肝癌預後標記物的製作方法

2023-11-05 05:57:47 1

專利名稱：肝癌預後標記物的製作方法
技術領域：
本發明涉及肝癌預後標記物(marker for prognosis of liver cancer)；涉及用於評估肝癌預後的組合物，該組合物包含能夠檢測所述肝癌預後標記物的表達水平的變化的物質；涉及用於評估肝癌預後的試劑盒，該試劑盒包含所述用於評估肝癌預後的組合物； 涉及使用所述肝癌預後標記物進行肝癌預後評估的方法；以及涉及使用所述肝癌預後標記物來篩選肝癌的治療劑的方法。
背景技術：
癌症與惡性腫瘤有相同的意義。它是指這樣一種疾病，由於各種原因，調節細胞增殖的功能受到損害，因此異常的細胞不受控制並過度增殖從而穿透至周圍的組織和器官， 形成塊狀物並破壞正常的組織。由於癌症的快速生長、滲透性的(穿透性的或擴散的)生長、擴散(從其發生區域移動很遠)等原因，源於人體內各種組織的癌症會給人的生命帶來危險。在癌症當中，已知肝癌是世界上最致命的癌症之一。尤其是，據報導稱，在亞洲和次撒哈拉的非洲區，每年至少約有50萬人死於肝癌。肝癌主要分為起源於肝細胞自身的肝細胞癌和癌症由其他組織擴散至肝臟的轉移性肝癌。大約至少90%的肝癌為肝細胞癌，通常理解術語肝癌是指肝細胞癌。據報導大多數肝癌的起因是受到B型肝炎病毒或C型肝炎病毒的急性或慢性感染。然而，有關肝癌發生和發展的細胞內的分子機制還沒有被闡明。根據傳統研究，據報導稱在諸如各種生長因子基因等原癌基因由於各種原因突變成癌基因而過度表達或過度激活的情況下，或者在諸如Rb蛋白或p53蛋白之類的腫瘤抑制基因由於各種原因突變而低表達或喪失功能的情況下，可以引起包括肝癌在內的多種癌症的發生和發展。尤其是，關於肝癌，已經證實例如經修飾的ρ53、β-連環蛋白(beta-catenin)、AXINI、p21(WAFl/CIPl)和 p27Kip等基因為與其相關。但是，近來認識到，包括肝癌在內的大多數癌症的發生和發展並不由於單獨的特定基因，而是由於與細胞周期、信號傳遞等有關的多種基因的複雜相互作用。因而，有必要從只集中在個別的基因或蛋白的表達或功能中脫離出來，而進行對各種基因或蛋白的整體研究。肝癌的預後是指預見患有肝癌的患者的各種情況，例如從肝癌中全面康復的可能性，經治療後復發的可能性，肝癌診斷後患者生存的可能性等等。這可以根據疾病的嚴重性、診斷時間、治療進展等各種情況而變化。只有根據其預後適當地應用各種治療方法時， 肝癌才能夠得到有效的治療。例如，對於被評估為有良好的預後的患者，有必要避免可能對患者引起嚴重副作用的危險的治療方法，例如激進的化療或手術、放療等，而選擇那些相對溫和、保守和安全的治療方法。另一方面，對於被評估為有較差的預後的患者，應當積極地進行化療或手術，例如放療等治療方法以力圖增加生存期或生存率。根據迄今為止進行的研究，已經發展的肝癌的預後非常糟糕，顯示了自診斷起6 個月內死亡的高致死率，剩餘僅四個月的平均壽命長度。但是，大小小於3釐米的肝癌有良好的預後，且已知無需任何特別治療，一年的生存率為90%，且手術後5年的生存率為約 40 50%。然而，根據現有技術很難精確地評估肝癌患者的預後。為了精確評估預後，需要一種把患者劃分為各風險組群的分析方法。然而，迄今為止，僅僅依靠在診斷和初次手術治療時的臨床病理肝癌階段來確定預後，而沒有一種用於精確評估肝癌的方法。但是，不幸的是，僅僅通過肝癌階段無法精確確定每一位肝癌患者的預後。CBS蛋白(胱硫醚β -合酶)是一種將同型半胱氨酸轉變成胱硫醚的酶，已知其在轉硫(transsulfuration)通路中起作用，並在體內蛋氨酸代謝中發揮重要作用[J Biol Chem. 1994 May 20 ；269 (20) :14835-40]。NNMT蛋白(煙醯胺N甲基轉移酶)是一種進行煙醯胺和吡啶的N-甲基化的酶，已知其與各種藥物和異生物的代謝有關[Genomics. 1998 Sep 15 ；52 (3) :312-24]。TKT蛋白(轉酮醇酶)是一種在非氧化的磷酸戊糖途徑中發揮核心作用的酶，作為該族的成員，已知有TKTLl (轉酮醇樣酶1)、TKTL2 (轉酮醇樣酶2) [J Biol Chem. 1993 Jan 15 ；268 (2) :1397-404]。AIFMl蛋白(線粒體相關的凋亡誘導因子1)是也稱為AIF的黃素蛋白。已知若發生細胞凋亡，則該蛋白移動至細胞核，引起染色體的聚集和斷裂，並誘導來自線粒體的細胞色素 c 和半胱天冬酶 9 的分泌[Nature. 1999 Feb 4 ；397 (6718) :441-6]。AKT蛋白是與AKT2、AKT3有關的蛋白，並且已知其在通過磷脂醯肌醇3激酶生長因子信號傳遞(即，血小板源生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素和胰島素樣生長因子I (IGF-I)等的信號傳遞)中起作用，當其被激活時，已知能夠磷酸化凋亡相關蛋白並使它們失活[Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Jul ；84 (14) :5034-7]。ATG3蛋白(自噬相關3同源物)參與了諸如GATE_16、GABARAP、MAP_LC3等人ATG8 同源物與脂類之間的結合。有報導稱缺乏ATG3的小鼠不形成自噬小體，並在出生後一天內死亡[J Biol Chem. 2002 Apr 19 ；277 (16) 13739-44. Epub 2002 Feb 1]。ATG5蛋白(自噬相關5同源物)與自噬作用有關。ATG5已知能夠通過ATG7和 ATGlO的作用形成ATG12-ATG5綴合物，並且該ATG12-ATG5綴合物移動到自噬小體膜處以在ATG8和磷脂醯乙醇胺的結合中起作用。