誘導植物中基因表達的方法及用其處理的植物的製作方法

2023-12-09 09:19:56 3

專利名稱：誘導植物中基因表達的方法及用其處理的植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用基因重組方法產生轉基因植物的過程中向植物提供基因表達誘導系統的技術。
背景技術：
為了提供具有新特性的植物，而將基因轉移到植物中稱為轉化。當轉移的基因在植物細胞中表達時，就表現出所提供的性狀。一旦基因整合到細胞內染色體中，就將穩定地維持所提供的特性。由這種基因轉移所新提供的特性包括如對疾病和農藥的抗性及代謝的改變。用於這種轉化的基因可採用現有基因重組方法自由地構建。已開發了一些方法用於將這種方式構建的基因轉移入植物中。對將基因有效整合入植物細胞核染色體而言，可以用土壤桿菌感染方法，其中用作基因運載體(載體)的土壤桿菌是一種感染植物的細菌。
基因的表達包括稱為轉錄的步驟(其中mRNA被轉錄到稱為DNA的模板上，DNA是含有遺傳信息的基因)和稱為翻譯的步驟(其中根據從轉錄mRNA得到的遺傳信息合成蛋白質)。已知基因包含有參與轉錄調節或控制的區域以及編碼蛋白質信息的區域。最基本的轉錄調節區域是5』上遊區域(與編碼區域相關)，稱為啟動子。真核生物(如植物)和原核生物(如細菌)之間的啟動子在結構上不同。植物啟動子含有稱為TATA盒的核苷酸序列(對啟動基因轉錄是必不可少的)和其它各種調節序列。為引發轉錄，RNA聚合酶(催化在植物細胞中轉錄的酶)結合於此TATA盒。各種稱為轉錄因子的細胞內蛋白質能特異性地結合於各種調節序列(作為轉錄因子的靶)。這些轉錄因子引發或抑制RNA聚合酶的轉錄活性從而控制基因的表達。因此，基因表達受這些調節序列的控制。這些調節序列和轉錄因子也通過轉錄步驟參與基因表達的誘導。
控制對轉移入植物中的基因的表達誘導來控制轉化的時間和部位是可能的，這對植物產生例如代謝物有很大益處，否則對植物生長是不利的。為了此目的，已嘗試了使用其它生物的基因表達誘導系統。這是因為用植物固有的基因表達誘導系統可能對植物代謝系統有不能預計的影響。然而，其它生物的基因表達誘導系統是否能成功地用於植物需要進行證明。
調節系統包括誘導物、阻遏子和操縱子，如在細菌操縱子調節系統中所見的那樣，它們是主要基因表達誘導系統之一。誘導物是一種低分子量化合物可誘導基因表達。阻遏子是此誘導物的受體蛋白質。操縱子是一種作為阻遏子靶子的調節序列。誘導物-阻遏子結合和阻遏子-操縱子結合是高度特異性的，表現出高水平的親和力，而結合了誘導物的阻遏子不能結合操縱子。當誘導物濃度低時，啟動子中含有的操縱子基因(稱為受操縱子控制的基因)被抑制(OFF)而不能表達，因為阻遏子已結合於操縱子，但隨著誘導物濃度的增加，阻遏子被釋放而引起基因表達(ON)。
還報導了用細菌誘導物/阻遏子/操縱子系統作為在植物中誘導基因表達的手段的嘗試。為了提供具有阻遏子和操縱子性狀的植物，可將兩種基因即稱為阻遏子基因和受操縱子控制的基因轉移到植物中。為了在植物細胞中獲得這兩種基因的表達，理想地啟動子是植物啟動子。操縱子位於植物啟動子中或附近。通過對啟動子的選擇，可以將啟動子的各種特性功能性地組合，如將基因表達強度和組織特異性與基因表達的誘導性相結合。通過以這種方式將誘導物給予轉化的植物，受操縱子控制的基因的表達在給予誘導物的部位被誘導。將誘導物/阻遏子/操縱子調節系統給予植物的成功例子是有報導在該系統中使用四環素和IPTG作為誘導物[日本公開出版物Hei-06-339384和Gatz等人，Trends inPlant Science(1998)，3，352-358]。然而從可行性觀點看迄今報導的實施例中所使用的誘導物存在問題，如環境安全性和/或使用成本。
