一種伯克氏菌及其在防治三七土傳病害中的應用的製作方法
2023-12-12 19:24:02
一種伯克氏菌及其在防治三七土傳病害中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開一種伯克氏菌菌株(Burkholderia arboris)YIM AF 1514，於2014年9月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC NO.9733，同時公開了使用本發明提供的菌株製備的菌懸液。本發明提供的伯克氏菌菌株及菌懸液能有效防止三七種植中的土傳病害，降低三七根腐病發病率，並提高三七出苗率。
CGMCC NO9733
20140924
【專利說明】一種伯克氏菌及其在防治三七土傳病害中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種菌株，具體涉及一種伯克氏菌株及其在防治三七土傳病害中的應 用。
【背景技術】
[0002] 三七是雲南文山地區主要的經濟作物，性喜溫暖陰溼，其獨特的生長環境容易誘 發多種土傳病害。由於三七神奇的藥用功效，全球對三七及其相關產品的需求日益增加，而 可供種植三七的區域並不多，因此大多數地區採取三七連作的種植方式。隨著三七種植年 限的增加，土傳病害的種類、發病面積及嚴重程度逐年增加，嚴重損害三七的產量和質量， 其中最主要的病害為根腐病。
[0003] 根腐病是由於土壤中微生物失調，大量病原性和真菌侵染三七植株根部導致的， 土壤中微生物失調是導致三七連作障礙的一個重要因素，目前常用的治理方法主要是施用 殺菌劑，但是效果越來越不理想，而採用高效燻蒸劑進行土壤滅生處理，然後再補充益生菌 劑調整微生物區系使土壤活化和健化的方法則成本較高，效果也不理想。
[0004] 伯克氏菌是一種假單胞菌，廣泛分布於自然環境中，不同的菌株表型相同，但是基 因型不同，有些類型的伯克氏菌在農業上可用作生物降解、生物控制及促進植物生長之根 圈微生物，但還有一些是植物致病菌甚至是人體條件致病菌，而且由於伯克氏菌具有較強 的抗生素抗藥性及較高的運動性，因此，在農業上應用伯克氏菌具有一定的潛在風險，在菌 株的選擇上需得非常謹慎。中國專利201010290583. 8公開了一種水稻根圍伯克氏菌，這個 菌株在防治水稻紋枯病方面有非常好的效果，但是用這個菌株的菌懸液接種菸葉時，會在 24小時內導致典型的過敏反應，因此，如果要利用伯克氏菌解決不同作物的土傳病害，如何 分離純化出最合適的伯克氏菌株就很重要。
[0005] 目前對於三七連作障礙已有較多的研究，但是利用三七根際土壤中的益生菌，尤 其是伯克氏菌來抑制三七土傳病害的發生，從而在一定程度上解決三七連作障礙的研究尚 未見諸報導。
【發明內容】
[0006] 為解決上述問題，本發明提供了一種伯克氏菌株及其在防治三七土傳病害中的應 用方法。
[0007] 本發明所提供的一種伯克氏菌菌株（Burkholderia arboris)?Μ AF 1514,於 2014年9月24日保藏於位於北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC NO. 9733。
[0008] 本發明提供伯克氏菌菌株?Μ AF 1514,是從雲南省文山紅壤三七種植區的三七 根際土壤中分離得到的，具體步驟為：
[0009] (1) 土樣處理：準備滅菌Ih後的三角瓶，純水，以及玻璃珠。將玻璃珠放入裝有 20ml無菌水的三角瓶中，並取2. Og新鮮土樣加入三角瓶中，混勻，室溫下150r/min搖勻 45min〇
[0010] (2)塗布：取ImL(I)中的混懸液加入9. OmL無菌水，連續稀釋3次獲得稀釋度為 1〇_4的樣品液，接著取120 μ L樣品液均勻塗布在分離培養基（牛肉膏蛋白腖）上，並做三 個重複。
[0011] (3)培養與純化：塗布好的平板於28°C培養3天，之後挑取在牛肉膏蛋白腖培養基 上的單個菌落在ISP2瓊脂培養基上畫線純化培養，純化培養後得到的菌株作為供試菌株， 並用牛奶管將菌株進行暫時保藏。
[0012] (4)分類地位的確定：提取供試菌株的DNA，進行16SrRNA測序確定菌株的分類地 位。
[0013] (5)活性篩選：採用水瓊脂擴散法進行活性篩選，將其菌株發酵3天，取其發酵液 作用於混有病原菌的培養基（培養基成分：0.8%的多聚蛋白腖，0.4%的酵母提取物）中， 觀察其透明圈的大小。
[0014] (6)活性驗證：將其新鮮菌體接種於混有病原菌的培養基（培養基成分：0. 8 %的 多聚蛋白腖，0.4%的酵母提取物）上，觀察其抑菌圈的大小。
