起搏通道基因亞型hcn4重組慢病毒載體的構建方法

2023-12-11 01:36:07 4

專利名稱：：起搏通道基因亞型hcn4重組慢病毒載體的構建方法
技術領域：
：本發明涉及一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法。
背景技術：
：哺乳動物基因組編碼四種HCN基因，分別命名為HCN1HCN4。這四種異構體在心臟中均已發現，但不同種屬、不同心臟組織和發育不同階段這些異構體的表達存在差異不同種屬成年動物竇房結均優勢表達HCN4，約佔竇房結總體HCN的80%。在四種異構體中HCN1，2，4是心臟中的主要部分，HCN3隻在胚胎起搏細胞中有低水平表達。起搏活性小的區域(如心室肌)，HCN2的表達佔優勢；而起搏活性高的區域HCN4的表達佔優勢。目前對於生物起搏的研究集中於HCN2和HCN4。目前的研究大多使用腺病毒表達系統來初步探討生物起搏的可行性；雖然此類研究也獲得了較大的成就，但由於腺病毒表達系統具有高免疫原性，其病毒基因組游離於宿主基因組外，所以只能瞬時表達外源基因，國外體內的研究僅僅持續了3-10天，這就限制了它的發展。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，具有逆轉錄病毒的基本結構，但也有不同於逆轉錄病毒的組份和特性，該病毒既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因組可以整合於宿主基因組中，長時間、穩定表達外源基因並具有較低的免疫原性，這是其最為突出的優點。可見慢病毒可能是基因治療的最佳載體，以後的發展趨勢也許是利用慢病毒為載體，結合細胞治療和基因治療；把起搏基因HCNl-4轉到幹細胞中，增加起搏細胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。而構建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎。
發明內容本發明目的是提供一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，將帶有HCN4基因的穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒一起建立HCN4重組病毒載體，成為慢性心律失常的細胞治療和基因治療的基礎。本發明的技術方案是一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDHl-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。本發明進一步的技術方案是一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDHl-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒；所述穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4的獲得包括以下步驟(1)將目的片段HCN4基因從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質粒中，獲得Pucl9-HNC4質粒；(2)將目的片段HCN4基因從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中，獲得pcDNA3.1A-HNC4質粒；(3)將目的片段HCN4基因從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒中，獲得穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4。所述構建方法還包括將穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統重組後的慢病毒載體包裝質粒共轉染HEK293細胞，獲得病毒液；對病毒液進行病毒滴度測定，並進行濃縮和純化得到高質量的病毒液。在病毒液的製備過程中，首先對穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4的製備步驟(l)所得的Pucl9-HCN4質粒利用EcoRl單酶切進行鑑定；其次對穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4的製備步驟(2)所得的pcDNA3.1A-HNC4質粒利用XbaI單酶切進行鑑定；然後對穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4的製備步驟(3)所得的pCDHl-GFP-HCN4質粒利用XbaI單酶切進行鑑定；最後通過感染宿主細胞對病毒液中的HCN4重組慢病毒載體進行了鑑定，證明了穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統重組後的HCN4慢病毒載體是正確的。本發明的優點是慢病毒是逆轉錄病毒的一種，其最為突出的優點包括其既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因組可以整合於宿主基因組中，長時間、穩定表達外源基因並具有較低的免疫原性。把帶有起搏基因HCN4的片段重組到慢病毒中，進而再轉到幹細胞中，以增加起搏細胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。