發明概述從本領域的上述發展狀況來看，本發明的目的是提供在植物中誘導基因表達的方法，從而控制轉移入轉化植物中的基因表達誘導的時間和部位。
本發明是一種在植物中誘導基因表達的方法，包括向植物提供阻遏子和啟動子性狀，這兩者構建了基因表達誘導系統，並將放線菌自調節因子作為基因轉移的誘導物，給予轉化的植物放線菌自調節因子，從而誘導受操縱子控制的基因在給予放線菌自調節因子部位的表達。
現詳細描述本發明。
發明詳述放線菌(Actinomycete)在土壤中的最高密度僅次於真桿菌，且產生許多生理活性物質，如抗菌素等。本文這裡提到的放線菌可以是例如鏈黴菌(Streptomyce)、小單孢子菌(Micromonospora)、馬杜拉放線菌(Actinomadura)、孢囊鏈黴菌(Streptosporangium)、遊動放線菌(Actinoplane)、諾卡氏菌(Nocardia)和糖單孢菌(Saccharopolyspora)。放線菌的生理活性物質產生和形態分化受內源微生物激素類物質(稱為自調節因子)的控制。
至今，已知三种放線菌自調節因子，稱為灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)的A因子、維吉尼亞鏈黴菌(Streptomyces virgriniae)的維吉尼亞丁內酯(VB)和淡紫灰鏈黴菌(Streptomyces lavendulae)菌株FRI-5的誘導物-2[Nihira，HakkoKogaku Kaishi(1991)，第69卷，89-105]。
A因子誘導抗菌素鏈黴素的產生和生產菌中的鏈黴素抗性，還誘導形成分生孢子和氣生菌絲。VB誘導生產菌同時產生兩種抗菌素維吉黴素維吉黴素M和維吉黴素S。誘導物-2誘導生產菌中抗菌素產生的變化(從D-環絲氨酸類型轉化成核苷酸類型的抗菌素)而且在碳源和氮源不充足的條件下還誘導產生藍色色素。
與其它生物品種中所看到的激素、信息素等一樣，鏈黴素自調節因子在低濃度時，即在培養物中只有幾nM到幾分nM時，仍顯示它們的活性。
認為約60％鏈黴菌屬中的放線菌能產生自發調節因子，而且還可能存在大量未知的自發調節因子。
眾所周知，通常放線菌自調節因子具有2-(1』-氧代或羥基烷基)-3-羥基甲基-丁內酯構架。因此，這種已知的放線菌自調節因子也稱為丁內酯自調節因子。其中在內酯環上的兩個取代彼此在立體結構上是相反的，且它們的絕對構型為2R和3R。這些因子在3方面有差異，即2、6位的烷基側鏈為羰基或羥基，和羥基的方向(α，誘導物-2類型；或β，VB類型)。
已知存在5種VB(A、B、C、D和E)，它們差異是2位的烷基側鏈。人工合成的衍生物也顯示出活性。2位上的側鏈結構影響到活性的強度。
放線菌自調節因子在結構上相對簡單，因此它們的化學合成是容易的。也可以大量無菌培養各因子的生產菌，並從培養物分離和純化各因子。
已確定各生產菌中存在A因子、VB和誘導物-2的各自受體蛋白質，並將它們分別稱為ArpA[Onaka等人，J.Bacteriol.(1995)，177，6083-6092]、BarA[Okamoto等人，J.Biol.Chem.(1995)，270，12319-12326]和FarA[Waki等人，J.Bacteriol.(1997)，179，5131-5137]。它們分別由276、232和221個胺基酸構成。在各受體蛋白質中，發現在N端有一表明DNA結合能力的螺旋-轉角-螺旋基序。
例如，分別用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2顯示BarA的胺基酸序列和編碼其的核苷酸序列。