[0015] 通過以上實驗篩選出抗菌效果最好的一株菌株（YM AF 1514)，並擴大培養，提取 其DNA，通過16SrNA克隆測序確定其分類地位，並於中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心保藏。
[0016] 本發明所提供的伯克氏菌菌株（Burkholderia arborisRlM AF 1514的主要表 型及生物學特徵如下：該菌為革蘭氏陰性細菌，需氧型，在培養基（含0. 8%的多聚蛋白腖 +0. 4%的酵母提取物）上生長的菌落為圓形，呈密黃色，表面及邊緣光滑、潮溼，電鏡下觀 察呈棒狀。該菌最適合生長溫度為28-30°C，pH為5. 5-6。
[0017] 本發明還提供了一種採用上述保藏編號為CGMCC NO. 9733的伯克氏菌菌株?Μ AF 1514製備的菌懸液，所述菌懸液濃度為0D600 = 1. 62,可直接應用於防治三七土傳病害。
[0018] 製備上述菌懸液時所用培養基含有0. 8%的多聚蛋白腖和0. 4%的酵母提取物。
[0019] 本發明的有益效果如下：
[0020] 此外，本發明提供的伯克氏菌?Μ AF 1514被鑑定為屬於Burkholderia arboris， 該菌型已被確定為是益生菌，具有較高的安全性。
[0021] 本發明首次在種植三七的土壤裡面發現這種菌，並成功分離出抗菌效果最好的菌 株，在抗困實驗中能有效地詰抗多種植物致病困。
[0022] 利用該菌株製備的菌懸液在盆栽實驗和田間試驗中，能有效地提高三七出苗率及 降低三七根腐病發病率，驗證了該菌株適宜用作防治三七土傳病害的生防菌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為伯克氏菌?Μ AF 1514在培養基（含0.8%的多聚蛋白腖+0.4%的酵母提 取物）上生長的菌落形態；
[0024] 圖2為伯克氏菌?Μ AF 1514的抗尖端鐮孢菌（三七病原菌）實驗效果圖；
[0025] 圖3為伯克氏菌?Μ AF 1514的抗香蕉枯萎病菌實驗效果圖；
[0026] 圖4為伯克氏菌?Μ AF 1514的抗番茄灰毒病菌實驗效果圖；
[0027] 圖5為伯克氏菌?Μ AF 1514的抗菸草赤星病菌實驗效果圖；
[0028] 圖6為伯克氏菌?Μ AF 1514的抗白菜黑斑病菌實驗效果圖。
【具體實施方式】
[0029] 為了使本發明實現的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結 合具體圖示，進一步闡述本發明。
[0030] 實施例1 :
[0031] 採集雲南省文山地區一塊三七田中的三七根際土壤進行相關的試驗，其具體步驟 為：
[0032] (1) 土樣處理：準備滅菌Ih後的三角瓶，純水，以及玻璃珠。將玻璃珠放入裝有 20ml無菌水的三角瓶中，並取2. Og新鮮土樣加入三角瓶中，混勻，室溫下150r/min搖勻 45min〇
[0033] (2)塗布：取ImL(I)中的混懸液加入9. OmL無菌水，連續稀釋3次獲得稀釋度為 1〇_4的樣品液，接著取120 μ L樣品液均勻塗布在分離培養基（牛肉膏蛋白腖）上，並做三 個重複。
[0034] (3)培養與純化：塗布好的平板於28°C培養3天，之後挑取在牛肉膏蛋白腖培養基 上的單個菌落在ISP2瓊脂培養基上畫線純化培養，純化培養後得到的菌株作為供試菌株， 並用牛奶管將菌株進行保藏。
[0035] (4)分類地位的確定：提取供試菌株的DNA，進行16SrRNA測序確定菌株的分類地 位。
[0036] (5)活性篩選：採用水瓊脂擴散法進行活性篩選，將其菌株發酵3天，取其發酵液 作用於混有病原菌的培養基（培養基成分：0.8%的多聚蛋白腖，0.4%的酵母提取物）中， 觀察其透明圈的大小。
[0037] (6)活性驗證：將其新鮮菌體接種於混有病原菌的培養基（培養基成分：0. 8%的 多聚蛋白腖，0.4%的酵母提取物）上，觀察其抑菌圈的大小。
[0038] 通過以上實驗篩選出抗菌效果最好的一株菌株（YM AF 1514)，並擴大培養，提取 其DNA，通過16SrNA克隆測序確定了分類地位，其登錄號為：KM487703,該菌株隸屬於變形 菌門-變形菌綱-伯克氏菌目-伯克氏科-伯克氏菌屬。並於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，保藏編號為：CGMCC NO. 9733,保藏日期為2014年9月24日。
[0039] 保藏號為：CGMCC NO. 9733的菌株的生物學特徵為：該菌為革蘭氏陰性細菌，需氧 型，在培養基（含0.8%的多聚蛋白腖+0.4%的酵母提取物）上生長的菌落為圓形，呈密 黃色，表面及邊緣光滑、潮溼，電鏡下觀察呈棒狀。該菌最適合生長溫度為28-30°C，pH為 5. 5-6〇
[0040] 實施例2 :