有報導稱缺乏ATG5的小鼠不形成自噬小體，並在出生後立即死亡，且截斷的ATG5能夠誘導細胞色素c的分泌和激活線粒體內的半胱天冬酶9[Nature 432 1032-1036(2004)] ATG7蛋白(自噬相關7同源物)與自噬作用有關。有報導稱ATG7與ATGlO — 起形成ATG12-ATG5綴合物，而ATG7與ATG3 —起參與ATG8和磷脂醯乙醇胺的結合。缺乏 ATG7的小鼠不形成自噬小體，並在出生後立即死亡[J Biol Chem. 2001 Jan 19 ；276 (3) 1701-6. Epub 2000 Nov 28]。ATG12蛋白(自噬相關12同源物)與自噬作用有關。已知ATG12通過ATG7和 ATGlO的作用形成ATG12-ATG5綴合物，並且該ATG12-ATG5綴合物移動到自噬小體膜處以在 ATG8 和磷脂醯乙醇胺的結合中起作用[J Biol Chem. 1998 Dec 18 ；273 (51) :33889-92]。BAX蛋白(BCL2相關X蛋白)BCL2蛋白族的一員，已知其通過與BCL2的結合促進細胞凋亡，並且與線粒體膜電位的損失和細胞色素c的分泌有關[Cell. 1993 Aug 27 ；74(4) 609-19]。BCL2蛋白(B細胞淋巴瘤蛋白2)是一種線粒體的膜蛋白，能夠抑制細胞凋亡。已知其抑制細胞色素c從線粒體的分泌，激活半胱天冬酶並通過與凋亡激活因子的結合抑制細胞凋亡[Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jul ；83 (14) :5214-8]。BCL2L1蛋白(Bcl_2樣1蛋白)是BCL2蛋白組的一員，已知其位於線粒體的外膜並與線粒體膜通道的分配有關。它以兩種亞型存在。較長形式的BCL-XL已知能夠抑制細胞凋亡，而較短形式的BCL-XS能夠促進細胞凋亡[Cell. 1993 Aug 27 ；74(4) :597-608]。BNIP3蛋白(BCL2/腺病毒ElB 19kD_相互作用蛋白3)能夠與ElB 19kDa蛋白和BCL2結合，且已知可以誘導細胞凋亡和自噬作用[J Exp Med. 1997 Dec 15 ；186(12) 1975-83]。CASP8蛋白(半胱天冬酶8，凋亡相關的半胱天冬酶)是屬於半胱天冬酶家族的酶，它是通過FAS在細胞凋亡機制初始階段起作用的酶。如果其通過與FADD的結合和蛋白水解性切割而激活，它激活各種其他的半胱天冬酶[Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Dec 10 ；93 (25) :14486-91 ；Biochem J. 1997 Aug 15 ；326 (Pt 1) :1_16]。CSElL蛋白(CSE1染色體分離1樣)已知在將importin-α再次從細胞核發送至細胞質中起作用，並與細胞凋亡或細胞增殖有關[Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Oct 24 ； 92(22) :10427-31]。DIABLO蛋白(具有低等電點的直接的IAP結合蛋白)是一種位於線粒體內的蛋白，且如果發生細胞凋亡，則它移動至細胞質與IAP(凋亡抑制物蛋白)結合以幫助半胱天冬酶的激活[Cell. 2000 Jul 7 ；102(1) :43-53]。DRAM蛋白(損傷調節自噬調控蛋白)是一種溶酶體的膜蛋白，已知其與p53腫瘤抑制子控制的自噬作用有關並且在P53控制的細胞凋亡中是必須的[Cell. 2006 Jul 14； 126(1) :121-34]。E2F1蛋白(E2F轉錄因子1)是E2F家族轉錄因子的一員，已知其與細胞周期和腫瘤抑制子的控制密切相關，並且通過與Rb蛋白的結合促進細胞生長或誘導與p53相關的細胞凋亡 Wene. 1996 Sep 16 ； 173 (2) :163-9]。FAS蛋白(AP0-1，CD95，TNFRSF6)是TNF受體家族的一員。已知其接受FAS配體的信號並與FADD(Fas相關死亡結構域蛋白)、半胱天冬酶8以及半胱天冬酶10 —起組成DISC (死亡誘導信號複合物)來誘導細胞凋亡[J Biol Chem. 1992 May 25 ；267 (15) 10709-15]。FRAPl蛋白(哺乳動物雷帕黴素靶蛋白)也稱為mTOR。已知其調節諸如細胞內 DNA損傷、營養耗盡等與壓力有關的反應，且包含FRAPl的T0RC2複合物已知是細胞周期阻滯和FKBP12-雷帕黴素複合物的抑制免疫作用的靶點[Nature. 1994 Jun 30 ；369 (6483) 756-8]。LAMPl蛋白(溶酶體相關膜蛋白1)也稱為⑶107a抗原。它是一種膜糖蛋白，且似乎與癌細胞的擴散有關[J Biol Chem. 1990 May 5 ；265 (13) =7548-51] LC3蛋白(MAPI輕鏈3樣蛋白1)是微管結合蛋白，它與微管與細胞骨架間的相互作用有關。LC3蛋白是酵母ATG8的同源物，已知其能夠通過多種自噬蛋白的作用與磷脂醯乙醇胺結合併組成自噬小體[J Biol Chem. 1994 Apr 15 ；269 (15) :11492-7]。PRKAAl蛋白(AMP激活的蛋白激酶，催化性，α-1)是AMPK的催化亞基。該AMPK 是起到檢測細胞內能量水平的作用的蛋白。已知它在當ΑΜΡ/ΑΤΡ比例增高時激活以限制各種生物合成反應[FEBS Lett. 1994 Dec 12 ；356(1) :117-21]。PTEN蛋白(磷酸酶和張力蛋白同源物)已知是一種腫瘤抑制子，在多種類型的癌症中失活。它既是一種蛋白磷酸酶同時也是一種磷脂醯肌醇-3，4，5-三磷酸3磷酸酶，已知其能夠破壞 Pi:3K-AKT/PKB 信號傳遞[Nat Genet. 1997 Apr ； 15 (4) :356-62]。ULKl蛋白(Unc-51樣激酶1)是一種與軸突生長有關的絲氨酸/蘇氨酸激酶，也稱為ATGl同源物。對於自噬作用而言，已知其能夠被mTOR磷酸化[Genomics. 1998 Jul 1 ； 51 (1) :76-85]。XIAP蛋白(X連鎖凋亡蛋白抑制子)是IAP家族的一員，且在IAP中，它有強的細胞凋亡抑制效果。已知其通過與腫瘤壞死因子受體關聯因子TRAF1、TRAF2的結合抑制細胞凋亡並抑制半胱天冬酶的活性[Nature. 1996 Jan 25 ；379 (6563) :349-53]。但是，還不清楚這些蛋白表達水平和表達模式在肝臟組織中如何具體變化，以及如何使用這些蛋白評估肝癌預後。而且，迄今為止還沒有使用蛋白或編碼蛋白的基因作為用於肝癌預後標記物的實例。

