瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVα23亞家族的VR基因序列及應用的製作方法

2023-12-03 01:51:26

專利名稱：：瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVα23亞家族的VR基因序列及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一個T細胞受體(TCR)的核苷酸序列，特別涉及瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列。
背景技術：
：近年來，非霍奇金淋巴瘤(NHL)發病率呈持續上升趨勢。據估計，21世紀初，NHL將佔侵襲性惡性腫瘤的4.4。/。，並佔所有癌症死亡數的4.8%。其中瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)是最常見的NHL,約佔30%40%，其中超過60歲的老年患者佔70%。20多年來主要採用以CHOP方案(環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼、潑尼松)為主的化療。但對部分老人有毒性作用，長期生存率低。近期開展的靶向免疫治療如利妥昔單抗(CD20單抗)的出現雖然取得了新的療效，但微小殘留病變的存在導致的疾病復發仍然是目前臨床治療的棘手問題。多年來，各國學者一直在努力尋求更有效的治療方法。臨床腫瘤學家對特異性的細胞免疫治療寄予厚望。Xue等於報導利用從白血病患分離出能夠特異識別HLA-A2限制的WT1抗原表位的CTL，將CTL的TCR基因轉染患者的T淋巴細胞，在小鼠試驗中顯示出轉染細胞的特異殺傷性。隨後Tsnji等將從進一步證明了利用轉導WT1特異的TCR基因的Thl和Tcl顯示出HLA限制的的殺傷作用，同時轉染的Thl細胞具有分泌大量IFN-Y和IL-2的功能，由於IFN-y和IL-2在遏制腫瘤中發揮重要的作用，因而可以通過該轉染相應的TCR基因的方法對腫瘤的免疫治療發揮重要的作用。目前利用腫瘤細胞相關抗原特異的TCR基因修飾正常T細胞(自體的或供者源T細胞)，從而獲得具有殺傷相應腫瘤細胞的細胞毒T淋巴細胞(CTL)，這是近年抗腫瘤特異性細胞免疫治療的一個重要發現。抗原特異TCR修飾正常T細胞而獲得特異抗腫瘤T細胞克隆的研究首先在黑色素瘤中展開，隨後有多個研究擴展了該技術的應用，如特異性抗EB病毒陽性細胞的CTL、抗WT1的CTL，個別已形成了TCL產品用於臨床治療。製備CTL產品的關鍵是明確腫瘤/白血病細胞的相關抗原，從而獲得抗原特異的TCR，進而誘導產生特異抗白血病/腫瘤的T細胞克隆。目前國內外對淋巴瘤的研究主要集中在T細胞型淋巴瘤，而對B淋巴細胞淋巴瘤的研究資料較少，主要原因可能是對B淋巴細胞型淋巴瘤的相關抗原了解得較少有關。
發明內容為了克服上述現有技術存在的不足，本發明的首要目的在於提供一種瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVct23亞家族的VR基因序列。本發明從DLBL患者外周血中存在T細胞受體(TCR)Va亞家族的克隆性T細胞(TCRa和TCR卩鏈分別為TCRa卩+T細胞表面所表達的異源雙鏈TCR的組成部分，兩者在T細胞免疫中具有同樣重要的地位)，經序列分析顯示其特異性TCR序列的高度可變區V-N-J區，即互補決定區3(CDR3)，與抗原特異性識別結合的部位，表明該克隆性T細胞所表達的TCR為DLBL相關抗原刺激所產生的特異性TCR，獲得了DLBL相關的TCR基因序列。本發明公開了針對DLBL相關抗原的特異性TCR的基因序列，尤其是TCR的高度可變區即CDR3，後者是T細胞表面受體識別抗原的特異區域，針對於不同抗原，除了機體所選用的TCRVa亞家族T細胞不同，更為關鍵的是其TCR基因的CDR3序列的差異，該部位決定了所屬T細胞所能識別的抗原。本發明提供的識別DLBL相關抗原的TCRVa23基因序列，由於其CDR3的特異性，僅來自於單一克隆的T細胞，是一高度特異的序列。同時，根據CDR3的基因序列編碼的蛋白質，可用來了解DLBL的相關抗原肽，為了解DLBL的生物學特性提供資料。本發明的另一目的在於提供上述基因序列的應用。根據所獲得的DLBL相關抗原的特異性TCR的核苷酸序列，可以用於(1)了解DLBL病人所存在的抗DLBL的TCRVa23亞家族T細胞的情況，用於評價病人的免疫功能狀態，(2)通過轉基因技術將DLBL相關抗原的特異性TCR基因轉入正常T淋巴細胞中，使其強制表達這種特異性的TCR，改變T細胞內源性TCR識別抗原的原有模式，具備分泌細胞因子和(或)特異殺傷靶細胞的功能，經體外短期培養擴增即可產生足量的CTL，再回輸入患者體內使其對DLBL細胞行使靶向細胞免疫效應。