一種鴉膽子總萜提取物及其製備方法和用途的製作方法

2023-12-03 04:35:11 4

專利名稱：一種鴉膽子總萜提取物及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥化學領域，特別涉及一種鴉膽子總萜提取物的製備方法，以及該方法製得的提取物在抗腫瘤、尖銳溼疣、治療惡性胸腔積液、治療帶狀皰疹、抗阿米巴藥，治療抗白血病藥物中的應用。
背景技術：
鴉膽子是苦木科植物鴉膽子Brucea javanica(L. )Merr的成熟果實，始載於《本草綱目拾遺》，鴉膽子異名老鴉膽《生草藥性務要》，鴉膽、苦榛子《吉雲旅鈔》，苦參子《綱目拾遺》，鴉蛋子《植物名實圖考》，鴨蛋子《醫學衷中參西錄》，鴨膽子《中藥志》，解苦楝《廣西中藥志》，小苦楝《廣西中草藥》。主產於我國南方的海南、廣東、廣西及雲南等地。秋季果實成熟時採收，除盡雜質後曬乾，其味苦、性寒。歸大腸、肝經。《本草綱目》記載鴉膽子可用於治療痢疾、裡急後重和痔瘡。歷史上我國民間廣泛應用鴉膽子治療阿米巴痢疾等疾病，如張錫純提倡用鴉膽子治療痢疾。《醫學衷中參西錄》卷三日「滄州友人滕玉可，壬寅之歲，設教鄉村，於中秋下赤痢，且多鮮血。醫治兩旬不愈。適愚他出新歸，過訪之，求為診治。其脈象洪實，知其純系熱痢。遂謂之日此易治。買苦參子百餘粒，去皮，分兩次服下即愈矣。翌日愚復他出，二十餘日始歸。又訪之，言曾遍問近處藥坊，皆無苦參子。後病益劇，遣人至敝州取來，如法服之， 兩次果愈。功效何其神哉。」《醫學衷中參西錄》「鴉膽子性善良血，止血兼能化化瘀生新。 凡痢之偏於熱者用之均有捷效，而以治鮮血之痢，洩血之水痢，則尤效。又善清胃腑之熱，胃腑有實熱充塞，噤口不食者，服之即可進食。鴨蛋子不但善利下焦，即上焦有虛熱者，用之亦妙。此所以治噤口痢而有捷效也。」「涼血解毒，善治熱性赤痢，二便因熱下血。」 「治梅毒及花柳毒淋。搗爛醋調敷療毒。善治疣。」鴉膽子的含油率為20%左右，含仁率為36%，種仁含油約56. 23%。油中不皂化物1.36% 皂化物為92. 47% .其脂肪酸組成為油酸81. 87%、亞油酸3. 37%、硬脂酸 2. 65%、棕桐酸6. 62%和三醯甘油酯。研究發現鴉膽子油的三甘酯水解後的產物油酸具有很強的抗腫瘤活性，而且亞油酸及共軛亞油酸也具有抗腫瘤活性。鴉膽子中主要化學成分還有苦木內酯及其苷類、類苦木素類、生物鹼類、黃酮苷類等成分。鴉膽子苦木內酯及其苷 如鴉膽子苦素，鴉膽子苦醇，去氫鴉膽子醇，鴉膽亭，鴉膽亭醇，鴉膽子苦素E-2-D-葡萄糖苷、鴉膽子苦烯、鴉膽子苦酯內酯，鴉膽子苷，鴉膽子苦苷等。在我國，10%的鴉膽子油乳劑已經在臨床上用於治療消化系統腫瘤，如胃癌、食管癌、原發性肝癌、大腸癌、胰腺癌等。乳劑屬於多相動力學不穩定分散體系，在受熱、受冷及長期儲存過程中均能引起乳析和破裂。滲漏的鴉膽子油毒性大，對胃腸黏膜和血管壁的刺激性也很嚴重，臨床應用中有噁心、厭食等消化道不良反應。並且10 %的鴉膽子油乳劑中主要成分為油酸、亞油酸、棕櫚酸等脂肪酸成分，雖然這些成分有報導具有抗腫瘤活性，但其活性普遍不高，易造成不良反應。現今國內申報的關於鴉膽子的專利，全部圍繞著鴉膽子油進行。本專利內容採用了一種全新的鴉膽子有效部位，去除了鴉膽子油中的大部分脂肪酸成分，增加了過去鴉膽子油的提取工藝未能提取出來的有效成分，增強了治療效果，減少了毒副作用。細胞實驗證實，採用本工藝製備的鴉膽子總萜提取物的抑瘤活性是鴉膽子油的300倍以上。並且採用新的技術對樣品進行精製，極大地減少了細胞毒性。

發明內容
