一種能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束的製備方法及其應用的製作方法
2023-12-03 01:06:51 1
一種能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束的製備方法及其應用，有效解決製備能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束，並實現對癌症的綜合治療用藥問題，取15-20ml濃硝酸置於燒杯中，加入150-200mg透明質酸，控制溫度0℃，反應3-6h，再加入400-500ml冰水沉澱，抽濾，沉澱物用蒸餾水洗滌至pH為6.8-7.0，冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯，將10-15mg去氧膽酸鈉溶於5-7ml有機溶劑中，加入60-80mg1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和36-45mg羥基琥珀醯亞胺，室溫活化反應15min，將100-150mg透明質酸硝酸酯溶於20-25ml有機溶劑中，將其加入去氧膽酸鈉溶液中，室溫攪拌反應24-48h，透析48h，冷凍乾燥，即得，本發明有效克服難溶性藥物的吸收問題，靶向性強，實現對癌症的綜合治療。
【專利說明】一種能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠 束的製備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥，特別是一種能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物 膠束的製備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 到目前為止，腫瘤的治療主要依靠化學藥物治療、外科手術、放射治療、免疫治療 及綜合治療，臨床上常用的抗腫瘤藥物大多是以傳統的核酸及蛋白質為靶點的細胞毒性藥 物，其缺點是選擇性差、毒副作用強，作用機制單一，易產生耐藥性。一氧化氮（NO)是體內 重要的信使物質和效應分子，參與了多種生理和病理反應，具有廣泛的生理功能。NO可以增 強巨噬細胞對於腫瘤細胞的毒性，抑制腫瘤細胞的增殖，抑制血管生成和轉移並加速腫瘤 細胞的凋亡。一方面，NO能夠抑制線粒體呼吸作用，改變鐵的代謝和與一些酶的相互作用來 破壞腫瘤細胞生長，從而發揮直接的抗腫瘤作用。另一方面，NO與氧自由基結合，生成一系 列活性氮，如N 2O3, NO2和0N00-，破壞腫瘤細胞內的蛋白質、核酸等組分從而發揮間接作用。
[0003] 由於NO是氣體物質，在體內半衰期比較短，在水溶液中不穩定，不方便利用等特 點，越來越多的研究集中於NO供體。其中靶向抗腫瘤NO供體藥物由於對靶組織特異性的 藥物傳遞而逐漸成為研究熱點。透明質酸（HA)作為一種天然的高分子酸性黏多糖，廣泛分 布於人體的各部位，具有良好的生物相容性和生物可降解性；此外，透明質酸與腫瘤細胞表 面過度表達的特異性標誌物，如CD44具有較高的親合力，可潛在的增強由受體介導的細胞 內吞作用，從而將藥物主動靶向於病灶部位，可避免對正常細胞的毒性，提高藥物的治療指 數。近年來，以透明質酸作為靴向載體用於傳遞抗腫瘤藥物的研究受到廣泛關注。因此，若 將透明質酸衍生化形成有機硝酸酯類NO供體，一方面可以在細胞內穀胱甘肽酶、細胞色素 P450酶等催化或非酶促作用下釋放出NO發揮作用，另一方面還可以實現腫瘤的主動靶向 目的。
[0004] 但是，透明質酸具有很高的親水性，單純的HA聚合物不適用於脂溶性抗腫瘤藥物 的包封及選擇性轉運，由於HA具有可用於化學修飾的多種官能團，可與疏水性分子共價形 成兩親性的嵌段聚合物，在水中自組裝形成膠束，實現難溶性藥物的靶向轉運而引起了廣 泛的關注。嵌段共聚物膠束作為抗腫瘤藥的載體，可以通過增強難溶性藥物在水中的溶解 性、延長藥物血液循環時間、通過EPR效應提高藥物在腫瘤部位的選擇性蓄積、降低網狀內 皮系統對抗腫瘤藥物的識別和攝取來極大的改善抗癌藥物的抗腫瘤效果，是一種長效、高 效、安全的抗腫瘤藥物載體。