本發明的目的通過下述技術方案來實現一種瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列，所述VR基因序列如下所示CTAGGTTGACCTTTGGGGAAGGAACACAGCTCACAGTGAATCCTGATATGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCTGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAAC。其中，所述基因序列為345個bp:l-89bp為V區；90-95bp為N區；96-144bp為J區；145-345bp為C區。上述瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列翻譯的蛋白質(115AA)如下DFKSNSAVAWSN。其中CDR3區包括V區的下遊端、N區和J區的上遊端。上述瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列的製備方法，包括如下步驟a.收集DLBL患者外周血，Ficoll分層法分離外周血單個核細胞；b.提取外周血單個核細胞的RNA，RT-PCR合成cDNA第一鏈；c.在NCBI的Genebank中査找TCRa鏈的基因序列，並標出各亞家族的V區及C區在基因組中的位置；d.設計29個Va特異性上遊引物及Ca下遊引物；e.PCR擴增29個Va亞家族TCR重排時產生的V-N-JC區；f.Ca-Fam標記PCR產物，基因掃描分析T細胞亞家族的表達和克隆性；g.將呈單克隆或寡克隆掃描圖的亞家族PCR產物進行切膠純化序列分析。所述的瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列在製備瀰漫性大B細胞淋巴瘤特異性分子靶向過繼性免疫藥物中的應用。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果(1)本發明製備得到了一種獨特的DLBL抗原的相關TCRVa23基因序列，該序列可以作為一種新的抗原識別TCR基因(主要變化區在於CDR3序列)補充人類基因庫資料。(2)該TCR基因可用於研究DLBL的特異性免疫診斷和治療。上述瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRV(x23亞家族的基因序列後，一方面可用於進一步檢測病人體內所存在的TCRVa23亞家族T細胞的情況，以評價其細胞免疫功能狀態，另一方面是應用在製備瀰漫性大B細胞淋巴瘤分子耙向過繼性免疫細胞治療研究方面。前者的檢測所採用技術與上述檢測TCR基因的技術相同，通過不同時間點的分析，可以了解病人所存在的TCRVa23亞家族T細胞的情況，用於了解病人的免疫狀態。後者主要通過轉基因技術將DLBL相關抗原特異的TCR基因修飾自體或異基因正常T細胞，這些經過修飾的細胞就可提供對抗確定的腫瘤特異性抗原的T細胞反應性，從而具備了發揮相應特異性識別殺傷DLBL細胞的細胞毒活性，可以製備特異性抗DLBL細胞的CTL產品。國外有相關的動物實驗研究提示這類技術有可能發揮特異性的免疫治療效果。本發明所提供的TCR基因的應用最終目的是通過對DLBL患者進行特異性免疫治療，從而提高療效，清除微小殘留病變，減少疾病治療後復發提高長期生存率，改善病人的生存質量等，是具有很大的市場推廣應用價值和和較大的社會經濟效益。圖1為DLBL相關抗原特異TCRVa23亞家族的基因掃描圖。其中，A為TCRVa23亞家族單克隆圖；B為TCRVa23亞家族雙克隆圖；C為TCRVa23亞家族多克隆圖；D為TCRVa23亞家族寡克隆圖。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述,但本發明的實施方式不限於此。實施例(一)抗原特異性TCR基因序列的分析分析TCRVa基因譜的CDR3的長度和鹼基序列的方法是利用RT-PCR—基因掃描方法分析TCRVa29個亞家族的CDR3長度。首先收集DLBL患者外周血，Ficoll分層法分離外周血單個核細胞，留取l"(f個PBMCs(外周血單個核細胞)提取RNA，RT-PCR合成cDNA。同時，在NCBI的基因庫中査找出TCRa鏈的基因序列，並標出各亞家族的V區及C區在基因組中的位置。根據Va29個亞家族基因的cDNA設計相應的29個Va特異性上遊引物，並在Ca區設一Ca下遊引物，禾U用PCR技術擴增患者29個Va亞家族TCR重排時產生的V-N-JC區。