養皿中之前將培養基緩慢冷卻到55℃下。
從臨床和環境樣本中收集367種不同的菌株，包括303腸桿菌科並且利用API 20E圖庫(bioMerieux，法國)作為參考方法進行鑑定。在哥倫比亞瓊脂培養基上在37℃下將菌株培養24小時，然後對於每一種菌株接種大約108微生物/毫升(等於0.5McFarland標準)。使用Denley接種器，將每一種懸浮液各1微升接種到上面製備的PNB-gal培養基中，每個培養皿20個菌株。所有這些培養皿在37℃下溫育18小時。溫育之後，與哥倫比亞瓊脂培養基上的生長相比較，對培養皿檢查是否存在紫色菌落。結果在表I中給出。
表I
該表表明所述底物作為β-半乳糖苷酶活性的指示劑是非常有效的。沒有檢測到沒有β-半乳糖苷酶活性的菌株，這意味著沒有假陽性，與API20E參照方法相比，對腸桿菌科菌株的靈敏性是95.1％。
實施例8pH對對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶發揮活性的影響將培養基高壓滅菌之後，將46.37克/升濃度的哥倫比亞鹼，0.03克/升的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和0.1克/升的對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷調節至各種pH(5，5-6，0-6，5-7，0-7，5-8，0-8，5)。這些各種培養基分布到培養皿中，對它們自身接種並且在三次實驗中使用來自ATCC或NCTC型收集的0.5McFarland表徵得很好的微生物的懸浮液。這些培養皿在37℃下溫育48小時。目測檢查24小時和48小時溫育之後形成的菌落，並且注意顏色。結果在下面的表II中給出
表II
-指沒有顏色，TI代表在培養皿上溫育的時間。
根據菌株和培養的時間，菌落的顏色隨著pH而不同，是pH的函數。一般情況下，在酸性pH下更呈橙色至棕色，在鹼性pH下呈綠色至土黃色。這使得可以區分不同組的微生物，根據需要調節顏色(與其它酶底物組合，pH指示劑)或者證明幾種代謝產物(酶水解和pH變化)，其是PNB-gal底物的好處。
實施例9反應介質對對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶發揮活性的影響向哥倫比亞胰腖豆腖瓊脂(TSA)和山梨糖醇MacConkey(SMAC)介質中加入下面的混合物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷……………………0.03克/升對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷……………….0.1克/升高壓滅菌之後，23℃下培養基的pH對於SMAC，TSA和哥倫比亞培養基分別是7.1，7.1，和7.2。這些不同的培養基分布在培養皿上，並且對它們自身接種並且在三次實驗中使用來自ATCC或NCTC型收集的0.5McFarland表徵得很好的微生物的懸浮液。這些培養皿在37℃下溫育48小時。目測檢查24小時和48小時溫育之後形成的菌落，並且注意顏色。結果在下面的表III中給出表III
-指沒有顏色，TI代表在培養皿上溫育的時間。
根據菌株和培養的時間，菌落的顏色隨著培養基而不同，是培養基的函數。一般情況下，在SMAC培養基上是橙色，在哥倫比亞培養基上是棕色，沒有可能將此差異與對於培養基的pH的顏色聯繫在一起。對於SMAC培養基，可以將粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)與其它細菌分別開來，在另外兩種培養基中則不是這種情況。另外，有利地，根據給出其它顏色(例如粉色或棕色)的其它酶底物的使用，能調節用對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷獲得的菌落的顏色。
實施例10溫育大氣對對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷PNB-gal存在下β-D-半乳糖苷酶發揮活性的影響向下面的培養基中加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)或者對-萘酚benzein-β-D-半乳糖苷(PNB-gal)0.1克/升酵母提取液……………………6克/升明膠蛋白腖……………………5克/升NaCl…………………………8克/升碳酸鈉…………………………0.1克/升異丙基-β-D-硫代半乳糖苷…0.03克/升瓊脂……………………………13克/升這些不同的培養基分布在培養皿上，並且使用來自ATCC或NCTC型收集的表徵得很好的微生物接種。這些培養皿在各種氣體下在37℃下溫育48小時需氧生活(AE)，微需氧(MAP)，厭氧生活(ANA)，CO2，通過GENbox系統(bioMerieuz，法國)控制周圍氣體。目測檢查24小時和48小時溫育之後形成的菌落，並且注意強度和顏色。結果在下面的表IV中給出
表IV
*顏色強度(以目測觀察為基礎的比例規格)；-指沒有顏色；TI代表溫育的時間。