發明內容
技術課題本發明的一個目的是提供一種有關肝癌預後的生物標記物，以容易且精確地評估肝癌患者的預後，和還提供一個開發用於肝癌的治療劑的重要的起點。因而，本發明提供了一種肝癌預後標記物；一種用於評估肝癌預後的組合物，該組合物包含能夠檢測所述肝癌預後標記物的表達水平的變化的物質；一種用於評估肝癌預後的試劑盒，所述試劑盒包含所述用於評估肝癌預後的組合物；一種使用所述肝癌預後標記物進行肝癌預後評估的方法；以及一種使用所述肝癌預後標記物來篩選肝癌的治療劑的方法。技術方案本發明比較取自多位診斷為患有肝癌的患者的肝癌組織中的基因表達程度，並根據每位患者的進展檢測特異性大量或小量表達的基因，從而發現能夠用於評估肝癌預後的肝癌預後標記物。本發明的第一個方面涉及肝癌預後標記物，所述肝癌預後標記物包含選自由下列基因組成的組中的一個或至少兩個基因的組合CBS (胱硫醚 β -合酶；NCBI GI :209862802 ；SEQ ID NO 79)；NNMT (煙醯胺 N-甲基轉移酶；NCBI GI :62953139 ；SEQ ID NO 80)；TKT(轉酮醇酶；NCBI GI :205277461 ；SEQ ID NO 81)；AIFMl (線粒體相關的凋亡誘導因子 1 ；NCBI GI =22202627 ；SEQ ID NO 82)；AKTKRAC-α 絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶；NCBI GI :62241010 ；SEQ ID NO 83)；ATG3(自噬相關蛋白 3 ；NCBI GI :34147490 ；SEQ ID NO 84)；ATG5(自噬相關蛋白 5 ；NCBI GI :92859692 ；SEQ ID NO 85)；ATG7(自噬相關蛋白 7 ；NCBI GI :222144225 ；SEQ ID NO 86)；ATG12(自噬相關蛋白 12 ；NCBI GI :38261968 ；SEQ ID NO 87)；BAX (凋亡調節因子 BAX ；NCBI GI :34335114 ；SEQ ID NO 88)；BCL2(凋亡調節因子 Bcl-2 ；NCBI GI :72198188 ；SEQ ID NO 89)；
BCL2L1 (凋亡調節因子 Bcl-X ；NCBI GI :20336333 ；SEQ ID NO 90)；BNIP3(BCL2/腺病毒 ElB 19kD 相互作用蛋白 3 ;NCBI GI :7669480 ；SEQ ID NO: 91)；CASP8(半胱天冬酶 8 ；NCBI GI :122056470 ；SEQ ID NO 92)；CSElL (Exportin-2 ；NCBI GI :29029558 ；SEQ ID NO 93)；DIABLO (Diablo 同源物，線粒體；NCBI GI :218505810 ；SEQ ID NO 94)；DRAM (損傷調節自噬調控蛋白；NCBI GI :110825977 ；SEQ ID NO 95)；E2F1 (轉錄因子 E2F1 ；NCBI GI :168480109 ；SEQ ID NO 96)；FAS(腫瘤壞死因子受體超家族成員 6 ；NCBI GI =23510419 ；SEQ ID NO 97)；FRAPl (FKBP12-雷怕黴素複合物相關蛋白；NCBI GI :206725550 ；SEQ ID NO 98)；LAMPl (溶酶體相關膜糖蛋白 1 ；NCBI GI :112380627 ；SEQ ID NO 99)；LC3[MAP1LC3A](微管結合蛋白 1A/1B 輕鏈 3A ;NCBI GI :31563519 ；SEQ ID NO: 100)；PRKAAl (5 『 -AMP激活的蛋白激酶催化亞基 α -1 ；NCBI GI :94557300 ；SEQ ID NO 101)；PTEN (磷脂醯肌醇-3，4，5-三磷酸3磷酸酶和雙特異性的蛋白磷酸酶PTEN ；NCBI GI :110224474 ； SEQ ID NO :102)；ULKl (絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶 ULKl ；NCBI GI :225637564 ；SEQ ID NO :103)；和XIAP (含杆狀病毒 IAP 重複序列的蛋白 4 ；NCBI GI :32528298 ；SEQ ID NO :104)。肝癌的預後可以從多個方面來評估。然而，典型地從復發的可能性、生存的可能性以及無病生存的可能性等方面來確定。本說明書中所描述的研究通過下述方式進行從多位肝癌患者的肝癌組織中獲取基因表達譜，總體考慮復發的可能性、生存的可能性以及無病生存的可能性等方面以通過進行統計數據處理過程來檢測在表達水平顯著差異的基因， 並發現能夠評估肝癌預後的標記物。在本說明書中，「肝癌預後標記物」是指一種基因標記物，它是用於評估肝癌發生後患者具有好的或差的預後的標準。本發明中，在有著良好的預後的患者的肝癌組織內該標記物的表達水平與通過實驗預先確定的標準水平相比顯著的高或低。