如圖1所示，螢光素Fam標記各亞家族PCR產物的Ca區，基因掃描分析T細胞各亞家族的表達，根據不同位置，高度和形態的峰，表示產物的大小、量和均一性，從而確定T細胞克隆性(一般情況下，正常轉錄的每個Va亞家族包含810個峰，即810個不同克隆的T細胞；主峰的出現表明相同大小cDNA的過度擴增，單峰表明產物中DNA片斷大小相同，均存在寡克隆或單克隆T細胞群，三者分別提示產物來自多克隆、寡克隆和單克隆的T細胞)。基因掃描結果發現患者的Va23亞家族T細胞呈明顯單克隆；將Va23亞家族的PCR產物切膠純化，序列分析發現了Va23亞家族TCR的基因序列及其CDR3區(V-N-J區)，即為與淋巴瘤相關抗原特異性結合的部位。瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBL)相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列的具體製備方法1、分離外周血單個核細胞(1)取淋巴細胞分離液(Ficoll，密度1.077)4mL加入離心管內，將稀釋後的抗凝外周血標本混懸液平鋪於分離液之上，以水平離心機，2000rpm，離心15分鐘。(2)吸取中間單個核細胞層轉移至另一離心管內，再加入5mL1640液，輕輕吹打，以1500rpm，離心洗滌10分鐘，棄上清，加入1640液至2mL，混勻後計數，並用同樣的方法洗滌兩次，按2xl0VmL調整細胞濃度備用。2、RNA提取(TRIzol試劑盒方法提取法)(1)將已加入TRIzol試劑一2(TC凍存的細胞取出，置冰上解凍，混勻後加入0.21111氯仿，充分混勻，4°C，14000rpm離心30分鐘。(2)吸取上層液至另一離心管，加入0.5mL異丙醇並混勻，室溫靜置IO分鐘後4'C，14000rpm離心30分鐘。(3)去上清，並用lmL75^乙醇(一20'C)洗兩次(28。C，14000rpm)，每次混勻30秒後，離心10分鐘。(4)去上清，再離心23分鐘，去除剩餘的乙醇，置於超淨臺上自然乾燥11.5小時。加入超淨水(20^5(HiL)溶解。(5)於紫外線分光光度儀中檢測樣品的純度和含量，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性和質量。(6)RNA保存RNA樣品加入其0.1倍容積的3mol/LNaAC(醋酸鈉)和2倍容積的乙醇後，保存於一8(TC備用。3、cDNA合成(1)應用六聚體隨機引物和反轉錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。l嗎RNA加入16.5^iL預先配製的混合液其中包括7joLH20、2jjL10xPCR-Buffer、2pL0.l腿ol/LDTT、5^L2.5腿ol/LdNTP和0.5jxLRand.Hexmer。(2)於73°C3分鐘後，置於冰中30秒。低溫高速離心30秒置於冰中23分鐘。(3)加入0.6pLRnasin(33U/|jL)和0.5Superscript(200U/jjL)後，低溫高速離心30秒。(4)室溫靜置10分鐘；42°C，40分鐘以上；83'C，5分鐘，一20'C保存4、cDNA合成質量檢測將所有樣本的cDNA經PCR檢測p2M基因(引物序列見表l)而確定其合成質量。總反應體系20joL，其中上下遊引物0.5nmol/L，dNTP0.1mmol/L，Taq聚合酶l.OU，MgCL21.5mmol/L，10xPCR緩衝液2^iL，cDNA產物lpL和犯20，同時設置陽性和陰性對照。在德國BiometraPCR擴增儀中進行PCR反應。反應條件94°C1分鐘(首次3分鐘)，58'C1分鐘，72'C1分鐘(末次6分鐘)，共35個循環，最後保存於4'C中。取8^iLPCR產物以1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠進行電泳，卩2M陽性者可進一步研究，陰性者視為無cDNA合成，棄去不用。5、PCR擴增TCRVa29個亞家族以29個TCRVa亞家族基因設計相應的特異性上遊引物，並在Cct區設計一個下遊引物(引物序列見表1)。PCR按常規方法進行。總反應體系20^iL,其中含任一Va引物(24個Vp亞家族之一)和Ca引物0.5，ol/L，餘同上。反應條件94°C、1分鐘(首次3分鐘)，60°C、1分鐘和72°C、1分鐘(末次6分鐘)，共進行40個循環，最後PCR產物保存於4"C中。取8^iLPCR產物電泳分析結果。6、T細胞克隆性分析(1)標記PCR產物IO^iL的反應體系含2.5|oL未標記的PCR產物、0.15nmol/LCa-fam引物、1.5mmol/LMgCl2，O.lmmol/LdNTP，0.75UTaq聚合酶，lnL10xPCR緩衝液和dH20。PCR共進行35循環，每一循環包括94°C、1分鐘(首次3分鐘)，66°C、1分鐘和72'C、l分鐘(末次6分鐘)，最後PCR產物保存於4-C中。