[0005] 選擇具有良好生物相容性、腫瘤細胞靶向性的天然多糖--透明質酸，通過濃硝 酸硝化法向HA分子中引入硝基，形成透明質酸硝酸酯，之後通過醯胺反應將硝酸酯化的HA 與脫氧膽酸共價相連形成兩親性的二嵌段共聚物，該共聚物在水中可以自組裝形成納米級 膠束，從而構建了一種新型的兼具NO供體與腫瘤細胞主動靶向性的透明質酸硝酸酯-去氧 膽酸聚合物膠束，並將一種有效的NO供體、強大的膠束負載藥物特性、透明質酸獨特的腫 瘤細胞靶向性、輔助的抗腫瘤活性、良好的生物相容性有機的整合於一體，既可克服難溶性 藥物的吸收問題，傳統化療技術的非靶向性難題，NO體內半衰期短的問題，又可以實現NO 與化療藥協同治療腫瘤的目的，實現對癌症的綜合治療，但至今未見有能提供一氧化氮的 透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的製備方法及其應用的公開報導
【發明內容】
[0006] 針對上述情況，為克服現有技術之缺陷，本發明之目的就是提供一種能提供一氧 化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束的製備方法及其應用，可有效解決製備能提供 一氧化氮的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束，並實現對癌症的綜合治療用藥問題。
[0007] 本發明解決的技術方案是，將透明質酸分子結構中的羥基通過濃硝酸硝化法化學 修飾為透明質酸硝酸酯，然後將透明質酸分子中的氨基與去氧膽酸分子中的羧基進行醯胺 化反應共價連接，形成二嵌段共聚物，在水介質中形成膠束，所述透明質酸為分子量等於或 低於400kd，並等於或高於600道爾頓的低分子量透明質酸，具體由以下步驟實現：
[0008] (1)、透明質酸硝酸酯的合成：取15_20ml的質量含量3 96%的濃硝酸置於燒杯 中，緩慢加入150_200mg的透明質酸，控制溫度為(TC，反應3-6h，再加入400-500ml冰水進 行沉澱，抽濾得沉澱物，沉澱物用蒸餾水洗滌至PH為6. 8-7. 0,冷凍乾燥，得透明質酸硝酸 酯（NO2-HA);
[0009] (2)、透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的製備：將10_15mg的去氧膽酸鈉， 溶於5-7ml有機溶劑中，加入60-80mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC)和 36-45mg羥基琥珀醯亞胺（NHS)，室溫活化反應15min，成去氧膽酸鈉溶液；將步驟（1)製備 的100-150mg透明質酸硝酸酯，溶於20-25ml有機溶劑中，攪拌下將其緩慢加入去氧膽酸鈉 溶液中，再繼續室溫攪拌反應24-48h，透析48h，冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚 合物膠束；
[0010] 所述的有機溶劑為甲醯胺、或N，N-二甲基甲醯胺、或N，N-二甲基甲醯胺與甲醯胺 的混合溶劑。
[0011] 上述方法製備的能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束可有 效用於製備抗腫瘤藥物組合物，該抗腫瘤藥物組合物是由透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合 物膠束和藥學活性或藥理活性分子製成載藥納米膠束，所述的藥學活性或藥理活性分子 為脂溶性的藥物分子，或青蒿素及其衍生物、紫杉醇、多西紫杉醇、羥基喜樹鹼；所述抗腫瘤 藥物組合物可以用於注射、口服或植入給藥。
[0012] 本發明選擇具有良好生物相容性、腫瘤細胞靶向性的天然多糖一透明質酸，通 過濃硝酸硝化法向HA分子中引入硝基，形成透明質酸硝酸酯，之後通過醯胺反應將硝酸酯 化的HA與脫氧膽酸共價相連形成兩親性的二嵌段共聚物，該共聚物在水中可以自組裝形 成納米級膠束，從而構建了一種新型的兼具NO供體與腫瘤細胞主動靶向性的透明質酸硝 酸酯-去氧膽酸聚合物膠束，並將一種有效的NO供體、強大的膠束負載藥物特性、透明質酸 獨特的腫瘤細胞靶向性、輔助的抗腫瘤活性、良好的生物相容性有機的整合於一體，既可克 服難溶性藥物的吸收問題，傳統化療技術的非靶向性難題，NO體內半衰期短的問題，又可以 實現NO與化療藥協同治療腫瘤的目的，實現對癌症的綜合治療，是治療癌症藥物上的一大 創新。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發明透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束紫外分光光譜圖。
[0014] 圖2為本發明透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束雷射粒度分析圖。
【具體實施方式】
[0015] 以下結合實施例對本發明的【具體實施方式】作詳細說明。
