一種產脂肽短小芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-12-12 16:56:42

專利名稱：：一種產脂肽短小芽孢桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於環境微生物工程領域，具體涉及一種產脂肽短小芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
：石油的開採、運輸、儲存以及事故性洩漏等原因造成每年約有上千萬噸石油烴進入環境，引起土壤、地下水、水系和海洋環境的嚴重汙染，日益受到人們的關注。石油汙染物進入水體後，不僅使水體的化學需氧量升高，同時水錶層的油膜又阻止了空氣中的氧向水中擴散，造成局部水域的厭氧狀態，使水生動物因缺氧而死亡，水生植物的光合作用也會遭到破壞，給生態系統帶來嚴重危害。石油洩漏滲入土壤，當量超過土壤的自淨容量後，積累的油類物質將長期殘留於其中，破壞土壤結構，影響土壤通透性，損害植物根部，阻礙根的呼吸與吸收，對土壤植物和土壤微生物生態系統，甚至地下水都產生危害，嚴重影響土壤生產力和農作物產量。治理石油汙染己成為當今各國環境專家的研究熱點。98%以上的殺蟲劑和95%以上的除草劑都沒有作用到靶標生物上，而是到達了非靶標生物、進入土壤、空氣、水和食物之中，破壞生態系統，引起人和動植物急性或慢性中毒。由於大多數農藥(例如功夫菊酯等人工合成的擬除蟲菊酯類殺蟲劑)的水溶性較差、在生物降解過程中與微生物的接觸表面積小，使得生物修復過程較慢，這也是農藥生物降解周期長的一個主要因素。最近十年來，一類新的由細菌非核糖體合成的脂肽類次生代謝物不斷被發現和研究。細菌脂肽為既親水又親脂的兩性分子，是功能強大的表面活性劑，能極大地降低表面張力與改變表面特性，因而在環境汙染治理方面，特別是在石油和農藥等難溶性汙染物生物修複方面具有極大的應用潛力。已經發現芽孢桿菌能產生三類脂肽類次生代謝物表面活性素類(Surfactins)是由一個手性為LLDLLDL的七肽與一個p-羥基脂肪酸(脂肪鏈長C13~C15)通過內酯鍵形成的環狀結構；伊枯草素類(Iturins)是由一個手性為LDDLLDL的七肽和一個P-氨基脂肪酸(脂肪鏈長C14~C17)①AA)形成的環狀結構；豐原素類(Fengycins)是由一個手性為LDDDLDLLLL的十肽和一個p-羥基脂肪酸(脂肪鏈長C15C17)通過內酯鍵形成環狀結構。這三大類脂肽的手性和3D空間結構不同，性能也有差異，這是為什麼不同菌種間產生的生物表面活性劑強度有差異的重要原因，因此篩選高效產脂肽菌株是一項十分重要的工作。細菌脂肽除了具有促進生物修復功能外，還能抑制病原微生物生長，與人工合成的抗生素相比，具有副作用小、靶標活性高的特點，屬於一類新型抗生素。此外，由於對人體無毒，也可作為食品和化妝品的添加劑。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種高效產脂肽的短小芽孢桿菌，所產生的脂肽能顯著促進石油和/或功夫菊酯農藥降解菌的生物降解過程。本發明還要解決的一個技術問題是提供上述短小芽孢桿菌在促進石油和/或功夫菊酯農藥降解菌的生物降解過程中的應用。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下本發明人從山東勝利油田石油汙染土壤中分離、篩選得到並保藏的短小芽孢桿菌新菌株為Y8A，其分類命名為短小芽孢桿菌(5ad〃M/w脂7^)。目前該菌株保藏於武漢大學中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC);地址武漢武漢大學；郵編430072;登記入冊的編號CCTCCNO:M209108;保藏日期2009年5月18日。以此菌作為生產菌株。CCTCCNO:M209108菌株具有下述性質1、形態特徵短小芽孢桿菌Y8A為杆狀，大小為L5~l.7nmx2.5~3.0pm，革蘭氏陽性，能運動，有側生鞭毛，產芽孢。LB固體平板上3(TC培養48h，菌落呈淡黃色、圓形、不透明、邊緣不平整、表面扁平、溼潤粗糙。2、生理生化特徵短小芽孢桿菌Y8A的生理生化特性見表1。表1菌株Y8A的生理生化特徵tableseeoriginaldocumentpage4注"+":表示利用或呈陽性反應；即為陰性反應3、16SrDNA序列分析測得短小芽孢桿菌Y8A的16SrDNA序列長度為1471bp，具體見SEQIDNo.l所示。