(2)基因掃描樣品配製螢光素標記的PCR產物(2nL)加入高質量的去離子甲醯胺(Hi-DiFormamide)與Genescan-500LIZ分子量標準品按20:1(體積比)比例配好的10nL混合液中。(3)基因掃描(按操作指南進行)1)按操作指南準備好儀器並更換水和緩衝液。2)灌膠灌膠前2小時從4'C冰箱取出POP-4(PerformanceOptimizedPolymer-4)膠回溫12小時，把膠液抽進貯膠5mL針筒中(抽取的mL數約為0.5+0.07x做樣次數)，倒置排出針筒內氣泡，裝緊針筒。3)上樣將備好的樣品於94。C變性4分鐘，然後立即放置冰上冷卻2分鐘。變性後的樣品加入96孔板，直接裝載到3100遺傳分析儀進行電泳。4)運行自動進樣器會自動把樣品板移到要分析的4個樣品的位置，電泳過程中CCD檢測器把螢光信號轉換為電信號並把它傳送給安裝了3100數據採集軟體的計算機工作站。5)數據處理數據處理完成後就存貯在計算機的資料庫裡並以電泳信號圖的形式顯示出來。電泳信號圖的X軸表示時間，Y軸表示相對螢光強度，每個圖中同時畫出幾種用於標記DNA片斷的螢光素信號，電泳信號圖中的每個峰代表一個DNA片斷。完成處理的數據被自動地從資料庫中提取並進行分析。6)結果分析打開GeneMapperSoftwareTMv3.5，將保存於計算機硬碟資料庫中的原始數據加進分析軟體，分析產物的長度和螢光素強度。7、核苷酸序列分析(1)E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PCR產物O切膠將PCR產物全部加入l2。/。的瓊脂糖凝膠的加樣孔，當電泳至足以分離目的DNA時，於紫外燈下用乾淨的手術刀切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，切下的凝膠塊置於1.5mL離心管中。2)按E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒說明進行pcr產物的純化，先加入500mLBindingBuffer,5565'C孵育至凝膠塊完全溶解；凝膠溶解液加入HiBindDNAspin-column中高速離心去廢液後，再依次加入300pLBindingBuffer、700mLSPWBuffer洗膜；高速離心甩幹spin-column的濾膜後，加入30DNAElutionBuffer(加於濾膜上)，室溫靜置5min,高速離心1min後可得純化的PCR產物。3)取3ml純化後的PCR產物進行P/。瓊脂糖凝膠電泳，觀察純化效果；剩餘的PCR純化產物真空冷凍乾燥濃縮約20min至10pL左右。(2)BigDye標記用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingkit標記純化後的PCR產物，反應體系為BigDyeTerminator1^L、相應單向引物(2拜ol/L)1.6^L、純化後PCR產物2.4nL，反應條件96'C1min，(96'C10sec、50'C5sec、60°C4min)25個循環。(3)測序將標記好BigDye的5體系的測序產物補水至20pL，轉入1.5ml的離心管，再依次加入23MNaAc(pH5.2)、2^iL125mMEDTA-Na2、50(jL95%乙醇，旋渦振蕩後室溫下避光放置15min;5415型高速臺式離心機2800g離心20min，沿離心沉澱物的對側小心吸取上清並棄去，加入250nL70。/。冰凍乙醇，2800g離心5min，棄上清；將管蓋打開置於加熱板上，9495°C1min使其乾燥。加入10pL高質量的去離子甲醯胺，反覆吹打混勻，轉入0.2mL的PCR管內，在PCR儀上95'C變性4min，然後迅速置冰中冷卻至少4min後，裝載到3100DNA序列分析儀上進行毛細管電泳。_表lRT-PCR實驗所涉及的引物序列_tableseeoriginaldocumentpage10Va55，CGGCCACCCTGACCTGCAACTATA3'Va65，TCCGCCAACCTTGTCATCTCCGCT3'Va75，GCAACATGCTGGCGGAGCACCCAC3'Va85，CATTCGTTCAAATGTGGGCAAAAG3'Va95，CCAGTACTCCAGACAACGCCTGCA3'ValOCACTGCG^CCCAGCCTGGTGATAC3'Vall5，CGCTGCTCATCCTCCAGGTGCGGG3'Val25，TCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCA3'Val35,-TTCATCAAAACCCTTGGGGACAGC-3'Val45，-CCCAGCAGGCAGATGATTCTCGTT-3'Val55，-TTGCAGACACCGAGACTGGGGACT-3