因此，構建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎。圖1為獲取Puc-19-HCN4質粒的EcoRI單酶切產激諒脂糖凝膠電泳結果A泳道XDNA/HindIIIMarker;B、D、E泳道陽性菌落(Pucl9+目的片段^6.3kb)，艮卩Pucl9隱HNC4;C泳道陰性菌落(PUC19:2.7kb);圖2為獲取pcDNA3.1A-HNC4質粒的XbaI單酶切產物瓊脂糖凝膠電泳結果-A泳道ADNA/HindIIIMarker;B、C、D泳道陽性菌落(pCDNA3.1A:5.5kb;目的片段3.6kb)，即pCDNA3.1A-HNC4;圖3為獲取pCDHl-GFP-HNC4質粒的XbaI單酶切產物瓊脂糖凝膠電泳結果A、E、G、I泳道陽性菌落(pCDHl-GFP:7.5kb;目的片段3.6kb)，即pCDHl-GFP-HNC4;B、C、D、F、H泳道陰性菌落；J泳道ADNA/HindIIIMarker;圖4為pCDHl-GFP-HNC4質粒的PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳結果A泳道MarkerI(TIANGEN);B、C、D、E泳道分別為A、E、G、I質粒的PCR產物(432bp);圖5為轉染293T細胞24小時後的螢光照片；圖6為病毒感染豬骨髓幹細胞48小時後，目的細胞的螢光照片；圖7為Westernblot蛋白電泳圖一；幹擾原代細胞；對照穩轉細胞；圖8為Westernblot蛋白電泳圖二；幹擾原代細胞；對照穩轉細胞；圖9為RNA電泳圖10為HCN4real-timeRT-PCR實時定量檢測結果圖11為慢病毒包裝系統建立穩定表達HCN4基因的骨髓幹細胞的操作流程圖。具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述實施例一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDHl-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。所述穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4的獲得包括以下步驟(1)將目的片段HCN4基因從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質粒中，獲得Pucl9-HNC4質粒；(2)將目的片段HCN4基因從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中，獲得pcDNA3.1A-HNC4質粒；(3)將目的片段HCN4基因從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒中，獲得穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4。所述構建方法還包括將穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統混合重組後的HCN4慢病毒載體包裝質粒共轉染HEK293細胞，獲得病毒液；對病毒液進行病毒滴度測定，並進行濃縮和純化得到高質量的病毒液。具體實施例一、HCN4-cDNA表達載體的構建
發明內容1、試劑和耗材1)載體pCDHl-MCSl-EFl-copGFP(7544bp)(上海康成生物公司)；pcDNA3(5.4kb)(上海康成生物公司)；pucl9(2686bp)(上海康成生物公司)；pcDNA.3.1/myc-His(-)A(5.5kb)(上海康成生物公司)；pCDNA3-hHCN4(蘇州大學附屬第一醫院心內科實驗室保存)。2)LaTaq酶TAKARA3)連接試齊U盒Epicentre4)限制性內切酶NEB5)製備感受態試劑盒BIOSCIENCES6)小量抽提試齊U盒Axygen、Qiagen7)凝膠回收試劑盒Qiagen8)入DNA/HindIIIMarker:TAKARADNAMarkerI:TIANGEN9)電熱恆溫培養箱上海森信實驗儀器有限公司10)恆溫搖床華美生化儀器11)電熱恆溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司12)電泳儀君意東方電泳設備13)數碼凝膠處理系統天能科學儀器2、步驟和方法重組質粒pCDNA3-hHCN4的目的序列插入於pcDNA3載體上，插入的位點為EcoRI和XbaI，首先從質粒pCDNA3-hHCN4中用EcoRI和XbaI切下目的片段連接到Pucl9載體中，再用EcoRI和HindIII切下目的片段連接到pcDNA3.1(A)載體中，再用XbaI單酶雙切到pCDHl-MCSl-EFl-copGFP中。質粒用XbaI或者EcoRI鑑定。(一)、將目的片段從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質粒中1)對帶有目的片段的pcDNA3-HCN4和Pucl9用EcoRI和XbaI進行順序雙酶切(由於EcoRI和XbaI沒有適合的雙酶切buffer,因此採用順序酶切)a)XbaI酶切體系如下XbaI(20U/ji1)lfilNEBuffer2(10X)3^ilpcDNA3-HCN4/Pucl9(SOOng/pl)2^ildH2024^1共計30^1反應條件如下37°C、6小時；b)將單酶切產物進行乙醇沉澱30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(pH5.2)，再加入70ul無水乙醇，一20'C沉澱30分鐘；lOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，沉澱進行下一步酶切反應；c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/nl)NEBufferEcoRI(10X)3jilpcDNA3-HCN4/Pucl9(500ng/jil)2^1dH2024jil共計30jil反應條件為37°C、6小時。