本發明的目的在於提供了一種鴉膽子總萜提取物及其製備方法，該方法採用醇提取，用非極性溶劑萃取，柱分離的方式，得鴉膽子總萜，製備方法簡單，確保了有效成分最大程度的保留。本發明的另一目的在於總萜提取物在抗腫瘤、尖銳溼疣、治療惡性胸腔積液、治療帶狀皰疹、抗阿米巴藥，治療抗白血病藥物中的應用。本方法採用的技術方案是一種鴉膽子總萜提取物，其總萜含量大於50%。鴉膽子總萜提取物的製備方法是取鴉膽子，用醇提取，合併提取液，回收醇，浸膏可以採用①加水分散後，用非極性溶劑萃取，收集有機溶劑層，濃縮得鴉膽子總萜；②上柱洗脫分離，得鴉膽子總萜；③加水分散後，用非極性溶劑萃取，收集有機溶劑層，濃縮，柱分離，得鴉膽子總萜。所述的鴉膽子可以直接投料或粉碎後投料。所述的提取溶劑可以為濃度在30% -100%的甲醇、乙醇或正丁醇等。所述的提取方法可以為浸漬、滲濾、加熱提取等。所述的萃取溶劑可以為乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等。所述的分離柱可以為氧化鋁、矽膠、聚醯胺或大孔吸附樹脂。所述的用途為鴉膽子總萜提取物在抗腫瘤、尖銳溼疣、治療惡性胸腔積液、治療帶狀皰疹、抗阿米巴藥，治療抗白血病藥物中的應用。所述的藥物組合物製劑形式可以是膠囊、軟膠囊、滴丸、片劑、口服溶液、湯劑、糖漿劑、藥酒、煎膏劑、酊劑、浸膏劑、茶劑、顆粒劑及注射劑等。本發明總萜含量在50%以上，總萜主要由四環三萜類組成。鴉膽子總萜含量測定對照品溶液的製備精密稱取105°C下乾燥至恆重的齊墩果酸對照品8mg，置 IOOml量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得。(每Iml含齊墩果酸0. 08mg)。供試品溶液的製備取鴉膽子總萜提取物15mg，置IOOml量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得。標準曲線的製備精密吸取上述對照品溶液0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6ml，分別置具塞試管中，水浴揮去溶劑，冷卻，準確加入0. 4ml 5%香草醛-冰醋酸溶液和1. 8ml高氯酸， 混勻，密塞。置70°C恆溫水浴中加熱20min，取出，冷卻至室溫，加冰醋酸5ml，搖勻，在540nm 處測定吸光度，以試劑為空白。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪製標準曲線。含量測定精密量取供試品溶液0.細1，按標準曲線項下操作，依法測定吸光度， 計算含量。本發明的有益效果是製備方法簡便，成本低，純度高，活性強，毒副作用弱。由於含量高，活性強，雜質少，可以減少服用量，減少毒副作用。更有利於保證藥物的安全性、有效性和質量可控性。從原料中製備鴉膽子總萜收率約為0. 5-2%。
具體實施例方式下面通過實施對本發明作進一步說明，其目的僅在於更好地理解本發明的內容而非限制本發明的保護範圍實施例1 取鴉膽子10kg，粉碎，加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2小時，濾過，合併濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度(1. 30-1. 35)，加2倍水分散，加二氯甲烷萃取四次，每次用量為藥液的2倍量，合併萃取液，回收溶劑，上聚醯胺柱，50%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，乾燥，得鴉膽子總萜。總萜含量86.4%。實施例2 取鴉膽子10kg，加6倍量乙醇，回流提取3次，每次1小時，濾過，合併濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度(1. 20-1. 30)，加石油醚萃取三次，每次用量為藥液的2倍量，合併石油醚液，水液用乙酸乙酯萃取四次，每次用量為藥液的2倍量，合併萃取液，回收溶劑，乾燥， 得鴉膽子總萜。總萜含量56. 1%。實施例3 取鴉膽子10kg，加18倍量80%乙醇，回流提取3小時，濾過，合併濾液，回收乙醇， 濃縮至相對密度(1. 15-1. 