一種適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子的分離克隆及核心區域的鑑定的製作方法

2023-12-02 18:21:41 2

專利名稱：一種適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子的分離克隆及核心區域的鑑定的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物基因工程技術領域，具體涉及一種適用於豬骨骼肌基因表達的啟 動子的分離克隆及核心區域的鑑定。
背景技術：
基因的表達(gene expression)是指從DNA到蛋白質的過程，而對這個過程的調 節稱為基因的表達調控。而基因的表達調控是一個多層次的複雜過程，受不同的調節因素 控制。它是通過多階段水平的調節來實現的，即轉錄前、轉錄、轉錄後、翻譯、翻譯後五個 水平的調控。高等生物的生長發育就是由不同基因在時間和空間上的有序表達和協同作 用實現的，而在此過程中基因表達的開啟、關閉、表達部位、表達量的高低等都將會受到各 階段水平的精細控制。基因表達在高等生物中雖然是一個多級調控系統，但轉錄作為基 因表達調控中的第一個具有高度選擇性的環節，是基因表達調控中最關鍵的環節，而啟動 子作為轉錄水平上的一個重要順式元件，是驅動基因的轉錄所必需的。因此，深入研究啟 動子的結構、功能、作用模式等對於回答分子生物學中的一些基本理論問題具有重大意義 (Hochheimer & Tjian，2003 ；Smale,2001 ；Wray et al.，2003)。啟動子(promoter)是指一段能使基因進行轉錄的DNA序列，在真核生物中，根據 啟動子所結合的RNA聚合酶不同可分為三種不同的啟動子，即rRNA基因啟動子(I型)、 mRNA基因啟動子(II型)和tRNA基因啟動子(III型)。而II型啟動子相對複雜，主要包 括TATA框或起始子(initiator)核心元件，核心元件能夠保證轉錄的精確起始，同時也可 影響轉錄的速率；以及CAAT框、GC框和等上遊調控元件，這些元件在結構上並不恆定，在位 置、序列、距離和方向都不完全相同，它們能夠與不同的轉錄因子結合，從而對基因的表達 起調控作用；有的還存在遠距離的調控元件，如增強子(enhancer)、減弱子(dehancer)等， 這些遠端調控元件對啟動子的轉錄活性起調節。另外，根據啟動子作用的方式及功能不同可以大致分為四類即組成型啟動子 (constitutive promoters)、誘導型啟動子(inducible promoters)、組織或發育階段特異 型啟動子(tissue-specific or developmental-stage-specific promoters)禾口合成性啟 動子(synthetic promoters) 0結構基因在組成型啟動子的調控下，其表達不具有時間、空 間與強度間的明顯差異；結構基因在誘導型啟動子的調控下，如果存在某些特定的物理或 化學信號的刺激下，其轉錄水平將會發生顯著的變化；如果結構基因在組織或發育階段特 異性啟動子的啟動子的調控下，基因往往只在某些特定的組織器官中表達，並表現出發育 調節的特性。隨著基因工程的飛速發展，如何使外源基因按照人們的意願正確、高效和穩定的 在生物體內表達成為研究的熱點。啟動子作為基因表達調控系統中轉錄調控水平上的一個 重要調控元件，它們是基因進行轉錄的必要元件。因此，發現一些重要的特異性的或特定條 件能誘導的啟動子，並利用它們構建一系列能夠高效表達外源基因的表達載體，同時結合轉基因技術將這些外源基因導入生物體內，培育出能夠完全按照人們的設計初衷來表達外 源基因的動植物新品種或新品系成為現代分子育種的最終落腳點。因此，鑑定大量的各具 特色的誘導型啟動子與組織或發育階段特異型啟動子在動植物的遺傳改良中具有十分重 要的意義。目前為止，在植物基因工程領域以及人類疾病的基因治療領域已鑑定了許多特異 性的啟動子，植物育種工作者將這些特異性的啟動子已逐漸應用到植物的遺傳改良中，並 MJ MlM (Buchner, Rochat, ffuilleme, & Boutin，2002 ；Rossak, Smith, & Kunst， 2001 ；Sandhu et al. , 2000 ；Vasconcelos et al. ,2003；Wu, Suzuki, Washida, & Takaiwa, 1998)；而在基因治療領域，科研工作都正在將一些組織特異性的啟動子應用到各種疾病的 ^ff ^ (Bauerschmitz et al. ,2008 ；Boulaire，Balani，& Wiing，2009 ；Dae et al. ,2009 ； Huang et al. , 2010 ；Tominaga et al. ；Tu, Liu, Huang, Mo, & Yang, 2009 ；Yao et al., 2009)。而特異性啟動子在動物基因工程領域中的鑑定與應用具有很大的局限性，一方面是 由於目前所鑑定的很有價值的靶基因少，另一方面就是可利用的誘導型啟動子與組織或發 育階段特異型啟動子甚少，所構建的表達外源基因的載體，利用轉基因技術導入動物體內 之後，外源基因很難按照人們的意願表達。與植物基因工程領域及人類疾病研究領域相比， 特異性啟動子在動物基因工程領域的應用相對滯後，但也取得了一定的進展(Costessi， Devescovi, Baralle, & Muro，2006 ；Coulon et al. ,2007 ；Heidt & Black，2005 ；Pacak, Sakai，Thattaliyath，Mah，& Byrne，2008 ;Park et al. ,2009) 隨著動物基因工程的蓬勃 發展，特異性啟動子在動物基因工程領域定會得到廣泛的應用。