將所測序列在RDP資料庫比對分析，選取資料庫中相關的16SrDNA序列，採用Bioedit，MEGA3.1軟體對Y8A進行系統發育分析，構建系統進化樹。結果表明，菌株Y8A與短小芽孢桿菌(5fl"7/^戶/w7"s)同源性達100%，再結合以上生理生化特性，將Y8A鑑定為短小芽孢桿菌，具體為短小芽孢桿菌Y8A(CCTCCNO:M209108)。4、生物表面活性劑的特性(1)生物表面活性劑的提取與定量分析提取獲得的短小芽孢桿菌Y8A產的生物表面活性劑粗品為淺黃色粉末狀。短小芽孢桿菌Y8A生物表面活性劑的產量為5.05g，L—1。(2)表面活性劑的定性分析短小芽孢桿菌Y8A的生物表面活性劑粗品的薄層層析(TLC)檢測在矽膠板上點樣不展層，產物經茚三酮顯色劑顯色後呈紫紅色，初步判定菌株產生的是脂肽類生物表面活性劑。短小芽孢桿菌Y8A產生的生物表面活性劑紅外光譜檢測在FT-IR譜圖上，3285-3295cm"是由分子鏈間氫鍵引起的NH收縮振動譜帶，3070~3075cm"是NH基團的分子內氫鍵引起的NH伸縮譜帶，16501655cm'1、1534-1535cm—1分別為醯胺譜帶I和II。這些特徵吸收表明該表面活性劑分子含有肽鏈。譜圖上2960~2870cm"和1455-1380cm—1的兩處吸收峰是來自脂肪族碳鏈的C—H伸縮振動，1225~1231cm—1和699cm—i是內酯的特徵吸收峰，表明該表面活性劑分子含有脂肪酸分子。因此，短小芽孢桿菌Y8A產生的生物表面活性劑屬脂肽類。(3)發酵液乳化性能測定將發酵液與石蠟混合後，每隔12h檢測乳化體積的變化，連續監測48h，菌株Y8A的發酵液均能很好的乳化石蠟。Y8A發酵液在12h內，乳化體積維持在100%。隨著時間的延長，乳化體積有所下降，但下降速度非常緩慢，Y8A發酵液在48h內乳化體積仍保持在80%。放置7d後，乳化體積仍可達到70%。因此，短小芽孢桿菌Y8A發酵液乳化性能穩定，增溶效果良好。(4)臨界膠束濃度(CMC)的測定將提取到的表面活性劑粗品分別稀釋至lOmg七-1，20mg丄"，30mg'I/1，40mg丄—1，50mg'U1，100mg'U1，200mg'L"後，測不同質量濃度的表面活性劑溶液的表面張力。隨著表面活性劑質量濃度的增大，溶液的表面張力逐漸降低，降到23.4mN-m—i後基本保持不變，計算菌株所產生物表面活性劑的CMC值為30mg七—1，比一般化學表面活性劑的CMC值(SDS2120mg丄'1，吐溫20600mg丄")低12個數量級，因此生物表面活性5劑比一般的化學表面活性劑在性能方面更優越。5、發酵培養基及發酵條件的優化-(1)菌體生長與發酵液表面張力的關係菌株的生長量與發酵液表面張力呈反比，表面張力隨著菌體生長而下降，菌體濃度達到最大時，表面張力達到最低，且在整個穩定期，發酵液的表面張力變化不大。菌株Y8A生長的延遲期為8h，8h後進入對數生長期，在22h菌體濃度達到最大，與之相應的培養液的表面張力達到最小。(2)不同碳源對菌體生長和產表面活性劑的影響在LB培養基中加入不同碳源(蔗糖，葡萄糖，乳糖，木糖，麥芽糖)，終濃度均為10g，U1。菌株Y8A在上述碳源中均生長良好，但加入乳糖能夠明顯降低菌株Y8A發酵液表面張力，最低達到28.6mN'm—1。(3)溫度對菌體生長和表面活性劑產生的影響培養溫度分別選取2CTC，25°C、30°C、37°C，不改變其它發酵條件。3(TC為菌株Y8A的最適生長溫度，產生的表面活性劑量最大，發酵液表面張力值最低達到28.3m衝m—1。但2(TC和25'C時菌體生長和表面活性劑的產生也均較好，表明其具有較寬的溫度適應範圍。而37'C對菌體的生長影響不大，但對表面活性劑的產生影響很大。說明只在一定溫度範圍內，菌株Y8A的生長和合成表面活性劑的溫度是相一致的。(4)pH值對菌體生長和表面活性劑產生的影響將發酵培養基的初始pH分別調至4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、12，其它發酵條件不改變。菌株Y8A在pH值為512範圍內生長均良好，產生的表面活性劑使培養液的表面張力有顯著降低，而且差異不大，但在pH4.0時，生長嚴重受到抑制。說明Y8A具有很寬的pH適應範圍。(5)通氣量對菌體生長和表面活性劑產生的影響在250mL三角瓶中分別加入25，50，75，100，125，150mL發酵培養基，其它發酵條件不改變。