25)，加石油醚萃取2次，每次用量為藥液的3倍量，合併石油醚液，水液用氯仿萃取四次，每次用量為藥液的1倍量，合併萃取液，回收溶劑，乾燥，得鴉膽子總萜。總萜含量65. 3%。實施例4 取鴉膽子10kg，加15倍量乙醇，回流提取3小時，濾過，合併濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度(1. 25-1. 35)，加石油醚萃取3次，每次用量為藥液的3倍量，合併石油醚液， 水液用二氯甲烷萃取3次，每次用量為藥液的2倍量，合併萃取液，回收溶劑，上矽膠柱，甲醇-乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，乾燥，得鴉膽子總萜，總萜含量98. 5%。實施例5 取鴉膽子10kg，加10倍量乙醇，回流提取2次，每次2小時，濾過，合併濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度(1. 28-1. 35)，上大孔吸附樹脂柱，20%乙醇洗脫，去掉洗脫液，繼用 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑，乾燥，得鴉膽子總萜，總萜含量72. 3%。實驗例1 鴉膽子總萜體外對腫瘤細胞的抑制作用材料與方法1、細胞珠人宮頸癌細胞珠Hela(中國醫科大學)；紅白血病細胞珠K562 (購於 CCTCC)、人乳腺癌細胞株MCF-7 (中科院上海細胞庫)。2、藥材與試劑鴉膽子、胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)、巴氏染液、二甲基亞碸、新生牛血清、注射用鹽酸阿黴素、氟尿嘧啶注射液、鴉膽子油注射液等。3、儀器與設備C02培養箱(HH-CP)、超淨工作檯(SW-CJ-IFD)、倒置顯微鏡(CKX41-32PH)、酶標儀 (Multiskan MK3)、無菌培養板、SIGMI-14型低速離心機、流式細胞儀(FACSCalib. urBD公
5司)、水浴鍋(Senco W201B)等。4、實驗內容及方法4. 1細胞復甦細胞凍存管從液氮罐中取出，立即37°C水浴鍋中，不斷振搖凍存管，使其迅速融解，1000r/min離心5分鐘，超淨工作檯中倒掉上清液後，K562細胞、Hela細胞加少量RPMI1640全培養液於凍存管中，MCF-7細胞加DMEM全培養液，超淨臺上抖動凍存管，將底部細胞抖松，混勻。轉移到無菌培養瓶中(玻璃瓶)，加適量對應的全培養液，凍存管內剩餘細胞再用全培養液洗，洗液轉入同一培養瓶中，補充一定量的全培養液。吸管吹勻細胞後，置37°C 5% C02中培養。4. 2細胞傳代4. 2. 1K562細胞傳代將培養M小時細胞液取約0. 5ml，血球計數板中，加臺盼藍染液計數。觀察細胞生長情況後，將細胞液轉移到無菌離心管中，lOOOr/minS-lOmin，棄上清液，加aiilRPMI1640全培養液(10%小牛血清)離心管中吹勻細胞後。各吸一半細胞液到新培養瓶中，補足RPMI1640全培養液後，繼續培養。此細胞傳代3次後，細胞在對數生長期內後即可接種到96孔板中。4. 2. 2MCF-7 細胞傳代培養瓶中細胞長至瓶底65% -85%時傳代。超淨臺中無菌操作將舊培養液倒入廢液容器中，用PBS或D-hanks緩衝溶液洗3次後，倒乾洗液，加入幾滴0. 25%胰蛋白酶後置顯微鏡下觀察，待細胞收縮突起、變圓時，立即倒轉培養瓶，置超淨工作檯中加DMEM全培養液終止消化，無菌吸管將瓶底細胞吹洗下來，並吹勻。將細胞分到兩個培養瓶中，補足培養液後，置5% C02培養箱中培養，每次傳代前均計數細胞，待細胞生長至對數生長期時即可進行藥物篩選實驗。4. 2. 3hela 細胞傳代倒置顯微鏡下觀察發現細胞貼壁伸展，生長良好，培養48h，見85 %細胞貼滿瓶壁，吸出培養液，加入含EDTA的胰酶消化細胞，見細胞收縮變圓，細胞間隙增大，棄胰酶，用含血清RPMI-1640培養液終止消化，反覆吹打，使細胞從瓶壁上脫落，成為細胞懸液，1 2 分裝傳代繼續培養。