肉類是人類營養的主要來源，而豬肉在所有肉類消費中所佔的比例是最大的。隨 著社會的發展與人們生活水平的提高，人們對肉類的消費觀念已由原來的對量的追求向質 的追求轉變。過去的幾十年裡，傳統的育種方法在提高豬的生長速度，瘦肉率以及飼料轉化 率等方面發揮了積極重要的作用，並取得了顯著的成績，育種計劃相當成功。但同時隨著對 高生長率與高瘦肉率的強度選擇導致了豬肉品質的嚴重下降，特別是導致了肌肉脂肪的大 幅度下降，肌纖維增粗(快肌比例增加)，劣質豬肉的大量湧現。因此，對豬肌肉特異表達 啟動子的分離克隆及深入研究，不僅有助於闡明肌肉品質形成的分子機制，還可以指導轉 基因育種，將能促進肌內脂肪形成，促進慢型肌纖維形成的優良靶基因構建到含肌肉特異 表達啟動子的載體中，然後通過轉基因技術將目的基因導入豬體內，培育出高肌肉脂肪、高 品質肌纖維的優質轉基因新品種豬，從而可以大大改善豬肉品質，創造巨大的經濟效益和 社會效益，更好的為人類生產生活服務。應用基因工程技術來改良豬肉品質不失為一個科 學有效的方法。本發明就是利用相關的分子生物學技術，從梅山豬基因組中分離克隆了同 一個豬肌肉特異表達基因上遊不同長度的啟動子區域，將不同長度的啟動子構建到含Iuc+ 的pGL3-BasiC載體中，並將這些構建的缺失載體轉入三種真核細胞系，通過檢測不同長度 的啟動子片段所驅動的Iuc+報告基因的活性來確定控制表達模式的核心區域。

發明內容
本發明的目的在於克服豬基因工程研究中的肌肉組織特異表達啟動子數目不足 的問題，從中國地方豬種「梅山豬」基因組中分離克隆並鑑定出具一種適用於豬骨骼肌基因 表達的啟動子，有望將這些啟動子用於豬的基因工程改良中。在本發明中，申請人擴增了豬Sixl-180、Sixl-530、Sixl-844、Sixl-1143、Sixl-1335 和 Sixl-1494 共 6 個不同長度的啟 動子缺失片段。然後將這些啟動子缺失片段插入pGL3-BasiC載體中，對不同長度啟動子的 活性進行了鑑定，為日後該啟動子在豬育種的應用奠定了基礎。本發明是這樣實現的(技 術路線見圖1)在人與鼠上的研究表明，Sixl基因是一個與肌肉發育緊密相關的基因(Grifone et al. ,2004 ；Laclef et al. ,2003 ；Spitz et al.，1998)，申請人初步將豬 Sixl 基因作為 豬骨骼肌基因表達的啟動子的侯選基因，然後利用反轉錄PCR(以下簡稱RT-PCR)方法分 析了豬Sixl基因在不同組織中的表達情況，結果表明豬Sixl基因在骨骼肌中的表達量明 顯高於其它所檢測的組織。接下來，申請人利用美國國家生物技術信息中心NCBI(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/)的豬基因組序列信息獲得了該基因的啟動子序列，並設計特異擴 增引物分離克隆了豬Sixl基因的啟動子序列，將該啟動子序列命名為Sixl-P序列，其核 苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。然後以所獲的Sixl-P序列為模板設計了 6對擴增 不同長度的啟動子序列的缺失引物，將所擴增的不同長度的啟動子序列命名為PI、P2、P3、 P4、P5與P6，它們的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、 SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7所示，它們分別是由啟動子Sixl-P截短的核心 區180bp、530bp、844bp、1143bp、1335bp與1494bp的序列。然後，將所擴增的不同長度的啟 動子序列構建到與Iuc+融合的pGL3-BasiC啟動子載體轉染真核細胞，通過檢測不同長度 啟動子所驅動的Iuc+報告基因的活性來確定控制表達模式的核心區域。實驗結果表明，除 Pl外其它五個片段均具有獨立的啟動基因表達的功能。本發明的具體步驟是首先通過大量的查找文獻資料，根據以往文獻所報導的Sixl基因的生理生化功 能，初步將豬Sixl基因是一個影響豬肌肉生長發育的重要侯選基因。利用美國國家生物技 術信息中心(NCBI,National Center for Biotechnology Information,http://www. ncbi. nlm. nih. gov)網站 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具從豬的 EST 數據中 調取同源性序列，篩選與之同源性大於80%的豬EST，並進行EST序列拼接，所拼接的序列 即為豬的mRNA，然後以拼接的序列為模板設計引物進行PCR，分離克隆了豬Sixl基因的全 長mRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :8所示。以所獲得的豬Sixl基因的mRNA序列 為模板，設計了 1對檢測豬Sixl基因表達的定量引物，利用反轉錄PCR(以下簡稱RT-PCR) 方法分析了豬Sixl基因在不同組織中的表達情況，結果表明豬Sixl基因在骨骼肌中的表 達量明顯高於其它所檢測的組織。接下來，申請人同樣利用美國國家生物技術信息中心 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的豬基因組序列信息，以所獲得的豬的mRNA為信 息探針，通過同源序列比對，在豬的基因組數據中獲得了該基因的啟動子序列，並設計了 2 對特異性引物(其編號分別為SP5F，SP5R和SP3F和SP3R)擴增豬Sixl基因啟動子，在此 基礎之上，通過一個融合PCR技術將SP5F，SP5R和SP3F、SP3R所擴增的序列融合在一起， 獲得一條完整的啟動子序列，將其命名為Sixl-P序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 1所示，序列全長為1692bp，並將這條序列克隆到pMDIS-T載體上(附圖8所示)。