2)對酶切載體和目的基因片段進行凝膠電泳後回收，由於紫外線會造成鹼基突變，因此在該步驟中不進行拍照，直接切膠回收，回收方法如下a)在紫外燈下，用乾淨的手術刀將目的片斷條帶切下，放於乾淨的1.5ml離心管中，儘量不要切到多餘的凝膠；b)稱重，加三倍體積的BufferQG到離心管中，即每100mg凝膠加300ulBufferQG;c)將離心管放於5(TC水浴中，放置10分鐘，直至凝膠完全融解，期間每兩、三分鐘晃動離心管一次；d)觀察凝膠溶液的顏色，如果為橙色或紫色，則添加5ul3M的NaAC(pH5.2);e)加100ul，即一倍凝膠體積的異丙醇於凝膠溶液中，將凝膠混合液加入到QIAquickspincolumn中，將回收柱插於2ml廢液收集管中，13，000rpm離心一分鐘；f)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.5mlBufferQG，13，000rpm離心一分鐘；g)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，柱中添加0.75mlBufferPE,放置2—5分鐘，13，000rpm離心一分鐘；h)棄收集管中廢液，將回收柱插回收集管中，13，000rpm離心一分鐘；i)將回收柱取下插入乾淨的1.5ml離心管中，柱中加入50ulBufferEB(10mMTris-Cl，pH8.5)到柱子中心的膜上，放置2—5分鐘，13，000rpm離心一分鐘；若想獲得更多量的回收產物，可以重複該步驟一次；1.5ml離心管中則為回收產物。3)將回收的雙酶切的Pucl9和目的基因片段進行連接反應，根據Epicentre試劑盒說明書進行如下操作a)連接體系如下:線性化Pucl9雙酶切目的基因10xbufferATPLigasedH202^1lul1.3^1共計lOfilb)反應條件室溫連接8分鐘；將連接產物轉化大腸桿菌，塗布Amp+LB平板，37'C過夜培養a)取一80'C保存的DH5a感受態細菌，冰浴放置5-10分鐘，使之冰中融化；b)將5nl連接產物加入感受態細菌，用移液槍緩慢混勻，冰浴放置30分鐘；c)將混有連接產物的感受態細菌放入42'C水浴中，熱擊90秒，冰浴2分鐘；d)將轉化產物加入900ul的SOC培養基中，37°C、150rpm搖床培養1小時；e)3，000rpm離心2分鐘，棄上清，加入200ulLB培養基重懸細菌塗布AmpLB平板。其中根據BIOSCIENCES試劑盒說明書製備感受態細菌，過程如下a)取DH5a甘油菌種，在LB平板中劃線，37'C培養箱中培養過夜；b)挑取一個單克隆接種入0.5mlLB培養基中，240rpm，37C搖床培養過夜；c)將過夜培養的0.5ml菌液轉移到50mlSOB培養基中，240rpm，25°C搖床培養，直至OD600在0.4-0.6之間；d)將培養細菌的錐形瓶放於冰上冷卻IO分鐘；e)將菌液轉移到滅菌的50ml離心管中，2,500Xg，4'C離心6分鐘；f)棄上清，用5ml冰上預冷的1Xwashbuffer重懸沉澱，2，500Xg，4°C離心6分鐘；g)棄上清，用5ml預冷的1Xcompetentbuffer重懸沉澱；h)小量分裝，每管100ul，快速放入液氮中；i)一8(TC保存，備用。挑取單菌落，接種於5mlAmp+LB液體培養基中，37°C、250rpm搖床培養過夜；使用Axygen質粒抽提試劑盒提取質粒，根據Axygen試劑盒說明書質粒抽提步驟如下a)過夜培養的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩餘3ml分兩次於一個1.5ml離心管中12，000Xg離心1分鐘，徹底去除上清；b)加入250WBefferSl，振蕩器充分重懸細菌；c)加入250^1BefferS2，顛倒混勻4一6次；注意不能劇烈混合，否則會出現基因組DNA汙染；d)加入250|alBefferS2五分鐘內加入350nlSolutionIII,輕輕顛倒混勻6—8次；e)12，000Xg，離心10分鐘；將上清轉移到Miiiiprep柱中，Miniprep柱插於廢液收集管中，12，000Xg離心1分鐘；注意不要吸到沉澱，否則會出現基因組DNA和蛋白質汙染；f)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱插於收集管中，加700WBufferW2到Miniprep柱中，12,000Xg離心1分鐘；重複該步驟一遍；g)棄收集管中的廢液，將Miniprep柱放入同一支收集管中，12，000Xg離心1分鐘徹底去除BufferW2;h)將Minipre柱放入新的乾淨的1.5ml離心管中，力B50^1Eluent，室溫放置1分鐘後，12，000Xg離心1分鐘；離心管中的溶液即為所抽提的質粒，抽提後質粒濃度統一調整為500ng/ul。抽提的質粒使用EcoRl單酶切鑑定目的片段是否插入Pucl9質粒中，插入了目的片段的質粒命名為Puc-19-HCN4:a)酶切體系如下EcoRI(20U/nl)NEBufferEcoRI(10X)3jdPucl9-HCN4(500ng/fil)2(ildH2024jil共計30jilb)反應條件為37°C、6小時。