放線菌自調節因子和其受體蛋白質之間的特異性結合親和力非常高，它們的解離常數(Kd值)，例如A因子/ArpA為0.7nM；VB-C7/BarA為1.1nM[Nihira，Hakko Kogaku Kaishi(1991)，第69卷，89-105]。
例如，已弄清楚存在著稱為barB和barX的基因，看來它們是在一基因表達誘導系統的控制下，此系統在其3』下遊和5』上遊共同具有編碼VB的受體蛋白質BarA的barA基因。雖然這些基因編碼的蛋白質的功能還不清楚，但估計它們參與維吉黴素的生物合成或生產菌的維吉黴素抗性或其調節系統。
如體內試驗結果[Kinoshita等人，J.Bacteriol.(1997)，179，6986-6993]所顯示，BarA是結合於barA和barB基因啟動子的一種阻遏子並關閉這些基因的轉錄，還顯示VB是導致BarA與啟動子分離的誘導物，從而啟動這些基因的轉錄。另外如體外試驗結果[Kinoshita等人，J.Bacteriol.(1999)，181，5075-5080]所示，在barA和barB基因上都鑑定到BarA特異性結合的靶序列(操縱子)，稱其為BARE。它包括barA基因啟動子上的BARE-3(26bp)、barB基因啟動子上的BARE-1(29bp)和BARE-2(28bp)。例如SEQ ID NO3顯示了BARE-3的核苷酸序列。
由此看出放線菌自調節因子參與生產菌的基因表達誘導系統。這種基因表達誘導系統包括誘導物、阻遏子和操縱子。放線菌自調節因子、放線菌自調節因子的受體蛋白質、和此受體蛋白質的靶序列功能分別作為誘導物、阻遏子和操縱子。
本發明通過基因轉移提供了一種植物，其特徵是具有構成基因表達誘導系統的阻遏子和操縱子，還含有放線菌自調節因子作為誘導物。用於實施本發明的植物包括菸草、玉米、大豆、油菜、馬鈴薯、棉花等。
提供具有本文所述的阻遏子性狀的植物的方法是將阻遏子基因轉移到植物中來轉化該植物。提供具有操縱子性狀的植物的方法是將受操縱子控制的基因轉移到植物中來轉化該植物。
換言之，根據本發明，將兩個基因一為放線菌自調節因子的受體蛋白基因，另一為在該受體蛋白的靶序列控制下的基因，轉移入植物對其進行轉化。
為了將放線菌自調節因子受體蛋白(阻遏子)的基因轉移入要轉化的植物，可將此受體蛋白基因的編碼區域連接於該植物啟動子功能區的3』下遊位點，並將其摻入合適的質粒載體中。本文所用的啟動子優選植物啟動子。
例如，用花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(已知其在各種植物品種中表現出強啟動子活性)能有效地在植物中導致強組成型基因表達。其它植物啟動子包括(但不限制於)土壤桿菌衍生的冠癭胺基酸(胭脂氨酸、章魚氨酸、甘露氨酸)合成酶基因啟動子。也可使用普通的植物啟動子。
例如為了用土壤桿菌感染方法轉移到植物中，將所需的基因摻入稱為雙載體的質粒載體中。這種雙載體具有在大腸桿菌和土壤桿菌中起作用的複製系統、選擇性標記基因，另外還有稱為RB和LB的25bp核苷酸序列(它們是將基因整合入植物細胞核染色體所必需的)。當轉移入植物細胞時，插在雙載體RB和LB之間的基因即有效地整合入核染色體中。
例如，通過轉變pBI121的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因的編碼區域[Jefferson等人，EMBO J.(1987)，6，3901-3907]，可以構建用於將放線菌自調節因子VB的受體蛋白質(阻遏子)BarA的基因，轉移入植物對其進行轉化的雙載體，該雙載體具有一種結構可使GUS基因的編碼區域連接於CaMV35S啟動子的3』下遊，或將類似的雙載體連接於barA基因的編碼區域。