'Val65，-TCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTC-3'Val75，-TGGGAAAGGCCGTGCATTATTGAT-3'Val85，-CAGCACCAATTTCACCTGCAGCTT-3'Val95，-ACACTGGCTGCAACAGCATCCAGG-3'Va205，-TCCCTGTTTATCCCTGCCGACAGA-3'Va215，-AGCAAAATTCACCATCCCTGAGCG-3'Va225,-CCTGAAAGCCACGAAGGCTGATGA-3'Va235，-TGCCTCGCTGGATAAATCATCAGG-3'Va245，-CTGGATGCAGACACAAAGCAGAGC-3'Va255，-TGGCTACGGTACAAGCCGGACCCT-3Va265，-AGCGCAGCCATGCAGGCATGTACC-3'Va275，-AAGCCCGTCTCAGCACCCTCCACA-3'Va285，-TGGTTGTGCACGAGCGAGACACTG-3，Va295，-GAAGGGTGGAGAACAGATGCGTCG-3'Cal5，-GTTGCTCCAGGCCGCGGCACTGTT-3'Ca-Fam5，隱Fam-ATACACATCAGAATCCTTACTTTG-3'|32-M5'5,-TACACTGAATTCACCCCCAC卩2-M3'5，-CATCCAATCCAAATGCGGCA(二)抗原特異TCR基因轉導技術1、重組質粒TCRVa23(VR)-pIRES的構建'(1)目的基因的擴增根據DLBL相關TCRVa23亞家族基因序列(包括完整的CDR3區)設計引物，擴增病人樣本中的TCRVa23基因序列的上遊引物上帶有XhoI酶切位點、下遊引物上帶有EcoRl酶切位點(與真核表達載體pIRES中的插入位點A的酶切位點相對應)。按BDAdvantage2PCR試劑盒說明書進行PCR反應PCR總反應體系50pL，其中含10XBDAdvantage2PCRBuffer、上下遊引物各0.5jimol/L、dNTPMix0.2mmol/L、50XBDAdvantage2PolymeraseMix、超純水和1nLcDNA模板，同時設置陽性和陰性對照。反應條件94。C1min(首次為3min)、60°C1min、72。C2min(末次為7min)，共35個循環。擴增產物用1%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。(2)重組質粒的構建A、E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化目的基因TCRVa23的PCR產物(同第一部分，步驟7);B、將真核表達載體pIRES與純化後的TCRVa23PCR產物分別用XhoI酶切，體系為①TCRV23PCR產物28pL、Tangobuffer8^L、XhoI內切酶1nL、超純水3nL;②pIRES載體4pL、Tangobuffer8piL、XhoI內切酶lpL、超純水27pL;混勻後置於37'C水浴3h;C、純化XhoI酶切後的pIRES載體和TCRVa23PCR產物；D、將已純化好的XhoI酶切後的pIRES載體和TCRVa23PCR產物分別再用EcoRI酶切，體系為①TCRVa23PCR產物(XhoI)28pL、Tangobuffer8^L、EcoRI內切酶lnL、超純水3②pIRES載體(XhoI)28pL、TangoTMbuffer8^iL、EcoRI內切酶lpL、超純水3^L;混勻後置於37'C水浴3h;E、雙酶切後的pIRES載體和TCRVa23PCR產物進行連接反應體系為10XT4bufferlpL、T4DNA酶lpL、雙酶切後的pIRES載體2^L、雙酶切後的TCRVa23PCR產物6pL，混勻後置於16。C過夜；F、轉化①將連接產物(10pL)加入感受態大腸桿菌DH5a(1.5mL離心管，100pL菌液，一70。C保存，北京Tiangen公司)中，輕輕混勻，置冰中30min;②42。C熱休克90s，迅速置冰中3min;③加入SOC培養基800jiL,置乾燥恆溫振蕩箱中37'C180200rpm振搖60min;菌液用玻璃推鋪於1.5%LB固體培養基(含氨苄青黴素100pg/mL)上，置37。