使用酶切產物5nl上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖l所示。(二)、將目的片段從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中l)對帶有目的片段的Pucl9-HCN4和pcDNA3.1A用EcoRI和HindIII進行雙酶切(由於EcoRI和HindIII沒有適合的雙酶切buffer,因此採用順序酶切)a)酶切體系如下HindIII(20U/nl)lfdNEBuffer2(10X)3^1Pucl9-HCN4/pCDNA3.1A(500ng/nl)2fddH2023fil共計30^1反應條件如下37°C、6小時；b)將單酶切產物進行乙醇沉澱30ul酶切體系中加入3ul3M乙酸鈉(pH5.2)，再加入70ul無水乙醇，一20'C沉澱30分鐘；lOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，沉澱進行下一步酶切反應；c)EcoRI酶切體系如下EcoRI(20U/fd)lfilNEBufferEcoRI(10X)3filpcDNA3-HCN4/Pucl9(500ng/fil)2fildH2024fd共計30fil反應條件為37°C、6小時；2)對酶切載體和目的基因片段進行凝膠電泳後回收，由於紫外線會造成鹼基突變，因此在該步驟中不進行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(一)所述；3)將回收的雙酶切的pCDNA3.1A和目的基因片段進行連接反應，根據Epicentre試劑盒說明書進行如下操作a)連接體系如下線性化pCDNA3.1Aljil雙酶切目的基因5^110xbufferlfilATPlulLigase0.7(UdH201.3jilb)反應條件室溫連接8分鐘；4)將連接產物轉化大腸桿菌，塗布Amp+LB平板，37'C過夜培養；5)挑取單菌落，接種於5mlAmp+LB液體培養基中，37°C、250rpm搖床培養過夜；使用Axygen質粒抽提試劑盒提取質粒，方法同步驟(一)；6)抽提的質粒使用XbaI單酶切鑑定目的片段是否插入pCDNA3.1A質粒中，此時載體中目的片段兩端分別有一個Xbal酶切位點，前面一個是pCDNA3.1A自身帶有的，後面一個為從Pucl9質粒中帶來的，因此使用XbaI單酶切，若為陽性克隆則能看到兩條電泳條帶，一條為目的片段3.6kb，另一條為pCDNA3.1質粒5.5kb。插入了目的片段的質粒命名為pCDNA3.1A誦HCN4:a)酶切體系如下XbaI(20U/nl)lfdNEBuffer2(10X)3^1pCDNA3.1A-HCN4(500ng/fi1)2fUdH2024jil共計30fdb)反應條件如下37°C、6小時；使用酶切產物5ul上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示。(三)、將目的片段從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒中l)對帶有目的片段的pcDNA3.1A-HNC4和pCDHl-MCSl-EFl-copGFP(以下簡寫為pCDHl-GFP)用XbaI進行單酶切a)酶切體系如下XbaI(20U/ja1)1^1NEBuffer2(10X)3fi1pcDNA3.1A-HNC4/pCDHl-GFP(500ng/nl)2^1dH2024jd共計30jilb)反應條件如下37°C、6小時；2)對酶切載體和目的基因片段進行凝膠電泳後回收，由於紫外線會造成鹼基突變，因此在該步驟中不進行拍照，直接切膠回收，回收方法同步驟(一)所述；3)將回收的單酶切的pCDHl-GFP和目的基因片段進行連接反應，根據Epicentre試劑盒說明書進行如下操作a)連接體系如下線性化pCDHl-GFP(O.lug/ul)lfil單酶切目的基因5pl10xbufferlfilATPlulLigase0.7(ddH201.3fd共計lOfilb)反應條件室溫連接8分鐘；4)將連接產物轉化大腸桿菌，塗布Amp+LB平板，37'C過夜培養；5)挑取單菌落，接種於5mlAmp+LB液體培養基中，37'C、250rpm搖床培養過夜；使用Axygen質粒抽提試劑盒提取質粒，方法同步驟(一)；6)抽提的質粒使用Xbal單酶切鑑定目的片段是否插入pCDHl-GFP質粒中，插入了目的片段的質粒命名為pCDHl-GFP-HCN4:a)酶切體系如下XbaI(20U/jil)lulNEBuffer2(10X)3filpCDHl-GFP-HNC4(500ng/fU)2fddH2024jd共計30^1b)反應條件如下37°C、6小時；使用酶切產物lOul上樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示;7)將A、E、G、I質粒作為模板，使用巢式引物進行PCR鑑定a)根據HNC4基因序列設計巢式引物序列為nestHCN4-F(4259)GACGGCTCCTACTTTGG驗nestHCN4-R(4691)b)PCR體系如下LABuffer(MgC12+)Taq(2.5U/ul)dNTP(25mM)Fprimer(10uM)Rprimer(10uM)pCDHl-GFP國HNC4dH20共計C)PCR反應條件如下94。C94°C55。C72°C72。C4°CGGTGGGTGAGGGCTAT2.5ul0.25ul4ul0.25ul0.25ulO.lul17.65ul25ul3分鐘20秒20秒33循環40秒5分鐘+00取lOulPCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如4所示。