菌株Y8A在裝液量為50mL時生長最好，培養液的張力值最低，而在其他裝液量時，生長和培養液的表面張力都略有下降。說明Y8A對通氣量要求不高，能夠在氧氣含量較少的條件下很好生長並產生表面活性劑。(6)金屬離子對菌體生長和表面活性劑產生的影響在培養基中分別加入各種金屬離子(Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+)，使其終濃度均為20mg丄"。其它發酵條件不改變。20mg七'1&2+和F^+能夠顯著促進Y8A的生長和表面活性劑的產生，使發酵液表面張力降低，而20mg七—1Zr^+和012+抑制Y8A的生長和表面活性劑的產生。20mg七-lMi^+對Y8A的生長和表面活性劑的產生有輕微的促進作用。(7)菌株對抗生素的抗性以1%接種量分別將菌株Y8A的種子液接入抗生素濃度為10mg丄"的LB液體培養基中，3(TC、170rpm培養24h。在供試的九種抗生素中，Y8A除了對慶大黴素沒有抗性外，對其它八種抗生素均有抗性，見表2。表2菌株Y8A對抗生素的抗性供試抗生，鏈毒素(10mg'U1)批母示氨苄黴素萬古黴素慶大黴素卡那黴素頭孢氯黴嘧澱素四環黴素壯觀黴素Y8A+++—++注"+"表示生長;"-"表示不生長綜上，本發明的產脂肽短小芽孢桿菌產脂肽的培養條件為在LB培養基中，以蔗糖、葡萄糖、乳糖、木糖或麥芽糖為碳源，加入金屬離子F一+、Ca"或Mn2、pH5~12，在203(TC培養至菌體濃度達到最大。優選培養條件為在LB培養基中，以乳糖為碳源，加入金屬離子F^+或Ca^，pH5~12，在2030'C培養至菌體濃度達到最大。更優選的培養條件為在LB培養基中，以乳糖為碳源，加入金屬離子F^+或Ca2、pH7.5，在3(TC培養至菌體濃度達到最大，在此條件下，產脂肽能力達到最強。其中，所述碳源濃度為10g丄—1，所述金屬離子濃度為20mg七—、本發明的短小芽孢桿菌(5a"7/ws;wm7M)Y8A(CCTCCNO:M209108)，能高效產生脂肽類生物表面活性劑，將緊密粘附在土壤顆粒表面的強疏水性有機汙染物分散、增加有機汙染物降解菌與汙染物的接觸位點，因此可與其它有機汙染物降解菌如石油和/或功夫菊酯農藥降解菌聯合使用，加快石油和/或功夫菊酯農藥的降解過程。優選的，將本發明的產脂肽短小芽孢桿菌Y8A與垸烴降解菌金黃桿菌屬菌株和/或芳香烴降解菌氯酚鞘氨醇單胞菌菌株共同接種於石油汙染的土壤或水域中，促進石油的微生物降解過程。優選的，將本發明的產脂肽短小芽孢桿菌Y8A與功夫菊酯降解菌蠟狀芽孢桿菌屬菌株共同接種於功夫菊酯農藥汙染的土壤或水域中，促進功夫菊酯農藥的微生物降解過程。有益效果本發明篩選到的短小芽孢桿菌菌株Y8A(CCTCCNO:M209108)，能高效穩定的產生脂肽類生物表面活性劑，能夠有效促進石油和/或功夫菊酯農藥降解菌的生物降解過程。菌株Y8A本身的高效產脂肽功能可望作為新一代抗生素生產菌和促溶劑，廣泛應用於農業、醫藥、化妝品和食品及化工行業，與其它有機汙染降解微生物7一起可用於汙染環境修復之中。該菌株能耐多種抗生素，發酵過程簡單，操作容易。圖l本發明的短小芽孢桿菌Y8A的電鏡負染照片。圖2本發明的短小芽孢桿菌Y8A在血平板上的溶血情況(左邊)，與之對照的是本實驗室分離篩選到的另一株產脂肽不動細菌屬菌株l^c/"eto^c^sp.BHSN(EU293155)]。圖3本發明的短小芽孢桿菌Y8A發酵液的乳化效果(左邊)，與之對照的是本實驗室分離篩選到的另一株產脂肽不動細菌屬菌株[Acinetobactersp.BHSN(EU293155)]。圖4本發明的短小芽孢桿菌Y8A產生的生物表面活性劑的紅外吸收光譜圖。具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例h在LB培養基中加入20mg丄"Fe21n(^2+能顯著促進Y8A的生長和表面活性劑的產生；10g七"的乳糖能顯著促進表面活性劑的產生；菌株Y8A在203(TC，pH5~12範圍內生長和產生表面活性劑的能力均較強；在容量為250mL三角瓶中，液體種子按1呢接種量接於50mLLB培養基中(加入10g'L"乳糖、20mg.U1Fe"和Ca2+，pH7.5),3(TC下170rpm搖床培養24h。發酵結束後測定菌體發酵液的表面張力值，該值最小可達到23.5mNTi1—1。實施例2:取石油汙染土壤風乾後過篩混勻，121'C滅菌30min，烘乾。