例如，當製備barA基因編碼區域片斷(在兩端都有限制酶BamHI和SacI的識別位點)時，通過限制酶BamHI和SacI識別位點的輔助，可以將雙載體pBI121的GUS基因編碼區域轉變為barA基因編碼區域。例如，通過用化學合成的寡-DNA分別具有如下SEQ IDNO8和SEQ ID NO9所示的核苷酸序列作為5』-和3』-PCR引物和質粒pET-p26k[Okamoto等人，J.Biol.Chem.(1995)，270，12319-12326]，含有SEQ ID NO1所示的barA基因作為模板，進行PCR可以得到分別在兩端含有限制酶BamHI和SacI識別位點的barA基因編碼區域片斷。
為了將受放線菌自調節因子受體蛋白的靶序列(操縱子)控制的基因轉移入植物對其進行轉化，可將該靶序列安置在植物發揮作用的啟動子中，將所需任意基因的編碼區域連接於如此修飾的啟動子的3』下遊，並將產生的此結構摻入合適的質粒載體中。本文所用的啟動子優選植物啟動子。
將靶序列(操縱子)較佳地安置在啟動子TATA盒的3』下遊或5』上遊位點附近，且重複性安置處理靶序列應有效。
例如，可以通過將BARE序列安置在雙載體pBI121等的CaMV35S啟動子中，構建用於將在VB受體蛋白質BarA的靶序列(操縱子)BARE控制下的GUS基因轉移入植物對其進行轉化的雙載體。GUS基因所編碼的酶可不難通過其活性來檢測，且GUS基因在植物中沒有類似物，因此該基因可廣泛地用作在植物細胞中試驗性檢測基因表達活性的報導基因。例如當啟動子在待安置的靶序列(操縱子)之間含有合適的限制酶識別位點時，可以通過合成在限制酶識別位點之間含有該核苷酸序列的雙鏈DNA片斷，未實現啟動子中靶序列的安置。也可通過化學合成寡-DNA的定點誘變技術進行安置。例如為了在CaMV35S啟動子TATA盒的3』下遊附近或5』上遊附近安置BARE-3(如SEQ ID NO3所示)，可以合成含有SEQ ID NO4或5分別所示的核苷酸序列的雙鏈DNA片斷。例如為了在CaMV35S啟動子TATA盒的3』下遊附近和5』上遊附近安置BARE-3，可以合成含有SEQ ID NO6所示的核苷酸序列的雙鏈DNA片斷。例如為了在CaMV35S啟動子TATA盒的3』下遊附近或5』上遊附近重複安置BARE-3，可以合成含有SEQ ID NO7所示的核苷酸序列的雙鏈DNA片斷。例如為了合成含有SEQ ID NO7所示的核苷酸序列的雙鏈DNA片斷，其中在CaMV 35S啟動子的TATA盒的3』下遊附近安置有2個BARE-3序列和該盒的5』上遊附近安置有一個BARE-3序列，在試管中將化學合成的含有SEQ IDNO10和SEQ ID NO11所示核苷酸序列的寡-DNA(它們的3』端彼此互補超過16bp)混合，並使互補末端退火。在其中加入DNA聚合酶，用限制酶EcoRV和XbaI處理合成的雙鏈DNA片斷，然後克隆入合適的質粒載體中。
根據本發明，將上述方法所構建的質粒載體轉移入待轉化的植物中。
用土壤桿菌感染方法將基因轉移入植物中，例如，首先通過用上述方法構建的雙載體的轉移，轉化根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或髮根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。對這種轉化而言，電穿孔法等方法有效。其中要求所用的土壤桿菌品種具有將雙載體的RB和LB之間的夾層區域整合入植物細胞核染色體中所需的功能。利用雙載體中的選擇性標記基因的功能不難選擇出轉化體土壤桿菌。用如此得到的轉化體土壤桿菌(其中轉入了含有所需基因的雙載體)感染植物。為了此目的，用轉化體土壤桿菌培養植物組織切片。然後誘導組織切片產生胼胝體。此時除選擇性標記試劑外，同時存在殺死土壤桿菌的抗菌素(如羧苄青黴素)。可用作選擇性標記基因的基因是賦予對抗菌素(如卡那黴素、潮黴素、博來黴素和氯黴素)抗性的基因。因此將得到的轉化體胼胝體置於再生培養基上使植物再生得到轉化體植物。也可從轉化體植物的種子獲得轉化體植物品系。