(四)使用Qiagen小抽試劑盒抽提去內毒素質粒用於後續的細胞轉染實1)吸取lOul陽性克隆的菌保接種於2—5mlAmp+LB培養基中，37°C、300rpm搖床培養8小時；2)將步驟l)中培養的菌液按1/500或1/1000接種到Amp+LB中，即3-6ul菌液接種於3mlAmp+LB中，37°C、300rpm搖床培養12—16小時；3)菌液轉移至1.5ml離心管中，4°C、6000Xg離心15分鐘；4)棄上清，力tl0.3ml含有RNaseA的BufferPI重懸細菌沉澱，振蕩、充分重懸；5)加入0.3mlBufferP2，顛倒混勻4一6次，不能振蕩混勻，以免出現基因組汙染，室溫放置5分鐘；6)加入0.3ml預冷的BufferP3，顛倒混勻4一6次，冰上放置5分鐘；7)4°C、20，000Xg離心IO分鐘，將上清轉移至乾淨的離心管中；重複該步驟一次；8)將lmlBufferQBT力卩入QIAGEN-tip20中，Buffer靠重力作用流過QIAGEN誦tip20以平衡QIAGEN-tip20;9)將步驟7)中的上清加入到QIAGEN-tip20中，溶液靠重力作用流出，質粒DNA則結合在QIAGEN-tip20的膜上；10)用2mlBufferQC洗QIAGEN-tip20兩次；11)用500ulBufferQF將質粒從QIAGEN-tip20的膜上洗脫下來。12)12)取l一2ul用分光光度計測定質粒濃度，用無菌水將質粒濃度調整為0.5ng/ul，以備後續細胞轉染實驗用。二、使用慢病毒系統建立HCN4重組慢病毒載體及其轉染骨髓幹細胞後的鑑定，1.主要試劑、儀器和耗材1)細胞原代培養細胞、293T(中科院細胞庫)2)轉染試劑Lipofectamine2000(InvitrogenCat.#11668-019)3)穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4(500ng/ul，第一部分質粒構建部分中構建的攜帶目的基因的穿梭質粒)4)慢病毒包裝系統pPACKHl-LentivectorPackagingKit(SBICat.#LV500A-1)5)細胞及組織總蛋白抽提試劑盒(KangChen，KC-415)6)RNA酶抑制劑(Promega)7)MMLV反轉錄酶(Promega)8)5xRT緩衝液(250mMTris隱HCl，pH8.3,200mMKC1，40mMMgC12，5mMDTT)(Promega)9)2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(華美生物工程公司)10)Oligo(dT)18(上海生工生物工程有限公司)11)2.5mMdNTP混合液(dATP,dGTP,dCTP和dTTP各2.5mM)(華美生物工程公司)12)Taq聚合酶(Promega)13)100bpDNALadder(華美生物工程公司)14)10，000xSybergreen(MolecularProbes)15)兔抗HCN4抗體(ADI公司)16)生物安全柜上海淨化設備有限公司SW-II-A/B317)螢光倒置顯微鏡上海長方CFM-50018)C02培養箱LabotectE540019)濾膜Millex-HV0.45jimPVDFfilters(Millipore，Cat.#SLHVR25LS)20)勻漿器上海康華生化儀器21)低溫離心機上海安亭科學醫學儀器廠22)FeroTecGradienPCR基因擴增儀杭州大和熱磁電子有限公司23)DYY-8型穩壓穩流電泳儀上海琪特分析儀器有限公司24)H6-l微型電泳槽上海精益有機玻璃製品儀器廠25)Rotor隱Gene3000RealtimePCR儀Corbe"Research26)引物設計軟體Primer5.027)Rotor-gene6.0:CorbettResearch2、方法和步驟(一)、慢病毒包裝系統(pPACKHl-LentivectorPackagingKit)建立穩定表達HCN4基因的骨髓幹細胞(實驗過程參照SBI的LentivectorExpressionSystem的操作手冊進行)，操作流程圖見圖ll。1)假病毒顆粒的包裝(包裝好的假病毒顆粒中含有帶有目的基因的穿梭質粒)；a)轉染前2-3天，DMEM完全培養基培養293T細胞株。轉染前一天，接種293T細胞到新的10cm培養皿，接種量約為5x106，完全吹散細胞，充分混勻，使細胞均勻分布。轉染時，細胞鋪滿培養皿的50-70%;b)將2jig(濃度為500ng/jil)帶有目的基因的穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4同10jig(濃度為500ng/ul)慢病毒包裝質粒混合物混合，將混合的質粒稀釋到750fdopti-MEM培養基中，充分混勻，室溫孵育5分鐘；c)將60filLipofectamine2000TM轉染試劑稀釋到750^1Opti-MEM培養基中，輕輕地混勻，室溫孵育5分鐘；d)將稀釋的Lipofectamine2000TM試劑逐滴加入到質粒-opti-MEM混合液中，輕輕地上下顛倒混勻，室溫孵育20分鐘；e)在第4步孵育形成轉染混合物的同時，用10mlOpti-MEM洗293T細胞一次，然後加入8.5ml含2%血清不含抗生素的D-MEM培養基；f)將第4步中產生的質粒-Lipofectamine2000TM混合物加入第5步處理後的培養皿中，輕輕地混勻使轉染複合物均勻分布在培養基中，37°C、5%C02培養箱中培養；g)6小時後，用新鮮的含抗生素和2%血清的D-MEM培養基替換掉含有轉染混合物的培養基，繼續培養48小時；h)收集轉染後24和48小時的上清液；用含2%血清不含抗生素的D-MEM培養基替換掉上清液；i)注意觀察培養基的顏色，培養24小時後和48小時後，由於293T細胞的代謝活性，會引起培養基顏色變黃(呈酸性)；j)將含有假病毒顆粒的培養基3000rpm室溫離心5分鐘，去除細胞碎片，然後將上清用Millex-HV0.45nm的PVDF濾膜過濾；過濾後的病毒液直接感染目的細胞；注意步驟b)到步驟j)是對有感染性的假病毒顆粒進行操作，因此需根據推薦的符合二級生物安全防護水平的安全指南進行實驗。