與此同 時，申請人以所獲得的Sixl-P序列為模板設計了 6對擴增不同長度的啟動子序列的缺失引 物，以克隆到PMD18-T載體上的Sixl-P序列為模板，擴增不同長度的啟動子序列，並命名為 P1、P2、P3、P4、P5與P6，分別是序列表SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDN0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7所示的序列，它們分別是由啟動子Sixl-P截短的核心區 180bp、530bp、844bp、1143bp、1335bp、1494bp的序列。然後，將所擴增的不同長度的啟動子 序列構建到與Iuc+融合的pGL3-BasiC啟動子缺失載體轉染真核細胞，通過檢測不同長度 啟動子所驅動的Iuc+報告基因的活性來確定控制表達模式的核心區域。為了提高實驗的 可靠性，申請人同時利用了 2個物種的三種細胞進行實驗，實驗結果表明，除Pl外其它五個 片段在所用的三種細胞中均具有獨立的啟動基因表達的功能。本發明的優點在於(1)本發明首次分析了豬Sixl基因在不同組織的表達情況，鑑定了該基因適用於 豬骨骼肌基因表達的啟動子序列Sixl-P，以及控制基因表達量以及表達模式的核心啟動子 區。為豬基因工程和分子育種提供了新的特異表達的啟動子資源。(2)本發明同時利用多種真核生物的細胞系進行了驗證，提高了實驗的可靠性與 真實性，所鑑定的核心啟動子可直接應用到豬轉基因工程和分子育種。


序列表SEQ ID NO 1是本發明克隆的豬骨骼肌基因表達啟動子Sixl-P的核苷酸 序列，其長度為1692bp。序列表SEQ. ID. NO :2是從所述的SEQ ID NO 一個啟動子Pl應用的核苷酸序列，其長度為180bp。序列表SEQ ID NO :3是從所述的SEQ ID NO 個啟動子P2應用的核苷酸序列，其長度為530bp。序列表SEQ ID NO :4是從所述的SEQ ID NO 個啟動子P3應用的核苷酸序列，其長度為844bp。序列表SEQ ID NO :5是從所述的SEQ ID NO 個啟動子P4應用的核苷酸序列，長度為1143bp。序列表SEQ ID NO :6是從所述的SEQ ID NO 個啟動子P5應用的核苷酸序列，其長度為1335bp。序列表SEQ ID NO :7是從所述的SEQ ID NO 個啟動子P6應用的核苷酸序列，其長度為1494bp。序列表SEQ ID NO 8是本發明克隆的豬肌肉特異表達啟動子Sixl-P在基因組中 所驅動的基因(Genbank登錄號為GU225952)編碼的胺基酸序列，編碼284個胺基酸。圖1 是本發明的技術路線圖。圖2 利用RT-PCR的方法來分析啟動子Sixl-P在基因組中所驅動的基因 (Genbank登錄號為⑶225952)在不同組織中的表達模式。圖3 是本發明中利用SP3F、SP3R引物對所擴增的豬Sixl基因的部分啟動子序列 電泳檢測圖。圖中泳道M:DNA分子標準(DL2000 ladder)。圖4 是本發明中利用SP5F、SP5R引物對所擴增的豬Sixl基因的部分啟動子序列 電泳檢測圖。圖中泳道M:DNA分子標準(DL2000 ladder)。圖5 是本發明中利用SP5F，SP5R和SP3F、SP3R所擴增的序列融合在一起所獲得 一條完整的豬的啟動子序列電泳檢測圖。圖中泳道M:DNA分子標準(DL2000 ladder)。
:1核苷酸序列的克隆所得到的作為另 :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一 :1核苷酸序列的克隆得到的作為另一
圖6 是本發明中利用6對缺失引物從啟動子Sixl-P序列中所擴增的豬Sixl基 因的不同長度的啟動子序列電泳檢測圖。圖中1為Sixl-P序列；2，3，4，5，6，7分別為卩6、 P5、P4、P3、P2、Pl啟動子缺失片段；泳道M =DNA分子標準(DL2000 ladder)。圖7 是本發明中所構建的豬Sixl基因的6個不同長度的啟動子序列pGL3-BasiC 雙螢光素酶報告載體雙酶切電泳檢測圖。圖中1為雙螢光素酶報告載體pGL3-BasiC 空載體雙酶切圖；2，3，4，5，6，7分別為插入了 P6、P5、P4、P3、P2、Pl啟動子缺失片段的 pGL3-Basic雙螢光素酶報告載體雙酶切圖；泳道M:DNA分子標準(DL2000 ladder)。圖8 是本發明中用於克隆的T載體結構示意圖。圖9 是本發明中用於分析豬Sixl基因的不同長度的啟動子活性的pGL3-BasiC 雙螢光素酶報告載體結構示意圖。圖10 是本發明中所用的pGL3-Control陽性對照載體結構示意圖。圖11 是本發明中用於分析豬Sixl基因的不同長度的啟動子活性所用的pRL-TK 內參載體結構示意12 是本發明豬Sixl基因的6個不同長度的啟動子序列Pl，P2，P3，P4，P5， P6啟動子在小鼠成肌細胞與小鼠胚胎成纖維細胞兩種真核細胞中的活性分析比較。圖 中pGL3-Control為陽性對圖；pGL3-BasiC為陰性對。結果用最小二乘均值士標準差 (LSM 士 SD)表示。顯著水平用T檢驗方法時行檢測，圖中#表示P彡0.01 ；*表示05。圖13 是本發明豬Sixl基因的6個不同長度的啟動子序列Pl，P2，P3，P4，P5，P6 啟動子在小鼠成肌細胞與豬腎細胞兩種真核細胞中的活性分析比較。