C孵箱過夜培養；G、隨機挑選10個菌落，分別接種於5mL含氨苄青黴素的LB培養液中，37°C180rpm振搖培養過夜，PureLink;TM超純質粒提取試劑盒抽提質粒(5415型臺式高速離心機)①3000rpm室溫下離心菌液15min，去上清；②加入250HL含RNaseA的ResuspensionBuffer,重懸細菌；③加入250pLLysisBuffer,輕輕混勻，室溫下放置5min;④加入350nLPrecipitationBuffer,立即振蕩混勻；⑤以11400rpm離心10min後，將上清液轉移至Minicolumn中，11400rpm離心lmin，去廢液；⑥加入700pLWashBuffer,11400rpm離心lmin，去廢液；⑦再以11400rpm離心lmin後，將Minicolumn放入一新的1.5mL離心管中，加入75pL預熱65'C的TEBuffer,室溫下放置3min，11400rpm離心2min，所收集的溶液即為富含質粒溶液；H、提取質粒DNA後用XhoI和EcoRl雙酶切鑑定，同時在pIRES載體的IRES區設計一下遊引物IRES-R(5'-TATAGACAAACGCACACCGG-3，)，結合pIRES載體上遊的T7公共引物(5'-TACGACTCACTATAGGCTAG-3')進行PCR鑑定，PCR反應體積為25nL，包括0.1mmol/LdNTP、1.5UTaq聚合酶、10XPCR緩衝液、1.5mmol/LMgCl2和超純水，引物濃度均為0.4nmol/L，以l:-500稀釋的質粒DNA1iiL作為模板。PCR擴增條件為94'C3min，(94'C30s，60°Clmin，72。C2min，35個循環)，72°C5min;酶切產物及PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。篩選出陽性克隆，再對其進行雙向測序鑑定，證實為本發明特異基因序列後擴增陽性克隆並提取質粒，從而獲得特異性CTL相關的TCRVa23-pIRES質粒。用紫外分光光度計測定重組質粒的濃度。2、脂質體介導的重組質粒TCRVa23-pIRES轉染(1)脂質體Lipofectamine"^2000轉染A549細胞株、Molt4細胞株轉染A549細胞株①將處於對數生長期的A549細胞株以4X1S個細胞/孔的密度，加入2mL無血清無抗生素的IMDM培養基，接種6孔培養板；②取TCRVa23-pIRES重組質粒(4pg)置於1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養基至250pL，輕輕混勻；③取15nL脂質體LipofectamineTM2000置於1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養基至250pL，輕輕混勻後室溫下孵育5min;將②和③混勻後，室溫下孵育20min;⑤將④加入①的A549細胞培養基中(轉染平行2孔)，另設1孔轉染pIRES空載體作為陰性對照，具體操作方法同轉染重組質粒；置於37t:、5n/。C02培養箱中培養24h後全量換液為完全培養基，培養72h後加G418進行篩選(終濃度600pg/mL)，每4天換一次培養基，同時加入相同濃度的G418，在此篩選條件下培養20d可得到穩定表達細胞系。轉染Molt4細胞株將處於對數生長期的Molt4細胞株以2X106個細鵬孔的密度接種6孔板，取4ngTCRVa23-pIRES重組質粒和脂質體LipofectamineTM2000混合後轉染Molt4細胞株，方法同轉染A549細胞株。3、重組質粒轉染後TCRVa23基因表達的鑑定(1)RT-PCR和實時定量PCR檢領!lTCRVa23mRNA的表達轉染7天後，各孔收集3乂106細胞(A549細胞株需胰酶消化)，用TRIZol試劑盒和SurperScriptII逆轉錄試劑盒分別提取總RNA、合成cDNA，經PCR擴增管家基因P2M檢測cDNA的合成質量(同第一部分，步驟7);用相應的TCRVa23引物以及相應的Ca引物進行PCR擴增，轉染空載體組作為陰性對照，PCR擴增體系和擴增條件同前所述。(2)間接免疫螢光法和流式細胞儀檢測重組質粒的表達轉染10天後，收集1X10,胞(A549細胞株需胰酶消化)，用0.1mol/L的PBS洗滌細胞兩次後，標記大鼠抗人TCRVa單抗(一抗，1:100稀釋)，37。C孵育lh;PBS洗滌細胞三次後，標記FITC-兔抗大鼠IgG抗體(二抗，1:50稀釋)，37。C孵育lh;PBS洗滌細胞三次後，在螢光顯微鏡下觀察重組質粒在轉染後細胞株中的表達情況；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVa23單抗標記，37'C孵育30min，PBS洗滌細胞一次後用流式細胞儀進行流式檢測重組質粒的表達。(3)點印記雜交和WesternBlot檢測TCRVa23蛋白的表達轉染20天後，收集2乂106穩定表達重組質粒的細胞，用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，真空冷凍乾燥濃縮後考馬斯亮蘭法定量；同樣提取臍血細胞(TCRVa23亞家族表達均陽性)的蛋白作為陽性對照，轉染空載體的細胞的蛋白為陰性對照。