尤其是，在本發明中，該標記物具有顯著低的P值，該值是基於有著良好的預後和較差的預後的患者的肝癌組織中的表達差異計算的。優選，P值小於0.05。對於多位已知患有肝癌的患者的肝癌組織，本發明通過將有著良好的或較差的治療進展的患者的肝癌組織的基因表達譜與標準水平比較而進行分析。因此，如此確定的標記物能夠特異性區別有著良好的肝癌預後或較差的肝癌預後的患者，因而其能夠有效地用於肝癌預後的評估。而且，考慮到如此確定的標記物在有著特定預後的患者中的肝癌組織中特異性大量表達或小量表達，該標記物的生理學功能有可能直接涉及有關肝癌的發生和進展的生理學功能，尤其是肝癌的預後。因此，該標記物能夠有效地用做肝癌的發生和進展的研究中的靶標或用於肝癌的治療劑的開發。特別地，在本發明的第一個方面中的肝癌預後標記物是基於空前的多位患者的肝癌組織的統計分析而發現的。因而，與基於僅僅一些患者的肝癌組織的基因表達譜而發現的關於肝癌的常規標記物相比，所述標記物有著較大的顯著性，具有較高的臨床利用價值，且具有用於評估肝癌預後的更精確的評估力。本發明的第二個方面涉及用於評估肝癌預後的組合物，所述組合物包含有能夠特異性檢測第一方面中所述的肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的物質。這裡，可以通過確定由相應基因轉錄產生的mRNA的水平或模式的一般生化分析方法來檢測每種肝癌預後標記物的表達水平或表達模式。像這樣的用於確定mRNA的水平或模式的分析方法有RT-PCR、競爭性RT-PCR、實時RT-PCR、RNA酶保護實驗、Northern印記、 DNA微陣列等等。此外，可以使用在相關領域中通常使用的方法。通過上述的分析方法，能夠將肝癌患者的生物學樣本中的mRNA的水平或模式與標準水平進行比較，並從中檢測本發明的肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的差異。這使得能夠評估肝癌患者的預後。在本說明書中，「生物學樣本」是指能夠檢測到所述肝癌預後標記物的表達水平或表達模式，或者由所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式的分離自人體內細胞、組織等等。其可以例如是尿、血液、血漿、血清等，但不具體僅限於這些。用於通過RT-PCR測定mRNA的水平或模式的試劑盒包含有本發明的所述肝癌預後標記物的mRNA的特異引物。在本說明書中，「引物」是指能夠互補地與模板結合併使逆轉錄酶或DNA聚合酶能夠啟動模板複製的具有自由3』羥基的核酸序列。引物是具有與特定基因核酸序列互補的序列的核苷酸，可以使用長度約7bp 50bp、優選約IObp 30bp的引物。其他的RT-PCR試劑盒根據具體的實施方式可以包括試管或其他適合的容器、反應緩衝液、脫氧核苷酸(dNTP)、酶如Taq聚合酶和逆轉錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑、DEPC-水、無菌水等。在合適的緩衝溶液中和溫度下，引物能夠在聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉錄酶) 和四種不同的三磷酸核苷以及溫度存在的情況下啟動DNA的合成。所述引物可以包含不改變在DNA合成起始點起作用的引物的基本性質的其他鹼基序列。可以使用公知的方法化學合成引物，且可以使用相關領域中公知的多種方法來將核酸序列轉化。本發明的第二個方面中的「能夠特異性檢測肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的物質」可以是在相應的肝癌預後標記物的表達水平或表達模式的分析方法中特異性用於相應標記物的任何物質，或者是所述物質中至少兩種的組合，並不限於用於RT-PCR 的引物。本發明的第二個方面的技術特性在於將被試肝癌患者的肝癌組織中的所述肝癌預後標記物的表達水平或表達模式與標準水平比較，並檢測差異。因而，任何能夠檢測這樣差異的物質可以被用作「能夠特異性檢測肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的物質」，並實現本發明的目標技術效果。而且，本領域的普通技術人員根據具體的實施方式參照相關領域的公知常識能夠選擇並使用合適的物質。本發明的第三個方面涉及到用於評估肝癌預後的組合物，所述組合物包含有能夠特異性檢測第一方面中的所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質。關於本發明的所述肝癌預後標記物的表達水平或表達模式，除了本發明的第二個方面中的檢測根據每一種標記物的mRNA的水平或模式的方法之外，還可以使用用於檢測樣本中每一種標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式以估計每一種標記物的表達水平或表達模式的方法。本發明中所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式的特異性檢測是指確定生物學樣本中存在多少本發明中所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白和其以何種模式存在的方法。例如，與所述肝癌預後標記物編碼的蛋白特異結合的抗體能夠用於確定存在水平或存在模式的過程。本說明書中，「抗體」是指能夠與抗原的表位特異結合的蛋白，它是一個包含有多克隆抗體、單克隆抗體以及重組抗體的概念。對於使用抗體測定蛋白的存在水平或存在模式的方法，有蛋白質印跡、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、放射免疫測定、放射免疫擴散、Ouchterlony免疫擴散、火箭免疫電泳 (rocket Immunoelectrophoresis)、組織免疫染色、免疫沉澱測定、補體結合試驗、FACS(螢光活化細胞分類)、蛋白晶片等。