圖中pGL3-C0ntr0l 為陽性對圖；pGL3-BasiC為陰性對。結果用最小二乘均值士標準差(LSM士SD)表示。顯 著水平用T檢驗方法時行檢測，圖中#表示P < 0. 01 表示P < 0. 05。圖14 是本發明克隆的豬Sixl基因啟動子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID N0:1所示的序列，該片段大小為1692bp。圖中下劃線為正、反向引物。圖15 是本發明克隆的豬Sixl基因啟動子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO :2所示的序列，該片段大小為180bp，圖中下劃線為正、反向引物。圖16 是本發明克隆的豬Sixl基因啟動子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ IDNO :3所示的序列，該片段大小為530bp，圖中下劃線為正、反向引物。圖17 是本發明克隆的豬Sixl基因啟動子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO :4所示的序列，該片段大小為844bp，圖中下劃線為正、反向引物。圖18 是本發明克隆的豬Sixl基因啟動子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO :5所示的序列，該片段大小為1143bp，圖中下劃線為正、反向引物。圖19 是本發明克隆的豬Sixl基因啟動子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO :6所示的序列，該片段大小為1335bp，圖中下劃線為正、反向引物。圖20 是本發明克隆的豬Sixl基因啟動子的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO :7所示的序列，該片段大小為1494bp，圖中下劃線為正、反向引物。圖21 是本發明克隆的豬Sixl基因的核苷酸序列，也就是序列表中的SEQ ID NO 8所示的序列，該片段大小為2201bp，圖中下劃線為Sixl基因半定量正、反向引物。
具體實施例方式實施例1 豬肌肉特異表達候選基因(Genbank登錄號為⑶225952)在不同組織 中的表達譜驗證1.主要試劑Taq DNA聚合酶(Fermentas公司產品)、dNTP (Roche公司， 4738284001)、DL_2000 Marker (廣州東盛生物科技有限公司)、AC柱式快捷型瓊脂糖DNA回 收試劑盒(Bio Teke 公司產品，DP1701)；總 RNA 提取試劑為 Trizol Reagent (Invitrogen 公司產品，Cat no 15596-026) ；ReverTra Ace qPCR RT Kit (T0Y0B0公司產品，Code no FSQ-101)反轉錄試劑盒。2.組織樣品採集了 4月齡中國地方豬種「梅山豬」的心、肝、脾、肺、腎、胃、骨髓、 膀胱、子宮、卵巢、睪丸、附睪、背脂、腦、小腸、淋疤結、皮膚、背最長肌、腹脂、股二頭肌20個 組織樣，樣品採集後迅速置於液氮中，然後於-80°C保存，以備總RNA的提取。3.半定量引物設計首先以人的Sixl基因cDNA為信息探針，利用美國國家生物技術信息中心(NCBI， National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)網 站 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具從豬的 EST 數據與 HTGS 資料庫中調 取同源性序列，採用Primer 5. O軟體設計引物對擴增豬Sixl基因，其Genbank登錄號為 GU225952。然後以所獲得的豬Sixl基因的序列為模板，設計了 1對跨內含子的半定量引 物(Sixl-5F :CGTGTTGCGGGAGTGGTA, Sixl_5R :TGCTTGTTGGAGGAGGAGTT，擴增的片段大小為 189bp)。與此同時，申請人還設計了 1對跨內含子的內參基因β-actin引物(β-actin-F: CCAGGTCATCACCATCGG, β -actin-R :CCGTGTTGGCGTAGAGGT，擴增的片段大小為 158bp)。4.豬組織總RNA的提取與cDNA的合成各組織總RNA的提取採用Invitrogen公司的Trizol Reagent試劑盒，按照該試劑 盒的說明書進行操作，總RNA利用1.0%瓊脂糖膠電泳來檢測它的完整性(28S、18S兩條主 帶清晰)，總 RNA 的純度利用 NanoDrop 2000 Spectrophotometer (美國 NanoDrop 公司)檢 測(0D260/0D280 = 1. 8-2. 0)。總RNA質量合格後才進行後續試驗。cDNA第一鏈的合成利用 Τ0Υ0Β0公司ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒進行，按該試劑盒的說明書操作。具體步 驟如下首先取1 μ g各組織總RNA溶液於200 μ 1的滅菌小PCR管中，於65°C變性5min，使 二級結構打開，然後立即置於冰上。然後分別加入4μ1 5XRT buffer, 1 μ 1 Primer Mix, 1 μ 1 RT Enzyme Mix，再補 Nuclease-free Water 20 μ 1，於 37°C逆轉錄 15min，接著 98°C 進行5min酶滅活，反應結束後於-20°C保存。5.豬Sixl基因的組織表達分析以所合成的梅山豬20個組織樣的第一鏈cDNA為模板，利用設計的檢測目的基因 Sixl的半定量引物(Sixl-5F和Sixl-5R)進行PCR擴增，同時對進行糾正的豬的內參基因 β -actin(DQ845171)進行擴增。PCR反應條件:94°C 5min，94°C 40sec，59°C 40sec，72°C 20sec, 26或29個循環(製備目的基因Sixl採用29循環，製備看家基因β -actin採用26個循環)， 72°C10min。PCR產物經1. 5%瓊脂糖膠電泳檢測。檢測結果見附圖2所示。結果顯示，候選 基因(Genbank登錄號為⑶225952)在骨骼肌中的表達量顯著高於其它所檢測的組織。實施例2 豬肌肉特異表達啟動子Sixl-P及相應缺失片段的獲取1.主要試劑