1)點印記雜交A、取NC膜2cmX4cm，劃分小格，用微量加樣槍分別點膜，重組質粒組、陽性對照組、陰性對照組的蛋白樣品分別點3次，每次l^L;進行2個平行反應；B、用blockingReagent封膜4h後用washbuffer洗滌2次，每次5min;C、加入l:500的大鼠抗人TCRVa23單抗(用blockingReagent稀釋)，4°C孵育過夜後用washbuffer洗滌2次，每次5min;D、加入l:500的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5min;E、將NC膜浸入DAB底物液(避光)顯色。2)WesternBlotA、SDS-PAGE電泳將轉染重組質粒組的濃縮蛋白樣品、陽性對照和陰性對照分別加樣於15。/。SDS-PAGE膠(每孔上樣約100嗎)，以PageRulerPrestainedProteinLadder為預染marker，進行3個平行反應；用恆壓60V電泳30min後，改恆壓100Vlh;B、分離其中1個平行反應的SDS-PAGE膠，用考馬斯亮蘭染色後，用冰乙酸甲醇洗脫液反覆漂洗直至有清晰條帶顯出；C、轉膜PVDF膜預先用甲醇浸泡lmin，再浸泡到轉膜液中備用；切好的濾紙和海綿也浸泡到轉膜液中IOmin;將切下的另2個平行反應的SDS-PAGE膠與相應的PVDF膜放入轉膜液中浸泡片刻；將海綿一濾紙一PVDF膜一SDS-PAGE膠一濾紙一海綿依次放到陽極板上，膠大小=膜>濾紙；用4'C預冷的轉膜液，恆壓40V，90min(溼轉);D、封膜用blockingReagent封膜4h後用washbuffer洗滌2次，每次5min;E、檢測人p-actin蛋白(內參照)的表達將其中1個平行反應的PVDF膜加入l:800的小鼠抗人(3-actin單抗(用blockingReagent稀釋)，4。C孵育過夜後用washbuffer洗滌2次，每次5min;加入l:1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5min;F、檢測目的蛋白TCRVa23的表達將另1個平行反應的PVDF膜加入1:800的大鼠抗人TCRVa23單抗(用blockingReagent稀釋)，4'C孵育過夜後用washbuffer洗滌2次，每次5min;加入l:1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用washbuffer洗滌3次，每次5min;G、化學發光法顯影在暗室中將PVDF膜轉入LumiGLOWorkingReagent中，室溫孵育3min;用鑷子將PVDF膜取出，瀝去多餘的試劑；將PVDF膜放入塑料薄膜中，要保證PVDF膜與塑料薄膜之間沒有氣泡；將含有PVDF膜的塑料薄膜放入X線曝光暗盒中，壓上X線膠片(曝光30s)，常規顯影、定影后得到顯影的X線膠片。4、重組質粒TCRVa23-pIRES轉染正常人T細胞，構建特異性CTL(1)重組質粒TCRVa23-pIRES轉染正常人T細胞將處於對數生長期的正常人T細胞以2X106個細胞/孔的密度接種6孔板，取4pgTCRVa23-pIRES重組質粒和脂質體LipofectamineTM2000混合後轉染正常人T細胞，操作方法同前所述，培養擴增後得到表達抗原特異性CTL相關TCRV(x23基因的T細胞，並檢測驗證重組質粒的表達(方法同前)。(2)細胞毒活性實驗以乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)檢測試劑盒分別在轉染後第1周、第3周進行細胞毒性試驗，操作按說明進行。分別以轉染重組質粒的正常T細胞、轉染空載體的正常T細胞為效應細胞，以DLBL細胞株、Raji細胞、Molt4細胞(陰性對照)為靶細胞，另設未轉染質粒的正常T細胞為空白組。效靶比為10:1，靶細胞濃度1Xl(^個細H/孔，每組3個復孔；置U型96孔培養板內，稍離心2500rpm30s，以促進效、靶細胞之間接觸，於37°C、5。/。C02飽和溼度培養箱中孵育4h;用1000rpm離心5min，吸取上清100HL加入平底酶標板中，加入100LDH底物反應液，室溫下避光作用30min，每孔加501mol/L鹽酸終止酶促反應；Elx-800酶標儀測定光密(opticaldensity,OD)值，測定波長490nm，參考波長670nm。CTL細胞毒活性計算公式CTL活性(％)二(實驗組OD值一效應細胞自然釋放組OD值一靶細胞自然釋放組OD值)/(最大釋放組OD值一靶細胞自然釋放組OD值)上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。