4. 3 加樣4. 3. 1 K562細胞培養對小時後，96孔板中加一定濃度鴉膽子總萜。同時設有陽性對照(阿黴素)、標準對照(不含藥物，而有培養液和細胞的孔)、空白對照(僅有培養液， 而無藥物和細胞的孔)。藥物每個濃度設三個復孔。37°C，5% C02培養箱中培養48h。每個濃度平行3次，重複2次。4. 3. 2MCF-7細胞、hela細胞培養M小時後，96孔板中加一定濃度鴉膽子總萜，同時設標準對照、空白對照和陽性對照5-氟尿嘧啶(5-FU)，藥物每個濃度設三個復孔。培養箱中繼續培養48h。4. 4細胞染色K562細胞培養48小時後，向96孔板中加入MTT，培養4h後，加入三聯液(10% SDS-5%異丁醇-0. Olmol/LHCl)，酶標儀檢測。加入三聯液後，液體顏色在M小時內比較穩定，置酶標儀中570處測OD值。MCF-7細脆培養4 後，向96孔板中加一定量的三氯乙酸，Ih後，無菌水洗5次，甩幹96孔扳的水，並用濾紙吸乾，加入SRB染色液，15min後醋酸洗5次，乾燥後，加三羥甲基胺基甲烷溶解，置酶標儀中590處測OD值。hela細脆培養4 後，每孔加入ΜΤΤ200μ 1，孵育4h，去上清加入150μ 1 二甲基亞碸(DMSO)，振蕩lOmin，按常規方法用酶標儀在490nm處測吸光度(OD)值。4. 6結果測定每個濃度平行3次，重複2次，結果以平均值士標準差表示。抑制率計算公式如下
(標準對照OD值-樣品OD值)
抑制率(％)= - X 100%
標準對照OD值式中(標準對照OD值=標準對照測量值-空白對照測量值，樣品OD值=樣品測量值-空白對照測量值)所得資料用SPSS13. O For windows統計軟體分析，數據用I士 s表示，組間比較用 t檢驗。結果H鴉膽子總萜對本實驗用腫瘤細胞均有顯著抑制作用，呈明顯的量效關係。對 K562細胞抑制作用稍弱，對抑制Hela細胞和MCF-7細胞時鴉膽子總萜顯示了較強的作用。 高倍鏡下可見細胞呈病理性萎縮和不可逆性損壞，隨藥物濃度增高，可見細胞周圍碎片增多，而陰性對照組未見明顯病理改變。實驗例2 鴉膽子提取物體外抑瘤作用材料與方法1動物與細胞株清潔級ICR小鼠，體重(21 士2)g，雌雄各半，由山東大學提供小鼠移植性腫瘤肉瘤(S180)、肝癌Ofeps)，均由中國科學院上海藥物研究所提供。2 試劑環磷醯胺(CTX)，SOD、MDA試劑盒，切片石蠟，無水乙醇，其它常規化學試劑均為分析純。3儀器與設備電熱恆溫水浴箱，電熱恆溫水浴鍋，低速自動平衡離心機，可見光分光光度計，切片機。4實驗內容及方法4. 1藥物用量及配置試驗用藥物在成年人(按體重60kg計算)的用量為9-15g.d_l，小鼠口服用藥量按公式dB = dA* (RB/RA) * (WA/WB) 1/3計算。dB為小鼠口飼用量(mg. kg-Ι)，dA為人體口服用量(mg/kg) ；RA.人體型係數，為100 ；RB 小鼠體型係數，為59 ；WA 成年人體重，按60Kg 計算；WB 小鼠體重，按21g計算。取體外抑瘤實驗效果較好的鴉膽子總萜以0. 9% NaCl配成所需濃度。4. 2體外抑瘤實驗
選擇腫瘤生長良好的荷瘤小鼠，無菌條件下取出腫瘤，用0.9% NaCl按比例 (S1801 3, Heps 1 4)製成腫瘤細胞懸液，每隻小鼠右前肢腋窩皮下接種0. ^iil。接種後使用均衡隨機法分組(每組雌雄各半，組間平均體重相差不超過Ig)，實驗組每組10隻， 對照組每組14隻。設陰性對照組(溶媒)、陽性對照組(CTX)，鴉膽子總萜給藥組各設1、5、 20mg. kg-13個劑量。接種24h後開始灌胃給藥，每天固定時間段給藥一次並記錄小鼠的活動情況，連續10d，術次給藥後24h稱體重，摘眼球取血後處死，完整剝離腫瘤、肝臟、脾臟、 胸腺等組織。4. 