試驗用的DNA提取試劑盒(購自Bio Teke公司，貨號DP1901) ；TransEco FastPfu DNA Polymerase (購自北京全式金生物技術有限公司，貨號AP231) ；2XGC Buffer(購自 寶生物工程(大連)有限公司，貨號DRR20GCI)、LA Taq聚合酶(購自寶生物工程(大連) 有限公司，貨號:DRR20BG)、dNTP (購自 Roche 公司，貨號47382001)、DL-2000 Marker (購 自廣州東盛生物科技有限公司)、AC柱式快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒(購自Bio Teke公 司，DP1701)、載體pMD18-T Vector (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D101A)等。2.豬背最長肌組織基因組DNA的抽提本發明中的DNA提取採用Bio Teke公司的核酸提取試劑盒(Bioteke Corporation貨號DP1901，下述試劑均為該試劑盒自帶)，具體方法如下(1)將「梅山豬」背最長肌組織在液氨中迅速研磨成細粉，取20_50mg細粉轉移到 1. 5ml離心管中，加入200 μ L組織裂解液TL，用藍槍頭吹打均勻。(2)加入20 μ L蛋白酶K溶液(20mg/mL)，顛倒充分混勻。(3)將裂解物放在55°C中水浴1-3小時，或者直到組織完全消化，期間輕柔振蕩幾 次幫助裂解(4)加入200 μ L結合液CB，劇烈顛倒，充分混勻，70°C放置lOmin。(5)冷卻後加入100 μ L異丙醇，劇烈搖動混勻。(6)用藍槍頭去除不溶物，以免下面的不溶物堵塞離心柱。(7)將上一步剩餘的混合物加入一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，10，OOOr/ min離心30s，倒掉收集管中的廢液。(8)加入500 μ L抑制物去除液IR, 12，000r/min離心30s,棄廢液。(9)加入700 μ L漂洗液WB (確保該漂洗液是已經加入無水己醇的)，12，000r/min 離心30s，棄掉廢液。(10)加入 500 μ L 漂洗液 WB, 12，000r/min 離心 30s,棄掉廢液。(11)將吸附柱AC放回收集管中，1於3，000r/min離心2min，儘量去除漂洗液，以 免漂洗液中殘留的乙醇抑制下遊反應。(12)取出AC吸附柱，放入一個乾淨的離心管中，在吸附膜中間部位加入IOOyL 洗脫緩衝液EB (洗脫緩衝液事先在65-70°C水浴中預熱)，於室溫下放置3-5min，12，000r/ min離心lmin，將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置5分鐘，再12，000r/min離 心 lmin。將所提取的DNA於_20°C下可長期存放備用。3.豬Sixl基因啟動子Sixl-P片段的獲取申請人:首先利用美國國家生物技術信息中心即NCBI (見http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)的豬基因組序列信息，以所獲得的豬的mRNA為信息探針，通過同源序列比對，在 豬的基因組數據中獲得了該基因的啟動子序列，設計了 2對特異性引物(其編號為SP5F， SP5R和SP3F、SP3R)擴增豬Sixl基因的啟動子片段，分別命名為AB與CD序列。檢測結果 見附圖3與4所示PCR 反應體系5μ 1 5 X TransEco FastPfu Βμ ffer,0. 5μ 1 IOmM dNTP, 0. 5 μ 1 10 μ M/L 上下遊引物(其編號為 SP5F，SP5R 和 SP3F、SP3R)，2. 5U/ μ 1 TransEco FastPfu DNA Polymerase 0· 5 μ 1，DNA 1 μ 1，補滅菌超純水至 25 μ 1。
PCR 反應條件95°C預變性 2min ；95°C變性 20s ；60°C退火 40s ；72°C延伸 30s ；35 個循環；72°C延伸5min ； 25 °C保存。設計的引物見表1所示。表1本發明所設計的擴增啟動子的引物序列信息
引物 引物的DNA序列在序列表中的命退火溫延伸時擴增片
名稱名度rc)間段大小
(bp)