病毒液可以直接一80'C凍存無需添加冷凍保護劑，但反覆凍融一次，病毒滴度降低20—30%。轉染293T細胞24小時後的拍攝螢光照片。2)慢病毒感染目的細胞建立穩定表達AKT1的細胞a)感染前一天，將原代培養細胞接種於24孔板中的五個孔，每孔接種105;添力n0.5ml含有10%FBS的DMEM培養基，37°C、5XC02培養箱中培養；b)細胞培養24小時後，進行病毒感染實驗；實驗分五組進行，先吸去24孔板中舊的培養基，然後i.第一個孔中加入lml含有10%FBS的DMEM;ii.第二個孔中加入0.25ml病毒液和0.75ml含有10%FBS的DMEM;iii.第三個孔中加入0.5ml病毒液和0.5ml含有10%FBS的DMEM;iv.第四個孔中力B入0.75ml病毒液和0.25ml含有10%FBS的DMEM;V.第五個孔中加入lml病毒液；最後各孔中均加入Polybrene，終濃度為12ug/ml;37'C、5XC02培養箱中培養；c)病毒感染12小時後，吸去舊的培養基，加入lml含有10XFBS的D-MEM培養基，37'C、5XC02培養箱中培養；d)病毒感染48小時後，目的細胞出現螢光，其中加入lml病毒液的實驗組細胞感染效率達到90%以上，細胞可以進行傳代擴大培養，用於各種細胞實驗，無需挑選單克隆細胞擴大培養；拍照。將24孔板中的穩定細胞株擴大培養，當細胞培養到足夠量時，收集細胞RNA和蛋白用於實時定量PCR鑑定和WesternBlot鑑定；其餘細胞做在體實驗。(二)、原代細胞和穩轉細胞繼續培養兩周後行Westernblot鑑定蛋白的表達蛋引物白抽提方法1)從貼壁細胞培養瓶中小心傾去培養液。2)預冷的PBS清洗貼壁的細胞2次，小心傾去PBS。3)配置含抑制劑的蛋白質抽提試劑(1ml抽提試劑中加入5nl蛋白酶抑制劑混合液，5filPMSF和5pl磷酸酶混合液)。4)細胞瓶中加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提試劑(107個細胞中加入1ml抽提試劑；5x106個細胞中加入0.5ml抽提試劑)，輕輕搖動5分鐘。5)用一預冷的橡膠和塑料細胞刮將培養瓶壁上貼壁細胞刮下來，轉移細胞懸浮液到離心管中，冰浴下搖動15分鐘進行裂解。6)裂解液於預冷的離心機中14,000xg離心15分鐘。棄去沉澱，上清液立刻轉移入新的離心管中保存待用。使用上清液5ul上樣，凝膠蛋白電泳。(三)、原代細胞和穩轉細胞繼續培養兩周行real-timeRT-PCR實時螢光定量檢測1)RNA抽提TrizolRNA抽提及質量檢測方法和步驟a)勻漿轉基因細胞培養兩周後，離心沉澱細胞。加入1mlTRIZOL試劑，使用勻漿器破碎細胞使其裂解。注意避免在加入TRIZOL試劑進行裂解前清洗細胞，因為清洗會很可能導致mRNA的降解。b)兩相分離勻漿後樣品於1530。C孵育5分鐘，以便核酸蛋白複合體完全解離。每1ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒後，15~30。C孵育2至(J3分鐘。4°C下12,000xg離心l5分鐘。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配於水相中。水相的體積大約使勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。c)RNA沉澱將水相轉移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉澱其中的RNA，加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入1mlTRIZOL試劑的此時加0.5ml的異丙醇。混勻後15~30。C孵育10分鐘後，於4。C12,000xg離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。d)RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75%乙醇，清洗RNA沉澱。振蕩後，4°C7,500xg離心5分鐘。e)重新溶解RNA沉澱去除乙醇溶液，空氣中乾燥RNA沉澱5~10分鐘，切勿真空離心乾燥。注意RNA沉澱不要完全乾燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小於1.6。2)RNA質量檢測a)紫外吸收測定法取少量液體用TE稀釋(一般1:100稀釋)後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，可以測定RNA溶液濃度和純度。用來稀釋的TE不需要經過無RNA酶處理，因為RNA的微量降解不會明顯影響分光光度計的讀值。測量前需先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。i)濃度測定A260下讀值為1表示40jigRNA/ml。樣品RNA濃度(fig/ml)計算公式為A260x稀釋倍數x40jig/ml。