SEQUENCELISTING廣州醫學院第一附屬醫院暨南大學瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVci23亞家族的VR基因序列及應用462Patentlnversion3.21345DNA<213〉Artificialsequence瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列1gcctcgctggataaatcatcaggacgtagtactttatacattgcagcttctcagcctggt60gactcagccacctacctctgtgctgtgagggttactggctctaggttgacctttggggaa120ggaacacagctcacagtgaatcctgatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctg180agagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaaca240aatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatg300aggtctatggacttcaagagcaacagtgccgcggcctggagcaac3452115PRTArtificialsequence瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVd23亞家族的VR基因序列翻譯的蛋白質2AlaSerLeuAspLysSerSerGlyArgSerThrLeuTyr[leAlaAla151015SerGinProGlyAspSerAlaThrTyrLeuCysAlaValArgValThr202530GlySerArgLeuThrPheGlyGluGlyThrGinLeuThrValAsnPro354045AsplieGinAsnProAspProAlaValTyrGinLeuArgAspSerLys505560SerSerAspLysSerValCysLeuPheThrAspPheAspSerGinThr65707580AsnValSerGinSerLysAspSerAspValTyrlieThrAspLysThr859095ValLeuAspMetArgSerMetAspPheLysSerAsnSerAlaValAlaH)O105110TipSerAsn11權利要求1、一種瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVα23亞家族的VR基因序列，其特徵在於所述VR基因序列如下GCCTCGCTGGATAAATCATCAGGACGTAGTACTTTATACATTGCAGCTTCTCAGCCTGGTGACTCAGCCACCTACCTCTGTGCTGTGAGGGTTACTGGCTCTAGGTTGACCTTTGGGGAAGGAACACAGCTCACAGTGAATCCTGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCCGCGGCCTGGAGCAAC。2、根據權利要求1所述的一種瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列，其特徵在於所述瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列翻譯的蛋白質如下DPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSN。3、權利要求1所述的瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原特異TCRVa23亞家族的VR基因序列在製備瀰漫性大B細胞淋巴瘤特異性分子靶向過繼性免疫藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一個針對瀰漫性大B細胞淋巴瘤相關抗原的特異性T細胞受體的核苷酸序列。通過RT-PCR基因掃描分析DLBL患者外周血中TCRVα23亞家族呈明顯單克隆，其PCR產物進行序列分析了特異性TCR序列的V-N-J區，即互補決定區3，是和抗原特異性識別結合的部位；表明該克隆性T細胞的TCR為DLBL相關抗原刺激所產生的特異性TCR。它是通過TCR轉基因技術進行DLBL分子靶向的過繼性免疫治療的基礎和關鍵。該特異性TCR的核苷酸序列為進一步開展針對淋巴瘤的特異性細胞免疫治療提供重要作用。文檔編號C12N15/12GK101225389SQ20081002643公開日2008年7月23日申請日期2008年2月22日優先權日2008年2月22日發明者葉靜梅,尹青松,李揚秋,楊力建,獲譚,陳少華申請人:廣州醫學院第一附屬醫院;暨南大學