[0016] 本發明在具體實施中，可由以下實施例給出。
[0017] 實施例1
[0018] 本發明在具體實施中，可由以下方法給出：
[0019] (1)、透明質酸硝酸酯的合成：取17-18ml的質量含量3 96%的濃硝酸置於燒杯 中，緩慢加入170_180mg的透明質酸，控制溫度為(TC，反應3-6h，再加入430-470ml冰水進 行沉澱，抽濾得沉澱物，沉澱物用蒸餾水洗滌至PH為6. 8-7. 0,冷凍乾燥，得透明質酸硝酸 酯（NO2-HA);
[0020] (2)、透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的製備：將12-13mg的去氧膽酸鈉，溶 於5.5-6. 5ml有機溶劑中，加入65-75mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC)和 39-42mg羥基琥珀醯亞胺（NHS)，室溫活化反應15min，成去氧膽酸鈉溶液；將步驟（1)製備 的120-130mg透明質酸硝酸酯，溶於22-23ml有機溶劑中，攪拌下將其緩慢加入去氧膽酸鈉 溶液中，再繼續室溫攪拌反應24-48h，得到的反應液置於透析袋中，在蒸餾水中透析48h， 冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束。
[0021] 實施例2
[0022] 本發明在實施中，也可由以下方法步驟給出：
[0023] (1)、透明質酸硝酸酯的合成：取17. 5ml的質量含量蘭96%的濃硝酸置於燒杯中， 緩慢加入175mg的透明質酸，控制溫度為0°C，反應3-6h，再加入450ml冰水進行沉澱，抽濾 得沉澱物，沉澱物用蒸餾水洗滌至PH為6. 9,冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯（NO2-HA);
[0024] (2)、透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的製備：將12. 5mg的去氧膽酸鈉，溶 於6ml有機溶劑中，加入70mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC)和40. 5mg 羥基琥珀醯亞胺（NHS)，室溫活化反應15min，成去氧膽酸鈉溶液；將步驟（1)製備的125mg 透明質酸硝酸酯，溶於22. 5ml有機溶劑中，攪拌下將其緩慢加入去氧膽酸鈉溶液中，再繼 續室溫攪拌反應24-48h，得到的反應液置於透析袋中，在蒸餾水中透析48h，冷凍乾燥，得 透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束。
[0025] 上述方法製備的能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束可有 效用於製備抗腫瘤藥物組合物，該抗腫瘤藥物組合物是由透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合 物膠束和藥學活性或藥理活性分子製成載藥納米膠束，所述的藥學活性或藥理活性分子為 脂溶性的藥物分子，或青蒿素及其衍生物、紫杉醇、多西紫杉醇、羥基喜樹鹼。
[0026] 所述的製成載藥納米膠束是，將透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束與水探頭 超聲溶解，與經有機溶劑溶解的抗腫瘤藥物混合，經超聲或高壓均質處理，室溫攪拌均勻， 用透析法或超濾法或柱分離法除去有機溶劑及游離藥物，凍幹成粒徑為10?IOOOnm的納 米膠束。
[0027] 所述的抗腫瘤藥物組合物有效用於製備一氧化氮聯合化療癌症藥物，實現對癌症 的綜合治療用藥問題。
[0028] 由上述可以看出，本發明是一種兼具NO供體、腫瘤細胞靶向性以及良好生物相容 性的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束。該聚合物膠束合成工藝和化學結構均簡單， 避免了為提高生物相容性、穩定性及靶向性而引入多種分子基團，並保留了透明質酸的腫 瘤靶向能力及透明質酸硝酸酯所具有的NO供體特性；此外，可物理負載難溶性抗腫瘤藥 物，共同達到治療癌症的效果。
[0029] 本發明的另一個目的是提供包含上述透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的 藥物組合物。