SP3FTACCGAATCACAAATGAACCCSEQ ID NO960°C60s912SP3RTTTATGCAGGCGGAAAGACASEQ ID NO10SP5FATTGTTCGGTGGTGCTGAGSEQ ID NO1161。C60s876SP5RAAAGGCCGCTACTATTTGGSEQ ID NO12P6FcgffGGFACC GCTCCCCTTATCTCCTTGCASEQ ID NO1360 °C80s1494P5FcssGGTACC AAGCATTCTCTACACAAACSEQ ID NO1460 °C70s1335P4FcrbGCTMCCTCTCAGAACAGGGCAAGGATTSEQ ID NO1560 °C60s1143P3FcgKGGTACC GCTGTCCCAAATA GTAGCGGSEQID NO1660 0C50s844P2FciieGCTMCCGGGGAATATGAAGGTCTGGAG cgpGGTACC GCTGCGGGTAGAACAGAAASEQ ID NO1760。C40s530PlFSEQ ID NO1860。C20s180PdRccuCTCG^GCAGGCGGAAAGACAAGTCAASEQ ID NO19表1說明下劃線部分表示為KpnI酶切位點，陰影區部分表示保護鹼基。在此基礎之上，申請人利用寶生物工程(大連)有限公司生產的LA Taq聚合酶通 過一個融合PCR將SP5F，SP5R和SP3F、SP3R所擴增的序列融合在一起，獲得一條完整的AD 啟動子序列，檢測結果見附圖5所示。具體操作步驟如下(1)配製融合 PCR 反應體系12· 5μ 1 2XGC Βμ ffer,0. 5μ 1 IOmM dNTP, 0. 25 μ 1 5U/ μ 1 LA Taq Polymerase,以AB與CD PCR產物各1 μ 1為模板，補滅菌超純水 至 25 μ 1。(2)PCR產物的融合94°C預變性4min ；94°C變性40s ；60°C退火80s ；72°C延伸 80s。(3)加入反應引物在反應體系中分別加入0.5μ 1 ΙΟμΜ/L SP5與SP3引物，輕
輕混均。(4)融合序列的獲取94°C預變性2min ；94°C變性20s ；60°C退火40s ；72°C延伸 140s ；30 個循環；72°C延伸 IOmin ；25°C保存。PCR產物的回收純化；PCR產物經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測後，在紫外燈下從瓊 脂糖凝膠上將含有目的片段的凝膠切下，放入1. 5mL Ependorff管中，然後用PCR產物純化 試劑盒(貨號DP1701，購自北京百泰克生物技術有限公司)純化PCR產物。連接反應將純化的PCR產物與pMD18-T載體(購自TAKARA公司)連接，連接反 應總體積是 10 μ 1，其中包括 2. 5μ 1 2Χ ligation buffer, 0. 3 μ 1 載體，7. 2μ 1 純化 PCR 產物，4 °C過夜連接。轉化無菌狀態下取50 100μ 1感受態細胞於1. 5ml Ependorff管中，將 5 10 μ 1的連接產物加入輕輕混勻，在冰上放置30min後42°C熱激90s，其間不要搖動 Ependorff管，取出後迅速冰浴3 4min，加入200 μ 1無抗生素的LB培養液，37°C，220rpm/min溫浴復甦45-60min。然後5000rpm/min離心5min，去除適量的上清，將剩餘的菌體與培 養基輕輕混勻，含氨苄青黴素(Amp)濃度為100yg/mL的平板上，塗勻，37°C正置培養Ih後 倒置培養，14-16小時後觀察有無菌落長出。陽性克隆子的鑑定及測序從平板上挑取單克隆接入1. 5mL含500 μ L氨苄青黴 素(Amp)濃度為100 μ g/mL的LB培養液中，並於37°C搖床220rpm/min培養約4_6h左右。 以菌液為模板，選用擴增啟動子Pl，P2，P3，P4，P5與P6特異性引物(表1所示)進行PCR 擴增。電泳檢測，挑取陽性克隆子的菌液送去測序，序列測定由北京奧科生物技術有限責任 公司完成。測序結果顯示所擴增的序列為豬Sixl基因的啟動子序列，將該啟動子命名為 Sixl-P。4.豬Sixl基因啟動子不同缺失片段的獲取以所獲得的Sixl-P序列為模板設計了 6對擴增不同長度啟動子的缺失引物，6個 5』缺失片段共用同一個下遊引物，命名為PdR(該引物的序列見SEQ ID N0:19)。將上遊引 物分別命名為P1F、P2F、P3F、P4F、P5F與P6F，它們分別對應序列表中SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO: 14 與 SEQ ID NO 13 所示的序列，上述引 物以及相應的信息如表1所示。在每條上遊引物5'端都引入KpnI酶切位點(以下劃線部 分表示)及相應的保護鹼基(以陰影區表示)。而在下遊引物PdR的5'端添加XhoI酶切 位點(以下劃線部分表示)及相應的保護鹼基(以陰影區表示)。P1F、P2F、P3F、P4F、P5F 與P6F所擴增的啟動子片段的長度分別為180bp、530bp、844bp、1143bp、1135bp與1494bp， 分別命名為P1、P2、P3、P4、P5與P6序列，它們分別對序列表中的SEQ ID NO :2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 與 SEQ ID NO :7。將含有Sixl-P的陽性克隆擴大培養，並提取質粒，質粒命名為pMD18-T_Sixl-P， 然後以此質粒為模板，利用所設計的特異性缺失引物進行不同長度啟動子的擴增。所擴增 的不同長度的啟動子片段電泳結果如圖6所示。將所獲得的不同長度啟動子的PCR產物 進行回收純化、連接、轉化、陽性克隆的篩選以及陽陽克隆測序，具體操作步驟如3.豬Sixl 基因啟動子Sixl-P片段的獲取所述。然後將含有PI、P2、P3、P4、P5與P6序列的陽性克 隆擴大培養，並提取質粒，質粒命名為 pMD18-T-Pl、pMD18-T-P2、pMD18_T_P3、pMD18_T_P4、 PMD18-T-P5 與 pMD18-T-P6。實施例3 豬肌肉特異表達啟動子相應缺失片段轉染載體的構建1.