[0041] 利用保藏編號為CGMCC NO. 9733的菌株進行抗菌實驗：先將這株菌在含0. 8%多 聚蛋白腖和〇. 4%酵母提取物的培養基上培養2天，繼而挑取單菌落轉接到搖瓶裡面培養3 天；再用水瓊脂擴散法將其代謝產物與植物致病菌：尖端鐮孢菌（三七病原菌）、香蕉枯萎 病菌、番茄灰毒病菌、菸草赤星病菌、白菜黑斑病菌進行作用，如圖2-圖6,發現其代謝產物 對植物致病菌具有很好的拮抗作用。
[0042] 實施例3 :
[0043] 將保藏編號為CGMCC NO. 9733的菌株在含0. 8%多聚蛋白腖和0. 4%酵母提取物 的培養基上培養2天，並準備好裝有無菌水的玻璃試管；將菌體製成菌懸液，所述菌懸液濃 度為0D600 = 1. 62,然後將已製備的菌懸液分別按1:100倍稀釋應用。準備3個重複以及空 白對照，將其作用於同樣條件下正常生長的三七盆中，分別在1個月、3個月、6個月、12個月 這幾個時間段觀察和記錄三七的生長狀況，結果發現：在1個月後，對照組的植株與試驗組 的植株相比，沒有其顯著的差異；3個月後，對照組與試驗組的植株間則出現了差異，表現 為：對照組的植株有17. 96%的出現了葉子變黃，邊緣萎縮的症狀，而試驗組的僅有4. 23% 的植株出現了這樣的情況；6個月後則變為對照組的有29, 56%的植株出現了枯黃，而試驗 組的僅有11. 26%的植株出現了枯黃；12個月後，對照組的植株有40. 67%的植株出現了枯 死的症狀，而試驗組的有17. 3%的植株有此現象，說明這株菌在盆栽試驗中能對三七的土 傳病害起到很好的作用。
[0044] 實施例5 :
[0045] 將保藏編號為CGMCC NO. 9733的菌株轉為三七田間試驗，在田間自然栽培環境下 驗證該菌株對三七根腐病害的抑制效果，具體如下：
[0046] (1)供試土壤基本情況：試驗安排於硯山三七種植區的連作障礙土壤，試驗區常 年根腐發病率在30% - 60%，並隨連作年限延長發病率不斷攀升，有的片區土壤已不能耕 種，發病率高達80%以上，甚至全棚絕收。本試驗選用了區域已連作三七3年的大棚土壤供 試研究，在6個棚內分別設置6組對比試驗，每個棚栽設置一組對比試驗，同一個棚內，除試 驗處理差異外，保持試驗區土壤環境及栽培管理技術相統一。
[0047] (2)試驗處理與方法：在6個棚栽內施用菌懸液處理分別標記為V A2、A3、A4、A5、 A6，未施用菌懸液的對照處理分別標記為CKp CK2、CK3、CK4、CK5、CK6，試驗各處理小區面積均 為5X2 = 10m2,把已製備0D600 = L 62的菌懸液分別按1:100倍稀釋應用，A1至A6的各 處理施入的稀釋菌懸液均為lOOml/m 2,移栽蓋土後均勻噴施於表土，覆蓋6-8cm松茅後各處 理墒面均勻噴施清水50kg KK1至CK2的各對照處理移栽蓋土後均勻噴施清水IOOmVm2於 表土，覆蓋6-8cm松茅後各處理墒面均勻噴施清水50kg。
[0048] (3)試驗結果：如表1所示，從不同的田間對比試驗看出，施用本發明提供的菌懸 液處理的A 1至A6，其出苗率在69. 7 - 89. 3 %，而同地對照的CK1至CK6，其出苗率在46. 5 - 74. 5%，說明使用本發明提供的菌懸液能顯著提高同地塊的三七出苗率；全年發病率平均 值來看，A1至慫各處理組分別比CK 1至CK6同地塊對照組降低30-40%，說明使用本發明提供 的菌懸液能顯著降低同地塊的三七全年發病率。因此，本發明的保藏編號為CGMCCN0. 9733 的菌株對抑制三七根腐病害的發生及蔓延具有較好的作用功效，針對三七連作障礙情況宜 開發成土壤生物修復產品推廣應用。
[0049] 表1 :三七種植土壤生物修復對比試驗日/月
[0050]
【權利要求】
1. 一種伯克氏菌菌株（Burkholderia arboris) YIM AF 1514,於 2014 年 9 月 24 日保 藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC NO. 9733。
2. -種採用權利要求1所述保藏編號為CGMCC NO. 9733的伯克氏菌菌株HM AF 1514 製備的菌懸液，其特徵在於，所述菌懸液濃度為0D600 = 1. 62。
3. 根據權利要求2所述菌懸液，其特徵在於，製備菌懸液時所用培養基含有0. 8%的多 聚蛋白腖和〇. 4%的酵母提取物。
4. 權利要求1所述伯克氏菌HMAF 1514在防治三七土傳病害中的應用。
5. 權利要求2所述菌懸液在防治三七土傳病害中的應用。
【文檔編號】C12N1/20GK104371952SQ201410519966
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月30日 優先權日:2014年9月30日
【發明者】官會林, 陸曉菊, 唐蜀昆 申請人:雲南師範大學