但是，除上述以外，可以使用在相關領域中普遍採用的任何方法。通過上述的分析方法，可以將被試肝癌患者的生物學樣本中的抗原抗體複合物的形成水平或形成模式與標準水平比較，且能夠從中確定本發明的所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式，並最終能夠評估肝癌患者的預後。這裡，「抗原抗體複合物」是指所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白和它的特異抗體的複合物。一般通過檢測與二抗偶聯的檢測標記信號的大小和模式來測定抗原抗體複合物的形成水平或形成模式。這樣的檢測標記例如可以是酶、螢光物質、配體、發光物質、納米粒子、氧化還原分子、放射性同位素等等，但並不限於這些。當使用酶作為檢測標記時，作為能夠使用的酶有β-葡糖醛酸糖苷酶(β-gluculonidase)、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、過氧化物酶或鹼性磷酸酶、乙醯膽鹼酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP 酶、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶、螢光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶、內醯胺酶等等，但所述酶並不限於這些。當使用螢光物質作為檢測標記時，作為能夠使用的螢光物質有螢光素(fluorescein)、異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅素、藻青素、別藻藍素、鄰苯二甲醛、螢光胺等，但所述螢光物質並不限於這些。當使用配體作為檢測標記時，作為能夠使用的配體有生物素衍生物等等，但所述配體並不限於這些。當使用發光物質作為檢測標記時，作為能夠使用的發光物質有吖啶酯、發光素 (Iuciferin)、發光素酶(luciferase)等，但所述發光物質並不限於這些。當使用納米粒子作為檢測標記時，作為能夠使用的納米粒子有膠體金、著色膠乳(tinted latex)等等，但所述納米粒子並不限於這些。當使用氧化還原分子作為檢測標記時，作為能夠使用的氧化還原分子有二茂鐵、釕絡合物、紫羅鹼(viologen)、醌、Ti離子、Cs離子、二醯亞胺、1，4_苯醌、 氫醌、K4W(CN)8、
2+、[RU (bpy) 3] 2+、[MO (CN) 8] 4-等，但所述氧化還原分子並不限於這些。當使用放射性同位素作為檢測標記時，作為能夠使用的放射性同位素有3H、14C、 32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、1251、1311 or 186Re 等等，但所述放射性同位素並不限於這些。在本發明的第三個方面中，「能夠特異性檢測所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質」可以是在檢測所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質的分析方法中特異性用於所述標記物所編碼蛋白的任何物質，並不一定限於抗體。本發明的第三個方面的技術特徵在於將取自肝癌患者的生物樣品中的所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式與基準比較，並檢測差異。 因而，任何的物質均可以被用作「能夠特異性檢測肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質」並能實現本發明旨在達到的技術效果，只要該物質能夠檢測到這樣差異即可。本領域的普通技術人員基於本領域的一般常識和已知技術，根據具體實施方式
能夠容易選擇/揀選合適的物質。本發明的第四個方面涉及預測肝癌預後的試劑盒，所述試劑盒包含有本發明第二或第三方面所述的用於預測肝癌預後的組合物。除了包含在用於評估肝癌預後的組合物中的能夠特異性檢測肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的物質，或能夠特異性檢測肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質，本發明中用於評估肝癌預後的試劑盒還可以包括適用於分析基因的表達水平或表達方式的方法或分析蛋白的存在水平或存在模式的方法的一種或多種其他成份、溶液或裝置。例如，對於檢測基因的表達水平或表達模式的診斷試劑盒，該診斷試劑盒可以包括進行RT-PCR所需的基本成份，除了標記物基因的mRNA各自特異性的引物外，該RT-PCR試劑盒根據具體的實施方式可以包括例如試管或其他適合的容器、反應緩衝液、脫氧核苷酸(dNTPs)、酶例如Taq聚合酶和逆轉錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑、DEPC-水 (DEPC水)、無菌水、用作定量的對照組的基因特異性引物對等。同時，在診斷試劑盒用於檢測蛋白的存在水平或存在模式的情況下，該診斷試劑盒可以包括例如進行ELISA所需的基本成份。該ELISA試劑盒可以包括能夠檢測結合抗體的組分，例如，標記的二抗、生色團、酶 (例如與抗體連接的酶)及其底物，和對定量對照組蛋白特異的抗體。進一步地，根據具體的實施方式，該診斷試劑盒可以包括DNA微陣列或蛋白微陣列。