ii)ii)純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法，比值範圍1.8到2.1。b)變性瓊脂糖凝膠電泳i)制膠1g瓊脂糖溶於72ml水中，冷卻至60°C，10ml的10xMOPS電泳緩衝液和18加1的37%甲醛溶液(12.3M)。10xMOPS電泳緩衝液濃度成分0.4MMOPS,pH7.00.1M乙酸鈉0.01MEDTA灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25pl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1xMOPS電泳緩衝液至覆蓋膠面幾個毫米。ii)準備RNA樣品取3pgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB於甲醛上樣染液中至終濃度為10/ml。加熱至70°C孵育15分鐘使樣品變性。iii)電泳上樣於膠孔中，5-6V/cm電壓下電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm03)以提取的RNA為模板合成cDNA:a)配製退火混合物RNA3jig0.5ug/ulOligo(dT)18ljil加無RNA酶的H20至總體積10pi混合液在7(TC水浴3分鐘，降到37'C放置10分鐘。b)RT反應液5xRT緩衝液4pi2.5mMdNTP混合液4jilRNA酶抑制劑1piMMLV反轉錄酶1Jll混合後37'C恆溫1分鐘c)力t]10pl的RT反應液到10pl退火混合物中，37。C水浴60分鐘，加熱到95。C維持5min。得RT終溶液即為cDNA溶液，置冰浴待用。4)合成的cDNA用於實時定量PCRa)製備用於繪製標準曲線的梯度稀釋DNA模板i)針對每一需要測量的基因和管家基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應dNTP(2.5mMeach)2.5^110xPCR緩衝液2.5jilMgC12溶液1.5plTaq聚合酶lunits10uM的PCR特異引物Flpl10uM的PCR特異引物R1^1cDNA1pl加水至總體積為25^1輕彈管底將溶液混合，40個PCR循環(94°C，20秒；退火溫度，20秒；72'C，30秒)；72。C延伸5分鐘。ii)PCR產物與100bpDNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。iii)將PCR產物進行IO倍梯度稀釋設定PCR產物濃度為1，分別稀釋為1x10-1，1x10-2，1x10-3，1x10-4，1x10-5，1x10-6，1x10-7這幾個梯度濃度的DNA。5)進行RealtimePCR反應a)幾個梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置RealtimePCR反應體系。體系配置如下dNTP(2.5mMeach)2.5^1lOxpCR緩衝液2.5MgC12溶液Taq聚合酶SybergreenI10uM的PCR特異引物F10uM的PCR特異引物RcDNAorDNA加水至總體積為1.5^illunits終濃度0.25x1pi25pi輕彈管底將溶液混合，5000rpm短暫離心。b)步驟1配置的PCR反應溶液置於RealtimePCR儀上進行PCR反應。GAPDH:95°C,5min;35個PCR循環(95。C，10秒；58°C，15秒；72°C，20秒；85°C(收集螢光)，5秒)。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束後繼續從72'C緩慢加熱到99°C(每5秒升高l'C)HCN4:95°C，5min;35個PCR循環(95°C，10秒；58°C，15秒；72°C，20秒；85'C(收集螢光)，5秒)。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束後繼續從72'C緩慢加熱到99°C(每5秒升高TC)。表1實時定量PCR使用引物列表基因名雙向引物序列退火溫度(。C)產物長度(bp)GAPDHHCN4F5'AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3'R5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'F5'CCCGCCTCATTCGATATATTCAC3'R5CAGCTGGGTGTGTTGGTCTCAT3'5820358212三、結果1、將帶有目的基因的穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4同慢病毒包裝質粒混合物混合後感染293T細胞後，培養24小時，可以發現大量的螢光出現(如圖5所示)。2.使用慢病毒包裝系統(pPACKHl-LentivectorPackagingKit)和帶有目的基因的穿梭質粒pCDHl混合以Lipofectamine2000作為感染試劑感染豬的骨髓間充質幹細胞，加入lml病毒液的實驗組細胞感染效率可以達到90%以上，病毒感染48小時後，目的細胞出現大量的螢光(如圖6所示)。3.提取蛋白後進行Westernblot的蛋白鑑定結果如圖7和圖8所示，蛋白電泳灰度值如下表所示表2Westernblot蛋白電泳灰度值表tableseeoriginaldocumentpage234.HCN4real-timePCR實時定量檢測中的RNA的濃度、純度測定結果讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，A260下讀值為1表示40^gRNA/ml。