X-Gal使得可能檢測E.faecium菌株的活性，與PNB-Gal不一樣，對於在需氧生活(大腸埃希氏桿菌，陰溝腸桿菌)下強水解X-Gal的菌株，PNB-Gal使可能檢測該不依賴周圍氣體並且更強的β-D-半乳糖苷酶活性。具體地說，在試驗3條件下強度弱或非常弱，而在試驗7條件下強度強。
實施例118-氯-1，2-苯並-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷(CBR-gal)用於檢測在固體培養基中具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的用途以下面的濃度將CBR-gal底物摻入哥倫比亞瓊脂中2，6，10和20毫克/100毫升，將這樣製備的培養基分布到培養皿中。用下面的微生物接種每一個培養皿大腸埃希氏桿菌(NCTC，10418)，肺炎克雷白氏桿菌(NCTC，10896)，雷氏普羅威登斯菌(NCTC，7475)，陰溝腸桿菌(NCTC，11936)，粘質沙雷氏菌(NCTC，10211)，和鼠傷寒沙門氏菌(NCTC，74)。以每100毫升哥倫比亞瓊脂3毫克的濃度向所有的這些培養基中摻入IPTG。所有的培養皿都在37℃下保溫過夜。
對於β-半乳糖苷酶活性呈陽性的菌株(大腸埃希氏桿菌，肺炎克雷白氏桿菌，陰溝腸桿菌，和粘質沙雷氏菌)在溫育過夜之後快速水解底物，給出粉色顏色，這只限於細菌菌落。所有試驗濃度都可以區分這些物種，但是獲得清晰可見粉色顏色而沒有背景噪音的最佳濃度是大約10毫克/100毫升。對於所有試驗濃度都沒有觀察到生長的抑制作用。
實施例128-氯-1，2-苯並-9-羥基-3-異吩噁唑酮-β-D-半乳糖苷(CBR-gal)用於檢測在液體培養基中具有β-半乳糖苷酶活性的微生物的用途以0.5毫克/毫升至0.0078毫克/毫升不同濃度在液體培養基中試驗CBR-gal底物。其中加入底物的液體反應介質由含有0.5％營養肉湯和0.5％氯化鈉的磷酸鹽緩衝液pH7.4組成。對於所有的底物濃度向介質中加入30微升/毫升IPTG。試驗菌株是大腸埃希氏桿菌(NCTC，10418)，肺炎克雷白氏桿菌(NCTC，10896)，雷氏普羅威登斯菌(NCTC，7475)，陰溝腸桿菌(NCTC，11936)，粘質沙雷氏菌(NCTC，10211)，和鼠傷寒沙門氏菌(NCTC，74)，菌種為0.5McFarland。
所有具有β-半乳糖苷酶活性的菌株都隨著時間產生粉色顏色，如下面表V中總結的。
表V
*以小時給出的結果。-表示即使在24小時之後也沒有顏色。
權利要求
1.通式(I)的酶底物 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地在間位或對位被取代，當X代表碳原子時，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，R代表一個基團，它使得O-R鍵能夠被酶水解。
2.權利要求1要求的酶底物，特徵在於所述酶來自osidases家族，例如β-葡糖醛酸酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酶，6-磷酸半乳糖水解酶，α-半乳糖苷酶，α-澱粉酶，α-葡糖苷酶，或者氨基己糖苷酶，例如N-乙醯基-β-氨基葡糖苷酶或者N-乙醯基-β-氨基半乳糖苷酶，或者來自酯酶家族，脂酶家族，磷酸酯酶家族，硫酸酯酶家族，DNA酶家族，肽酶家族和蛋白酶家族。
3.權利要求1和2要求的酶底物，特徵在於R是α-或β-糖型殘基，優選β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖，或β-D-葡糖醛酸根或磷酸根，硫酸根或乙酸根。
4.通式(II)的權利要求1-3任一項要求的酶底物 其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，R5代表間位或對位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，R代表能夠使O-R鍵被酶水解的基團。
5.權利要求4要求的酶底物，特徵在於R1和R2代表稠合的苯環，R3和R4代表氫原子，R5代表氫原子，R代表α-或β-糖型殘基，優選β-D-葡萄糖，或β-D-半乳糖，或硫酸根或乙酸根。
6.通式(III)的權利要求1-3任一項要求的酶底物 其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，R5代表間位或對位的H，NO2，CF3，CN，OCH3，F，I，Cl，Br，SO3H或CO2H，R代表能夠使O-R鍵被酶水解的一個基團。
7.權利要求6要求的酶底物，特徵在於R1和R2代表稠合的苯環，R3和R4代表氫原子，R5代表H，R代表α-或β-糖型殘基，優選β-D-葡萄糖，或β-D-半乳糖。