分為六組進行對比試驗，每組設計三個平行(A)加入產脂肽菌株Y8A菌液，(B)加入烷烴降解菌金黃桿菌屬菌株(C/zr"eo6a"eWwmsp.ATCC11642)，(C)加入芳香烴降解菌氯酚鞘氨醇單胞菌菌株(S/7/7/"gowo"oycWwopte"o/z'cfl!ATCC39723)菌液，(D)加入Y8A和金黃桿菌屬菌株菌液，(E)加入Y8A和氯酚鞘氨醇單胞菌菌液，(F)加入Y8A、金黃桿菌屬菌株和氯酚鞘氨醇單胞菌菌液。接菌量均為1.1xlS個f1，混勻，以不加菌液土壤為對照(CK)。容器表面覆蓋塑料薄膜，扎孔通氣，30'C培養30d，採用重量法測定土壤中原油殘留量。試驗結果如表3。_表3Y8A對石油汙染生物修復的促進作用_處理_降解率(％)__降解率(％)CK10.38A12.76D79.62B48.13E74.51_^_43.69_^_83.26實施例3:在1/10LB含功夫菊酯(終濃度為100mg七")培養基中同時接入功夫菊酯降解菌蠟狀芽孢桿菌菌株(5flcz7/^ce^ATCC7039)和本發明的產脂肽菌株Y8A，接種比例為l:1，接種量均為1%，在不同時間分別測定發酵液0D6QQ和功夫菊酯殘留量。與蠟狀芽孢桿菌菌株單獨培養時，菌體的生長和對功夫菊酯降解率相比，混合培養時，功夫菊酯降解速度明顯加快，34小時達到最大降解量，比未加Y8A提前了7個小時，降解過程縮短了近1/6。培養2天後的測定結果表明，在功夫菊酯降解菌蠟狀芽孢桿菌單獨培養時，功夫菊酯的降解率為38.7%，蠟狀芽孢桿菌和Y8A共同培養時，功夫菊酯的降解率顯著提高到87.7%,因此Y8A能顯著地促進農藥的生物降解。9SEQUENCELISTING〈110〉南京農業大學〈120〉一種產脂肽短小芽孢桿菌及其應用〈130>njau0905211〈170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉1471〈212〉廳〈213〉短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)〈400>1gacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaaaactccgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaagacggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgaatggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagctgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtaggaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttggacagaagggagcttgctc60cctgcctgtaagactgggat120accgcatggttcaaggatga180cattagctagttggtggggt240ggtgatcggccacactggga300gaatcttccgcaatggacga360cggatcgtaaagctctgttg420ttagggaagaacaagtgcgagagtaactgctcgcaccttgacggtacctaaccagaaagc480c已cggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaat540tattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctca600accggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattcca660cgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctg720gtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggt780agtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgca840gct犯cgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaat900tgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggttt犯ttcgaagcaacgcgaagaacc%0ttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcggggacaga1020gtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgc廳Oaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgc1140cggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgg1200gctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcaagaccgcaaggtttagccaat1260cccataaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaat1320cgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccg1380cccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagcca1440gccgccgaaggtggggc卿tgattggggtg147權利要求1、一種產脂肽短小芽孢桿菌，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)Y8A，已保藏於武漢大學中國典型培養物保藏中心，其保藏編號是CCTCCNOM209108。2、權利要求1所述的產脂肽短小芽孢桿菌在促進石油和/或功夫菊酯農藥微生物降解過程中的應用。3、根據權利要求2所述的應用，其特徵在於產脂肽短小芽孢桿菌的培養條件為在LB培養基中，以庶糖、葡萄糖、乳糖、木糖或麥芽糖為碳源，加入金屬離子F^+、Ca"或Mn"，pH5~12，在203(TC培養至菌體濃度達到最大。4、根據權利要求3所述的應用，其特徵在於產脂肽短小芽孢桿菌的培養條件為在LB培養基中，以乳糖為碳源，加入金屬離子Fe^或Ca2+，pH512，在203(TC培養至菌體濃度達到最大。5、根據權利要求4所述的應用，其特徵在於產脂肽短小芽孢桿菌的培養條件為在LB培養基中，以乳糖為碳源，加入金屬離子Fe"或Ca2+，pH7.5，在3(TC培養至菌體濃度達到最大。6、根據權利要求3-5中任意一項所述的應用，其特徵在於所述碳源濃度為10g1—1。7、根據權利要求3-5中任意一項所述的應用，其特徵在於所述金屬離子濃度為20rng-U1。8、根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，將產脂肽短小芽孢桿菌Y8A與垸烴降解菌金黃桿菌屬菌株和/或芳香烴降解菌氯酚鞘氨醇單胞菌菌株共同接種於石油汙染的土壤或水域中，促進石油的微生物降解過程。9、根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，將產脂肽短小芽孢桿菌Y8A與功夫菊酯降解菌蠟狀芽孢桿菌屬菌株共同接種於功夫菊酯農藥汙染的土壤或水域中，促進功夫菊酯農藥的微生物降解過程。全文摘要本發明公開了一種產脂肽短小芽孢桿菌，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)Y8A，已保藏於武漢大學中國典型培養物保藏中心，其保藏編號是CCTCCM209108。本發明還公開了上述產脂肽短小芽孢桿菌在促進石油和/或功夫菊酯農藥微生物降解過程中的應用。本發明的短小芽孢桿菌Y8A，能高效穩定的產生脂肽類生物表面活性劑，有效促進石油和/或功夫菊酯農藥降解菌的生物降解過程。菌株Y8A本身的高效產脂肽功能可望作為新一代抗生素生產菌和促溶劑，廣泛應用於農業、醫藥、化妝品和食品行業，與其它有機汙染降解微生物一起可用於汙染環境修復之中。該菌株能耐多種抗生素，發酵過程簡單，操作容易。文檔編號B09C1/10GK101560483SQ200910027359公開日2009年10月21日申請日期2009年5月31日優先權日2009年5月31日發明者煒冉,娟曹,標沈申請人:南京農業大學