樣品RNA濃度(jig/ml)計算公式為A260x稀釋倍數x40pg/ml。表3RNA純度檢測結果表tableseeoriginaldocumentpage23RNA溶液的A260/A280的比值是一種RNA純度檢測方法，比值範圍1.8到2.1。我們的結果顯示OD260/OD280的比值在2左右，符合要求。但是即使比值超出這個範圍，RNA樣品也一樣可以用於一些普通實驗中如Northern雜交，RT-PCR和RNA酶保護實驗。RNA的電泳結果顯示28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小取決於用於抽提RNA的物種類型)，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。各樣品的目的基因和管家基因分別進行RealtimePCR反應。根據繪製的梯度稀釋DNA標準曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正後的相對含量。標準曲線法的相對定量(見附件圖2-6)此方法中量的表達是相對於某個參照物的量而言的，對於所用的標準品只要知道其相對稀釋度即可。在整個實驗中樣本的靶序列的量來自於標準曲線，最終必須除以參照物(對照組)的量，即參照物(對照組)是1倍的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。實時定量PCR時各樣品加樣量均為1fU，然而由於受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉錄效率誤差等的影響，每個樣品的1pl體積的cDNA其含量並不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因GAPDH(不同樣品間表達量基本恆定)作為內參，以樣品待測基因得值除以此樣品內參得值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。待測基因以內參校正。結果顯示穩轉細胞的RNA是原代細胞的120.88倍。表2-4內參校正列表(Neg:原代細胞；W:穩轉細胞)tableseeoriginaldocumentpage24HCN4real-timeRT-PCR實時定量檢測結果如圖10所示。慢病毒具有既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因組可以整合於宿主基因組中，長時間、穩定表達外源基因並具有較低的免疫原性等優點，其可能是基因治療的最佳載體，本發明把帶有起搏基因HCN4的片段重組到慢病毒中，進而再轉到幹細胞中，以增加起搏細胞的起搏電流(If)來治療慢性心律失常。因此，構建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體是研究HCN基因、起搏電流的特性以及生物起搏等的前提和基礎。權利要求1.一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN4重組病毒載體，其特徵在於所述穿梭質粒為pCDH1-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。2.根據權利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，其特徵在於所述穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4的獲得包括以下步驟(1)將目的片段HCN4基因從pcDNA3-HCN4中切下，連接入Pucl9質粒中，獲得Pucl9-HNC4質粒；(2)將目的片段HCN4基因從Pucl9-HNC4中切下，連接入pcDNA3.1A質粒中，獲得pcDNA3.1A-HNC4質粒；(3)將目的片段HCN4基因從pcDNA3.1A-HNC4中切下，連接入pCDHl-MCSl-EFl-copGFP質粒中，獲得穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4。3.根據權利要求1所述的起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，其特徵在於所述構建方法還包括將穿梭質粒pCDHl-GFP-HCN4與慢病毒系統混合重組後的HCN4慢病毒載體包裝質粒共轉染HEK293細胞，獲得病毒液；對病毒液進行病毒滴度測定，並進行濃縮和純化得到高質量的病毒液。全文摘要本發明公開了一種起搏通道基因亞型HCN4重組慢病毒載體的構建方法，包括將帶有HCN4基因的穿梭質粒與病毒系統一起建立HCN4重組病毒載體，所述穿梭質粒為pCDH1-GFP-HCN4，所述病毒為慢病毒。本發明將帶有HCN4基因的穿梭質粒pCDH1-GFP-HCN4與慢病毒一起建立HCN4重組病毒載體，慢病毒具有既可以感染分裂細胞又可以感染非分裂細胞；其病毒基因組可以整合於宿主基因組中，長時間、穩定表達外源基因並具有較低的免疫原性等優點，其可能是基因治療的最佳載體，因此構建起搏通道基因亞型HCN重組慢病毒載體可能成為慢性心律失常的細胞治療和基因治療的基礎。文檔編號C12N15/867GK101173301SQ20071019040公開日2008年5月7日申請日期2007年11月21日優先權日2007年11月21日發明者周亞峰,李紅霞,楊向軍,蔣文平,韓蓮花申請人:蘇州大學附屬第一醫院