本發明的第五個方面涉及一種用於肝癌預後評估的方法，該方法包括步驟1，使用第二方面的用於評估肝癌預後的組合物對取自被試肝癌患者的生物學樣本進行處理；和步驟2，通過將步驟1的處理結果與基準進行比較，檢測權利要求1中的肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的差異。此外，發明的第五個方面涉及一種用於肝癌預後評估的方法，該方法包括步驟1，使用第三方面的用於評估肝癌預後的組合物處理取自肝癌患者的生物學樣本；和步驟2，通過將步驟1的處理結果與基準進行比較，檢測權利要求1中的肝癌預後標記物所編碼的蛋白在存在水平和/或存在模式的差異。例如，對在肝癌預後良好的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預後標記物進行表達水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物的表達水平高於基準， 可以得知肝癌的預後相對較好。同時，例如對在肝癌預後差的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預後標記物進行表達水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物的表達水平高於基準，可以得知肝癌的預後相對較差。同時，例如，對在肝癌預後良好的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預後標記物所編碼的蛋白進行存在水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物所編碼的蛋白的存在水平高於基準，可以得知肝癌的預後相對較好。同時，例如在對肝癌預後較差的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預後標記物所編碼的蛋白進行存在水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物所編碼的蛋白的存在水平高於基準， 可以得知肝癌的預後相對較差。本發明的第六個方面涉及使用本發明的第一個方面的肝癌預後標記物來篩選肝癌治療劑的方法。由於本發明的第一個方面的肝癌預後標記物根據肝癌患者的預後而顯示出表達模式的顯著差異，它可以是直接參與和肝癌的發生或發展特別是預後有關的生理學功能的基因。因此，該標記物所編碼的蛋白能夠有效地用做研究肝癌的發生或發展機制或發明肝癌治療劑的目標蛋白。即，本發明第一個方面所述肝癌預後標記物符合開發肝癌的治療劑的重要前提，並因此該使用該標記物來篩選肝癌治療劑的方法也涵蓋在本發明的保護範圍內。作為本發明的第六個方面的一個實例，提供了篩選肝癌的治療劑的方法，所述方法包括檢測測試化合物是否能促進或抑制本發明的第一個方面的肝癌預後標記物的表達的步驟。作為篩選治療劑的方法，可以使用例如RT-PCR、競爭性RT-PCR、實時RT-PCR、RNA酶保護實驗、northern印記、DNA微陣列、SAGE [基因表達系列分析；Velculescu等，Science 270 :484-7]、MPSS[大規模平行標記測序；Brenner 等，PNAS. USA. 97，1665-1670]等。除了以上方法外，如有必要可以使用本領域的各種已知方法。同時，作為本發明的第六個方面的另一個實例，提供了篩選肝癌的治療劑的方法，所述方法包括步驟1，將測試化合物與本發明的第一個方面的肝癌預後標記物所編碼的蛋白結合；和步驟2，檢測該測試化合物能否促進或抑制所述蛋白的生理學活性。作為篩選治療劑的方法，例如，可以使用將本發明的第一個方面的用於肝癌早期診斷的蛋白標記物固定到親和柱上並將其與樣本接觸來純化樣品的方法[Pandya等，Virus Res 87 135-143，2002]，使用酵母雙雜交系統、蛋白質印跡的方法，高通量篩選的方法[Aviezer 等，J Biomol Screen 6 :171-7,2001]等。除了以上方法外，如有必要可以使用本領域的各種已知方法。在本發明的第六個方面中，作為用於篩選的測試化合物，可以使用例如組織提取物、基因文庫的表達產物、合成化合物、合成多肽、天然化合物等，但是用於篩選的測試化合物並不限於這些。本發明第七個方面涉及特異性識別由本發明第一個方面的肝癌預後標記物編碼的蛋白的抗體。特異性識別本發明的第一個方面的肝癌預後標記物的抗體是特異性檢測肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式的代表性物質，因而能夠有效地用於評估肝癌預後。此外，根據情況，所述抗體可以特異性促進或抑制在肝癌的發生或發展中起重要作用的蛋白的活性，因而能夠用作用於肝癌的治療劑。由於已經找到本發明的第一個方面的肝癌預後標記物，通過使用本領域廣泛知曉的技術能夠容易地進行所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的多克隆抗體、單克隆抗體以及重組抗體的製備。通過本領域廣泛知曉的將本發明的第一個方面的肝癌預後標記物所編碼的蛋白注射進動物體內，並從動物身上採血以獲得包含抗體的血清的方法，能夠製備多克隆抗體。 這些多克隆抗體能夠從各種動物宿主中製備，例如山羊、兔、綿羊、猴、馬、豬、牛、狗等，且製備方法是本領域公知的。單克隆抗體可以通過使用雜交瘤方法[Kohler和Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6 :511-519]或噬菌體抗體文庫技術[Clackson 等，Nature, 352 624-628，1991 ；Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :58，1-597，1991]等本領域廣泛知曉的方法來製備。