3療效總體評價分別稱取各組小鼠瘤質量及其肝臟、脾臟、胸腺等器官的質量，並計算其抑瘤率和肝臟、脾臟、胸腺指數。4. 4抗氧化指標摘眼球取血，分離得到血清。採用黃嘌呤氧化酶法測定S0D，硫代巴比妥酸法測定 MDA。4. 4血清SOD測定測定原理黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生(02-)，後者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈紫紅色，而SOD則抑制其反應，根據抑制率的高低計算出SOD的含量。4. 5病理觀察取各組瘤塊組織，脫水透明後石蠟包埋，常規病理切片製備，HE染色，光學顯微鏡下觀察。結果1、小鼠活動情況觀察環磷醯胺組小鼠進食量較陰性對照組明顯減少，毛髮乾枯，蓬鬆、無光澤，且有中度腹瀉，體質消瘦，活動遲緩。而鴉膽子總萜組小鼠較陰性對照組活動敏捷，進食量增加。2、療效總體評價鴉膽子總萜3個劑量組對小鼠S180腫瘤、小鼠H印s腫瘤均有較強的抑制作用，和陰性對照組相比，均有顯著性差異。兩種腫瘤的抑制作用均以中劑量組(5mg/kg)效果為好。與陰性對照組比較，鴉膽子總萜各處理組小鼠肝、脾、胸腺指數無明顯改變，而CTX組脾、胸腺指數明顯降低，與陰性對照組比較差異有顯著性。3、對荷瘤鼠血清抗氧化功能的影響鴉膽子總萜中劑量組(5mg/kg)作用的S180、Heps荷瘤小鼠血清SOD活力均有升高，MDA水平均下降，與陰性對照組對比均差異有顯著性。結果見表1、表2。表1鴉膽子總萜對荷S180小鼠SOD和MDA的影響(χ士s，η = 10)
權利要求
1.一種鴉膽子總萜提取物，其特徵在於總萜含量大於50%，其是通過以下方法製備的(1)取鴉膽子，粉碎，用醇類溶劑提取1-8次，每次溶劑用量為原藥材重量的1-20倍，每次提取時間為0. 5-10小時，合併提取液，回收溶劑，得總提取物浸膏。( 將上述得到的浸膏加水稀釋，用低極性溶劑萃取，收集有機溶劑層，濃縮得浸膏，加水分散，經柱色譜分離， 得鴉膽子總萜提取物。
2.一種鴉膽子總萜提取物的製備方法，其特徵在於(1)將鴉膽子粉碎，用0 100%甲醇或乙醇回流提取廣8次，每次溶劑用量為藥材重量的廣20倍，每次提取時間為0. 5^10小時，合併提取液，過濾，回收乙醇，濃縮得浸膏；(2)將上述得到的浸膏加水稀釋，加水量為浸膏重量的2 20倍，然後上大孔樹脂柱、聚醯胺柱或矽膠柱吸附，浸膏重量與吸附填料體積的比是1 0.5 10，單位g ml，色譜柱徑與柱高比為1 廣30，大孔樹脂和聚醯胺柱依次用水和濃度為5 95%的乙醇洗脫，流速為 0.5 3. 5個柱體積/小時；矽膠柱用石油醚和丙酮5 1混合溶劑洗脫。(3)收集洗脫液，進行減壓濃縮或真空乾燥或噴霧乾燥或冷凍乾燥，即得鴉膽子總萜提取物。
3.權利要求1所述的一種鴉膽子總萜提取物在製備抗腫瘤、尖銳溼疣、治療惡性胸腔積液、治療帶狀皰疹、抗阿米巴藥，治療抗白血病藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於將鴉膽子提取物與醫學上可接受的輔料混合製成膠囊劑、片劑、散劑、顆粒、口服液、酒劑、丸劑、微丸劑、合劑、酊劑中的任意一種。
全文摘要
本發明公開了一種鴉膽子總萜提取物及其製備方法，一種從鴉膽子中提取分離得到的含有鴉膽子二、三萜及倍半萜類成分的提取物。經藥效學及毒理學實驗證明，該提取物對多種腫瘤具有較好的治療作用，有效成分比較明確，有利於保證藥物的安全性和有效性。原料提取得率高，成本低，操作簡便，適用於工業化生產，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K36/185GK102188459SQ20101012016
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月9日 優先權日2010年3月9日
發明者田玲, 胡清文 申請人:胡清文