8.通式(IVa)的權利要求1-3任一項要求的酶底物 其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，優選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，優選地，R3和R4代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解，特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
9.通式(IVb)的權利要求1-3任一項要求的酶底物 其中R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，優選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，優選地，R3和R4代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解，特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
10.通式(IVc)的權利要求1-3任一項要求的酶底物 其中A代表芳基或烷基，R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，優選地，R1代表H而R2代表Cl，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，優選地，R3和R4代表H，R代表一個基團使得O-R鍵能夠被酶水解，特別地，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
11.權利要求8要求的酶底物，特徵在於R1代表H而R2代表Cl，R3和R4代表H，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
12.權利要求10要求的酶底物，特徵在於R1，R3和R4代表H，A代表苯基，R代表α-或β-糖型優選是β-D-葡萄糖或β-D-半乳糖的殘基。
13.權利要求1要求的酶底物的合成方法，特徵在於製備具有通式(V)的中間體化合物，並且將合適地保護基R接枝到羥基上[sic] 其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或對位取代，當X代表碳原子時，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵，R1和R2各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的，或者R1和R2一起代表可以被取代或者沒有被取代的稠合的苯環，R3和R4各自獨立地代表H，Cl，F，I或Br，並且可以是相同或不同的。
14.權利要求13要求的方法，特徵在於所述中間體化合物相應於下面的結構式(Va)
15.權利要求13要求的方法，特徵在於所述中間體化合物相應於下面的結構式(Vb)
16.權利要求13要求的方法，特徵在於所述中間體化合物相應於下面的結構式(Vc)
17.一種用於檢測和/或鑑定和/或定量測定至少一種微生物的組合物，其含有至少一種權利要求1-12任一項要求的酶底物和適合所述微生物的反應介質。
18.權利要求17要求的組合物，特徵在於所述組合物含有至少兩種權利要求1-12任一項要求的底物，其酶解產生不同顏色和/或螢光產物。
19.權利要求17或18要求的組合物，特徵在於其還含有另一種酶底物，其不同於權利要求1-12任一項要求的底物，並且其酶解產生與權利要求17要求中使用底物酶解釋放的不同的或者與權利要求18要求中使用底物酶解釋放的不同的顏色和/或不同的螢光產物。
20.權利要求17，18或19要求的組合物，特徵在於所述反應介質是固體，半固體或液體。
21.權利要求17-20任一項要求的組合物，特徵在於反應介質中酶底物的濃度在0.02和1克/升之間，有利地在0.03和0.30克/升之間，優選地在0.04和0.10克/升之間。
22.包括權利要求17-21任一項要求的組合物和盛反應介質的容器的診斷試劑盒。
23.一種用於檢測和/或鑑定和/或定量測定樣本中至少一種微生物的方法，特徵在於使來源於樣本的微生物接觸含有權利要求1-12中定義的酶底物以獲得接種培養基，並且檢測所述酶底物水解形成的有色或螢光產物。
24.權利要求23要求的方法，特徵在於在控制的環境下例如需氧，厭氧或微需氧條件下或者在二氧化碳氣下，優選在需氧或微需氧條件下或者在二氧化碳條件下，溫育接種的反應培養基。
25.權利要求1-12任一項要求的酶底物在使用酶活性的技術例如ELISA技術，所述技術中分析物是抗體，抗原或者核酸，或者其中分析物是β-半乳糖苷酶型基因的分子生物技術中檢測分析物的用途。
全文摘要
本發明涉及新的通式(I)的酶底物，其中X代表苯基取代的氮原子或碳原子，所述苯基任選地被間位或對位取代；當X代表碳原子時，Y和Z代表氫原子，或者Y和Z一起代表任選被烷基或芳基取代的醚，硫醚或胺鍵；R
文檔編號C07H15/24GK1399641SQ00816190
公開日2003年2月26日 申請日期2000年10月25日 優先權日1999年10月28日
發明者L·阿姆斯特朗, A·詹姆斯 申請人:比奧美希奧公司