通常，雜交瘤方法使用從免疫學上適合的宿主動物例如小鼠獲得的細胞和作為另一群體的癌症或骨髓瘤細胞系，所述動物已注入本發明的第一個方面的肝癌預後標記物所編碼的蛋白抗原。從兩個群體中所獲得的組織通過如聚乙二醇等本領域廣泛知曉的方法來融合，然後以標準組織培養方法來使抗體生成細胞增殖。根據有限稀釋技術通過亞克隆獲得同質細胞群後，按照已知技術在體內或體外大量地培養能夠產生所需抗體的雜交瘤。噬菌體抗體文庫方法是這樣一種製備單克隆抗體的方法獲得所需抗體的基因，在噬菌體表面上以融合蛋白的形式表達該基因，從而在體外產生抗體文庫，並從該文庫中分離單克隆抗體。通過以上方法製備的單克隆抗體可以通過使用例如凝膠電泳、透析、鹽沉澱、離子交換層析、親和層析等已知方法來分離。本發明第七個方面的抗體除了包含兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈的完美形狀之外，還包含抗體分子的功能片段。所述抗體分子的功能片段是指具有抗原結合功能的片段， 包括 Fab、F(ab' )、F(ab' ) 2、Fv 等等。發明效果根據本發明，提供了一種肝癌預後標記物；一種用於評估肝癌預後的組合物，該組合物包含能夠檢測到所述肝癌預後標記物的表達水平的變化的物質；一種用於評估肝癌預後的試劑盒，所述試劑盒包含所述用於評估肝癌預後的組合物；一種使用所述肝癌預後標記物進行肝癌預後評估的方法；以及一種使用所述肝癌預後標記物篩選肝癌治療劑的方法。所述肝癌預後標記物能夠有效地用於肝癌患者中的簡單且正確的預後評估。此外，所述標記物的生理學功能可直接與肝癌的發生或發展有關。因而，該標記物能夠有效用於肝癌的發生或發展機制的研究，或用作開發肝癌治療劑的靶標。上述肝癌預後標記物是那些更顯著的、臨床高度有用的、且能夠更準確地預測肝癌預後評估的標記物，這是因為它們是通過對取自空前的多位患者的肝癌組織進行統計學分析而發現的。


圖1至圖10是通過測定所述肝癌預後標記物在復發、總生存和無病生存方面示出的 Kaplan-Meier 曲線。
具體實施例方式下面會通過實施方式詳細闡述本發明；然而，描述所述實施方式僅僅是為了幫助理解本發明，而不是以任何方式限制本發明的範圍。實施例實施例1 :RNA的提取和cDNA的合成獲得取自120位已診斷為肝癌已經發生並且肝癌的發展已經得到確認的肝癌患者的肝癌組織和相鄰的正常組織。根據下面的方法提取各份組織的RNA並進行cDNA的合成。根據產品說明書，使用RNeasy Minikit Oliagen，德國)從肝癌組織和相鄰的正常組織中提取總RNA。使用Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies，美國)對獲得的 RNA提取物中的總RNA稱量。在提取的步驟中進行DNase I的處理以從RNA提取物中除去汙染的基因組DNA。含有4yg總RNA的樣品與2μ1的ΙμΜ的d(T)18引物(Genotech， Korea)在70°C溫育7分鐘並在冰上冷卻5分鐘。單獨製備酶混合物[通過添加2 μ 1 0. IM的 DTT (Duchefa，Netherlands)、2 μ 1 的 IOX 逆轉錄緩衝液、5 μ 1 2mM 的 dNTP、l μ 1 200U/ μ 1的MMLV逆轉錄酶和1 μ 1的40U/ μ 1 RNA酶抑制劑(Enzynomics，Korea)至總體積為 11 μ 1]。將該酶混合物添加至含有RNA的樣品中後，將其在42°C溫育90分鐘，然後在80°C 溫育10分鐘來使逆轉錄酶失活。通過添加焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水使上述樣品的終體積為400 μ 1。實施例2 定量實時RCR根據產品手冊，使用PRISM 7900ΗΤ (Applied Biosystems，美國)對實施例1中獲得的每一個cDNA樣品的下面兩個基因標記物實施定量實時RCR擴增CBS(胱硫醚 β-合酶；NCBI GI :209862802 ； SEQ ID NO 79)；禾口NNMT (煙醯胺 N-甲基轉移酶；NCBI GI :62953139 ；SEQ ID NO 80)。所述定量實時RCR分析在10μ 1的總體積中進行，所述總體積包括5μ 1的 ZXiTaqman 基因表達主引物(master mix) (Applied Biosystems，USA)、5 μ M 正向和反向引物各1μ 1、1μ 1的ΙμΜ探針(Genotech，Korea)和2 μ 1的cDNA (在對照組中為等量的水)。 擴增以下述循環進行95°C解離10分鐘的步驟，然後是95°C解離15秒的步驟，和60°C合成 1分鐘的步驟。引物和探針序列使用Primer Express 3. 0 (Applied Biosystems，美國)設計，且所有探針序列在5'端標有FAM，3'端標有TAMRA。下面表1中的下列引物和探針是用於每種標記物的。表權利要求
1.一種肝癌預後標記物，所述標記物包括選自由下列基因組成的組的一個基因或至少兩個基因的組合CBS (胱硫醚 β -合酶；NCBI GI :209862802 ；SEQ ID NO 79)；NNMT (煙醯胺 N-甲基轉移酶；NCBI GI :62953139 ；SEQ ID NO 80)；TKT (轉酮醇酶；NCBI GI :205277461 ；SEQ ID NO 81)；AIFMl (凋亡誘導因子 1，線粒體；NCBI GI :22202627 ；SEQ ID NO 82)；AKTKRAC-α 絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶；NCBI GI =62241010 ；SEQ ID NO 83)；ATG3(自噬相關蛋白 3 ；NCBI GI :34147490 ；SEQ ID NO 84)；ATG5(自噬相關蛋白 5 ；NCBI GI :92859692 ；SEQ ID NO 85)；ATG7(自噬相關蛋白 7 ；NCBI GI :222144225 ；SEQ ID NO 86)；ATG12(自噬相關蛋白 12 ；NCBI GI :38261968 ；SEQ ID NO 87)；BAX(凋亡調節因子 BAX ;NCBI GI :34335114 ；SEQ ID NO 88)；BCL2(凋亡調節因子 Bcl-2 ；NCBI GI :72198188 ；SEQ ID NO 89)；BCL2L1(凋亡調節因子 Bcl-X ；NCBI GI :20336333 ；SEQ ID NO 90)；BNIP3(BCL2/腺病毒 ElB 19kDa 蛋白-相互作用蛋白 3 ;NCBI GI :7669480 ；SEQ ID NO:91)；CASP8(半胱天冬酶 8 ；NCBI GI :122056470 ；SEQ ID NO 92)； CSElL(Exportin-2 ；NCBI GI:29029558 ；SEQ ID NO 93)； DIABLO (Diablo 同源物，線粒體；NCBI GI :218505810 ；SEQ ID NO 94)； DRAM (損傷調節自噬調控蛋白；NCBI GI :110825977 ；SEQ ID NO 95)； E2F1 (轉錄因子 E2F1 ；NCBI GI :168480109 ；SEQ ID NO 96)； FAS(腫瘤壞死因子受體超家族成員6 ；NCBI GI =23510419 ；SEQ ID NO 97)； FRAPl (FKBP12-雷怕黴素複合物相關蛋白；NCBI GI :206725550 ；SEQ ID NO 98)； LAMPl (溶酶體相關膜糖蛋白 1 ；NCBI GI :112380627 ；SEQ ID NO 99)； LC3 [MAP1LC3A](微管結合蛋白 1A/1B 輕鏈 3A ；NCBI GI :31563519 ；SEQ ID NO :100)； PRKAAl (5 『 -AMP 激活的蛋白激酶催化亞基 α-1 ;NCBI GI :94557300 ；SEQ ID NO: 101)；PTEN (磷脂醯肌醇-3，4，5-三磷酸3-磷酸酶和雙特異性的蛋白磷酸酶PTEN ;NCBI GI 110224474 ； SEQ ID NO :102)；ULKl (絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶 ULKl ；NCBI GI =225637564 ；SEQ ID NO :103)；和 XIAP (含杆狀病毒 IAP 重複序列的蛋白 4 ；NCBI GI :32528298 ；SEQ ID NO :104)。
2.一種用於評估肝癌預後的組合物，所述組合物包含用於特異性檢測權利要求1所述的肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的物質。
3.一種用於評估肝癌預後的組合物，所述組合物包含用於特異性檢測權利要求1所述的肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質。
4.如權利要求2所述的用於評估肝癌預後的組合物，其中，所述用於特異性檢測所述肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的物質是檢測所述預後標記物的mRNA的 RT-PCR所用的引物。
5.如權利要求3所述的用於評估肝癌預後的組合物，其中，所述用於特異性檢測所述肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質是特異性識別所述蛋白的抗體。
6.一種用於評估肝癌預後的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求2和5中任一項所述的用於評估肝癌預後的組合物。
7.一種評估肝癌預後的方法，所述方法包括步驟1，用權利要求2或4所述的用於評估肝癌預後的組合物處理取自被試肝癌患者的生物學樣本；和步驟2，通過將步驟1的處理結果與基準比較從而檢測權利要求1所述的肝癌預後標記物的表達水平和/或表達模式的差異。
8.一種評估肝癌預後的方法，所述方法包括步驟1，用權利要求3或5所述的用於評估肝癌預後的組合物處理取自肝癌患者的生物學樣本；和步驟2，通過將步驟1的處理結果與基準比較從而檢測權利要求1所述的肝癌預後標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的差異。
9.一種篩選肝癌治療劑的方法，所述方法包括檢測測試化合物是否促進或抑制權利要求1所述的肝癌預後標記物的表達的步驟。
10.一種篩選肝癌治療劑的方法，所述方法包括步驟1，將測試化合物與權利要求1所述的肝癌預後標記物所編碼的蛋白結合；和步驟2，檢測所述測試化合物是否促進或抑制所述蛋白的生理學活性。
11.一種特異性識別權利要求1所述的肝癌預後標記物所編碼的蛋白的抗體。
全文摘要
本發明涉及肝癌預後標記物；用於評估肝癌預後的組合物，該組合物包含能夠檢測到所述肝癌預後標記物的表達水平的變化的物質；用於評估肝癌預後的試劑盒，所述試劑盒包含所述用於評估肝癌預後的組合物；使用所述肝癌預後標記物進行肝癌預後評估的方法；和使用肝癌預後標記物篩選肝癌治療劑的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102428184SQ201080021390
公開日2012年4月25日 申請日期2010年4月16日 優先權日2009年4月17日
發明者樸真永, 洪錫珠, 金種旻 申請人:Cbs 生物科學有限公司, 沈瑛澤