[0030] 本發明的另一個目的是提供上述透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束及包含 上述透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束藥物組合物的製備方法。
[0031] 本發明還有一個目的是提供上述透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束及其藥 物組合物在治療腫瘤藥物中的應用。
[0032] 本發明經測試和實驗，表明粒徑分布均勻，穩定性好，載藥效果好，具有靶向腫瘤 細胞的NO供體，用於治療腫瘤，實現對癌症的綜合治療，有關資料如下：
[0033] 1、對本發明製備的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束進行紫外分光光度法 掃譜分析（見圖1)、雷射粒度儀分析（見圖2)，表明透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束 成功製備，由圖譜和粒度分布可清楚的看出，粒徑分布均一，膠束在水溶液中的穩定性好。
[0034] 2、對透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束在腫瘤細胞中NO生成測定：
[0035] NO標準曲線的建立：用細胞培養液稀釋標準品NaNO2(IM),濃度依次為0、1、2、5、 10、20、40、60、1001^，在96孔板中每孔加入50111，然後按50111每孔，各孔中先後加入室溫 Griess Reagent I、II，避光反應10min，540nm處測定吸光度，根據吸光度值和濃度建立標 準曲線。
[0036] 腫瘤細胞內NO的檢測：將人肝癌SMMC-7721細胞以I X IO4/孔接種到96孔培養 板中，24h後按照高、中、低三個不同的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束濃度給予刺 激，並設置正常對照組。然後分別於加藥後1、2、4、6、8、10、1211，每孔取5〇111細胞培養液上 清加入96孔板中，室溫下先後加入Griess Reagent I、II，避光反應10min，540nm處測定 吸光度，將吸光度值代入標準曲線計算透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束在腫瘤細胞 內生成的NO的濃度。結果顯示腫瘤細胞在給予透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束刺 激後2-4h時產生NO最多，說明透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束可以作為一種新型 的靶向腫瘤細胞的NO供體用於腫瘤治療。
[0037] 3、負載藥學活性和藥理活性分子的透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束中藥 學活性和藥理活性分子含量的測定
[0038] 採用紫外分光光度法，將藥學活性和藥理活性分子用0. 2%氫氧化鈉於50土1°C 水浴中衍生30min後，於291nm波長處測定藥學活性和藥理活性分子的含量，以式（1)計算 載藥量，載藥量達到60%。
[0039]
【權利要求】
1. 一種能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束的製備方法，其特徵在 於，將透明質酸分子結構中的羥基通過濃硝酸硝化法化學修飾為透明質酸硝酸酯，然後將 透明質酸分子中的氨基與去氧膽酸分子中的羧基進行醯胺化反應共價連接，形成二嵌段共 聚物，在水介質中形成膠束，所述透明質酸為分子量等於或低於400 kd，並等於或高於600 道爾頓的低分子量透明質酸，具體由以下步驟實現： (1) 、透明質酸硝酸酯的合成：取15_20ml的質量含量3 96%的濃硝酸置於燒杯中，緩慢 加入150-200mg的透明質酸，控制溫度為0°C，反應3-6h，再加入400-500ml冰水進行沉澱， 抽濾得沉澱物，沉澱物用蒸餾水洗滌至pH為6. 8-7. 0,冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯； (2) 、透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的製備：將10-15mg的去氧膽酸鈉，溶於 5_7ml有機溶劑中，加入60-80mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和36-45mg羥 基琥珀醯亞胺，室溫活化反應15min，成去氧膽酸鈉溶液；將步驟（1)製備的100-150mg透明 質酸硝酸酯，溶於20-25ml有機溶劑中，攪拌下將其緩慢加入去氧膽酸鈉溶液中，再繼續室 溫攪拌反應24-48h，透析48h，冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束； 所述的有機溶劑為甲醯胺、或N，N-二甲基甲醯胺、或N，N-二甲基甲醯胺與甲醯胺的混 合溶劑。