主要試劑內切酶 KpnI 與 XhoI (Fermentas, Cat. #ER0527/Cat. #ER0691)，質粒提取試劑盒 OMEGA 公司(OMEGA，Cat. D6950-01)，T4 ligase (Fermentas, Cat. #EL0334)，pGL3_Basic 載 體(Promega 公司，Cat. #E1751)。2.雙螢光素酶報告載體pGL3-BasiC雙酶切用Kpnl、XhoI 雙酶切 pGL3-Basic 載體，雙酶切體系 20μ 1 :2μ 1 10XTang Buffer, 2 μ 1 Kpnl, 2 μ 1 XhoI,4y 1 pGL3_Basic 載體，補滅菌超純水至 20 μ 1。37°C過夜 酶切。酶切產物用純化試劑盒(DP1701，購自北京百泰克生物技術有限公司)回收純化。回 收產物置於-20°C冰箱保存。3.含啟動子相應缺失片段的TA克隆載體雙酶切用Kpnl、XhoI 雙酶切 pMD18_T_Pl、pMD18_T_P2、pMD18_T_P3、pMD18_T_P4、PMD18-T-P5 與 pMD18-T-P6 載體，雙酶切體系 20 μ 1 :2 μ 1 10 X Tang Buffer, 2 μ 1 KpnI， 2μ 1 XhoI，6 μ 1含有目的片段的TA克隆載體，補滅菌超純水至20 μ 1。37°C過夜酶切。酶 切產物用純化試劑盒(DP1701，購自北京百泰克生物技術有限公司)回收純化。回收產物置 於-20°C冰箱保存。4.重組載體的構建將雙酶切回收後的P1、P2、P3、P4、P5與P6啟動子片段連入雙酶切後的pGL3_BaSic 載體上，所構建的載體分別命名為 pGL3-Basic-Pl、pGL3-Basic_P2、pGL3-Basic_P3、 pGL3-Basic-P4、pGL3-Basic_P5 與 pGL3-Basic_P6。連接體系 20 μ 1 :2 μ 1 10XBuffer, 1 μ 1 5U/y 1 Τ4 ligase，2y 1 雙酶切的 pGL3-Basic 載體，10μ 1Ρ1、Ρ2、Ρ3、Ρ4、Ρ5 或 Ρ6 啟動子片段，補滅菌超純水至20 μ 1。22°C孵育10min，70°C加熱5min。然後取IOylR 化入大腸桿菌DH5a。利用PCR來檢測陽性克隆，陽性克隆送北京奧科生物技術有限責 任公司進行測序。序列經測序確認正確後，對陽性克隆進行擴大培養，並抽提質粒。質 粒提取用OMEGA公司的質粒提取試劑盒提取，質粒純度與濃度純度利用NanoDrop 2000 Spectrophotometer (美國 NanoDrop 公司)檢測，所測的樣品的 0D260/0D280 值在 1. 8-2. 0 才可用於後續的實驗。另外，所提取的質粒再次進行雙酶切鑑定，雙酶切鑑定結果如圖7所 示。雙酶切鑑定結果顯示所構建的重組載體正確。實施例4 豬肌肉特異表達啟動子相應缺失片段的活性分析1.主要試劑與耗材主要試劑胎牛血清(FBS,GBIC0,16000-044)，DMEM 液體(GBI CO, Cl 1995)，D-PBS 乾粉，0. 25 % trypsin-EDTA 溶液(GBIC0，Cat. No. 25200)，Lipofectamine 2000 脂質 體轉染試劑(Invitrogen 公司，Cat. No. 11668-027), Dual-LuciferaseReporter Assay System(美國 Promega 公司，Cat. #E 1910)。主要耗材細胞培養24孔板(美國Corning公司，Cat. No. 3524)、細胞培養瓶、一 次性塑料移液管、0. 22 μ m孔徑的一次性濾器、一次性針頭注射器、封口膜(Parafilm公司， PM-996)、橡膠手套，酶標板(美國Corning公司，Cat. No. 3590)2.細胞培養PBS配製試驗過程中也可以購買商品化的PBS乾粉，直接按照要求兌超純水，然 後滅菌使用。細胞培養基的配製1XDMEM液體(GBIC0，C11995)中加入 10 % FBS(GBIC0， 16000-044) (ν ν)，過濾除菌。0. 25 % trypsin-EDTA溶液本試驗所用試劑為配製好的商品試劑(GBIC0， 25200)，用1. 5mL離心管分裝成300 μ 1/管使用。在進行脂質體轉染實驗前的頭一天晚上，將細胞消化後用生長培養基將細胞密度 稀釋成1-4X IO5個/ml，並取500 μ 1細胞懸液接種到24孔培養板中，每個樣品進行3個重
Μ. ο3.脂質體轉染(1)轉染質粒的準備，將需要轉染的插入了不同啟動子片段的目的質粒均稀釋成 0. 2 μ g/μ 1，將內參質粒稀釋成0. 02 μ g/μ 1，然後取Iyg目的質粒與0. 05 yg內參質粒 混合(20 1的比例)，輕輕吹打均勻。同時分別取1 μ g pGL3-Basic和pGL3_Control與0. 05μ g內參質粒混合，分別用於陰性與陽性對照。(2)將⑴中混後的質粒用50 μ 1的Opti-MEM無血清培養基稀釋，輕輕混勻，室溫 放置5min。(3)取適量的Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑，用50 μ 1的Opti-ΜΕΜ無血 清培養基稀釋，輕輕混勻，室溫放置5min。轉染試劑量按所取質粒的量而定，本發明中轉染 試劑質粒的比例為2. 5 1。(4)將(2)中所稀釋混合質粒與(3)中所稀釋的脂質體轉染試劑混合，並輕輕混 勻，室溫放置20min。(5)在靜置轉染複合物的時候，將前天晚上接種到24孔板中的細胞培養基去掉， 換上新鮮的Opti-MEM無血清培養基。(6)取100μ1(4)中準備的轉染複合物輕輕加入24孔板中，輕輕晃動培養板使轉 染複合物均勻分布在細胞培養液中。(7)將細胞培養板置於5% CO2培養箱中37°C培養中培養，4_6h後換上含血清的 新鮮的培養基繼續培養，24h後時行細胞的收集。3.螢光素酶活性測定(1)試劑的配製IXPLB(細胞裂解液)利用1倍體積的5XPassive Lysis Buffer(PLB)細胞裂 解液母液，加入4倍體積的滅菌的超純水，輕輕混勻，裂解液現配現用。LARII螢光素酶分析底物螢光素酶分析底物為粉末，本發明中的產品為 Cat. #E1910，直接試劑盒中的IOml螢光素酶分析緩衝液II (Luciferase Assay Buffer II) 加入瓶裝的LARII螢光素酶分析底物(Luciferase Assay Substrate)的粉末中，用移液槍 輕輕混勻。-70°C可保存。1X Stop & Glo Reagent 試劑50XStop & Glo Substrate 用 Stop & Glo Buffer 稀釋成IX Stop & Glo Reagent進行實驗，此試劑現配現用。(2)細胞的裂解轉染24h後收集細胞，先用PBS漂洗一次，然後加入配製好的100 μ 1細胞裂解液 (IXPLB)裂解細胞，室溫搖晃15mim，然後轉入1. 5ml的離心管中。(3)取10 μ 1裂解加入酶標板中，利用PerkinElmer公司的VICTOR X2 Multilabel Plate Reader儀器進行雙螢光素酶活性測定。a.先打開電腦，然後開啟儀器。b.啟動軟體，選擇Tool工具中的Dispenser maintenance進入一個設置界面。c.選擇Flush，用滅菌的超純水同時對進樣柱進行清洗，洗1-2次。d.洗完後選擇Empty對進樣柱進行排空，然後單獨對兩個進樣柱進行清洗，檢測 進行柱是否能夠正常進樣。e.選擇第一根進樣柱，選擇Fill，用LARII填滿，並將回收杯中流出的LARII回收 重新利用。f.選擇第二根進樣柱，用Stop buffer填滿，並將回收杯中流出的Stop buffer回 收重新利用。g.將準備好的加入了 10 μ 1細胞裂解液的酶標板放入Multilaber Reader中。
h.在軟體主界面中選擇進樣方式，如自動進樣則選擇Auto-dual-luciferase。i.然後在Sample界面中選擇所需要測定的樣品，同時點擊Save進行設置保存。j.在Sample界面中右擊選擇Measure中的by wells，並點擊運行進行樣品測定。k.測定後點Tool中Dispenser maintenance，選擇排空項Empty對進樣柱進行排 空，並用滅菌的超純水對進樣柱進行清洗。1.先關軟體，然後關儀器，再後關電腦。4.啟動子活性統計分析申請人:利用SPSS 13. 0軟體中的單因素方差分析(One-wayANOVA)對豬Sixl基因 不同長度啟動子活性進行了統計分析，並利用Duncan多重比較方法進行了顯著性檢驗，統 計結果如表2所示。表2不同長度啟動子活性比較
權利要求
一個適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子Six1 P，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
2.一個適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子P2-530，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 3所示。
3.—個適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子P3-844，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 4所示。
4.一個適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子P4-1143，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 5所示。
5.一個適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子P5-1335，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 6所示。
6.一個適用於豬骨骼肌基因表達的啟動子P6-1494，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 7所示。
7.權利要求1-6任一項所述的啟動子在豬遺傳改良中的應用。
全文摘要
本發明屬於動物基因工程領域。從豬基因組中克隆了一個豬骨骼肌特異表達基因上遊七個不同長度的啟動子Six1-P、P1、P2、P3、P4、P5與P6，其核苷酸序列如SEQ ID NO1；2；3；4；5；6；和7所示，序列長分別為1692、180、530、844、1143、1135和1494bp。對豬Six1基因不同長度的啟動子片段在三種真核細胞中的活性分析表明，豬Six1基因的啟動子是一個肌肉特異性的啟動子，除P1啟動子外其它幾個啟動子P2、P3、P4、P5與P6均具有啟動基因表達的能力，並且在P2、P3、P4、P5與P6這5個啟動子中，除P2外，其它幾個啟動子均表現出肌肉特異性。本發明公開了這七個啟動子及其相應表達載體的製備方法，以及利用雙螢光素酶報告系統對豬Six1基因啟動子活性的鑑定。
文檔編號A01K67/027GK101979547SQ20101027246
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月2日 優先權日2010年9月2日
發明者任竹青, 吳望軍, 左波, 徐德全, 熊遠著, 雷明剛 申請人:華中農業大學