2. 根據權利要求1所述的能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束的 製備方法，其特徵在於，由以下步驟實現： (1) 、透明質酸硝酸酯的合成：取17_18ml的質量含量3 96%的濃硝酸置於燒杯中，緩慢 加入170-180mg的透明質酸，控制溫度為0°C，反應3-6h，再加入430-470ml冰水進行沉澱， 抽濾得沉澱物，沉澱物用蒸餾水洗滌至pH為6. 8-7. 0,冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯； (2) 、透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的製備：將12-13mg的去氧膽酸鈉，溶於 5. 5-6. 5ml有機溶劑中，加入65-75mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺和39-42mg 羥基琥珀醯亞胺，室溫活化反應15min，成去氧膽酸鈉溶液；將步驟（1)製備的120-130mg透 明質酸硝酸酯，溶於22-23ml有機溶劑中，攪拌下將其緩慢加入去氧膽酸鈉溶液中，再繼續 室溫攪拌反應24-48h，得到的反應液置於透析袋中，在蒸餾水中透析48h，冷凍乾燥，得透 明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束。
3. 根據權利要求1所述的能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束的 製備方法，其特徵在於，由以下步驟實現： (1) 、透明質酸硝酸酯的合成：取17. 5ml的質量含量3 96%的濃硝酸置於燒杯中，緩慢 加入175mg的透明質酸，控制溫度為0°C，反應3-6h，再加入450ml冰水進行沉澱，抽濾得沉 澱物，沉澱物用蒸餾水洗滌至pH為6. 9,冷凍乾燥，得透明質酸硝酸酯； (2) 、透明質酸硝酸酯-去氧膽酸聚合物膠束的製備：將12. 5mg的去氧膽酸鈉，溶於 6ml有機溶劑中，加入70mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺和40. 5mg羥基琥珀 醯亞胺，室溫活化反應15min，成去氧膽酸鈉溶液；將步驟（1)製備的125mg透明質酸硝酸 酯，溶於22. 5ml有機溶劑中，攪拌下將其緩慢加入去氧膽酸鈉溶液中，再繼續室溫攪拌反 應24-48h，得到的反應液置於透析袋中，在蒸餾水中透析48h，冷凍乾燥，得透明質酸硝酸 酯-去氧膽酸聚合物膠束。
4. 權利要求1或2-3任一項所述方法製備的能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽 酸聚合物膠束在製備抗腫瘤藥物組合物中的應用，該抗腫瘤藥物組合物是由透明質酸硝酸 酯-去氧膽酸聚合物膠束和藥學活性或藥理活性分子製成載藥納米膠束，所述的藥學活性 或藥理活性分子為脂溶性的藥物分子，或青蒿素及其衍生物、紫杉醇、多西紫杉醇、羥基喜 樹鹼。
5. 根據權利要求4所述的能提供一氧化氮的透明質酸硝酸酯去氧膽酸聚合物膠束在 製備抗腫瘤藥物組合物中的應用，其特徵在於，所述的製成載藥納米膠束是，將透明質酸硝 酸酯-去氧膽酸聚合物膠束與水探頭超聲溶解，與經有機溶劑溶解的抗腫瘤藥物混合，經 超聲或高壓均質處理，室溫攪拌均勻，用透析法或超濾法或柱分離法除去有機溶劑及游離 藥物，凍幹成粒徑為l(Tl〇〇〇 nm的納米膠束。
6. 根據權利要求4所述的抗腫瘤藥物組合物在製備一氧化氮聯合化療癌症藥物中的 應用。
【文檔編號】A61K33/00GK104367556SQ201410647093
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月14日 優先權日:2014年11月14日
【發明者】張慧娟, 焦曉靜, 陳倩倩, 冀嫣丹, 張振中, 張紅嶺, 侯琳 申請人:鄭州大學