也可用相同的方法得到培養的植物細胞轉化體。但此時無需採取胼胝體形成、植物體再生或種子形成等步驟。
除土壤桿菌感染方法外，其它將基因轉移入植物的方法也是可利用的，如將基因轉移到原生質體中的電穿孔方法，採用基因槍的粒子轟擊方法，和包括用毛細管直接將基因注射到細胞中的顯微注射方法等。在實施本發明的基因表達誘導方法中，可以採用任何基因送遞方法。
如此得到的轉化體植物中，分別採用PCR和Western試驗不難證實基因已整合入核染色體中和產生了基因產物。
通過轉移放線菌自調節因子受體蛋白(阻遏子)的基因或在受體蛋白的靶序列(操縱子)控制下的基因，可以得到各個轉化體植物，也可以用連續轉化程序中選擇性標記基因不同的質粒載體方法，或通過利用含本文兩種基因的質粒載體方法，得到含有兩種本文所述轉移基因的轉化體植物。
根據本發明，將放線菌自調節因子給予如此轉化的植物，從而誘導受操縱子控制的基因在給予放線菌自調節因子部位的表達。
例如，通過向菸草植物和培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的靶序列之一)性狀，它們與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為基因轉移的誘導物)組成了基因表達誘導系統；和將VB給予如此轉化的菸草植株和培養的菸草細胞；可能在給予VB的部位誘導受BARE-3控制的基因的表達。例如，可以低達100nM濃度的VB，令人滿意地誘導受BARE-3控制的基因的表達。
由於其相對低的分子量(約200)和它們的疏水結構，放線菌自調節因子易穿過細胞膜。所以它們非常適合用作誘導物被迅速吸收到植物中。
放線菌自調節因子對植物沒有毒性。例如，VB顯示即使在高達10μM的濃度對植物也沒有毒性。
根據本發明，有可能產生有用的轉化體植物，並且通過對置於操縱子控制下的基因的選擇，可有效地利用此轉化體植物。例如，將能對植物提供繁殖能力的基因置於操縱子的控制下，通過將放線菌自調節因子給予該植物，可以控制所述轉化體植物的繁殖力。這種植物可以用作轉化的宿主，從而防止轉化體植物擴散到自然環境。
附圖簡述

圖1顯示了Western印跡試驗分析的結果，表明在培養的實施例3轉化的(提供了作為基因轉移誘導物的含放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB，構成基因表達誘導系統的阻遏子BarA(VB的受體蛋白)特性)菸草細胞中，是否堆積了BarA蛋白質。
(符號說明)M分子量標記R10ng用重組大腸桿菌菌株產生並純化的BarA蛋白質30、21、27得到的培養的菸草細胞轉化體克隆的身份編號B培養的菸草細胞BY2T得到的暫時轉化培養的菸草細胞原生質體(實施例5)箭頭表明BarA蛋白質條帶的位置圖2顯示了當將VB給予培養的菸草細胞轉化體時，實施例4通過給予含放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為基因轉移的誘導物)構成基因表達誘導系統的阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BRAE-3(BarA的一種靶序列)，而轉化培養的菸草細胞中，是否誘導了受BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
(符號說明)GUS特異性活性(圖表的縱軸)用於評估GUS基因表達的活性(單位[nmol4MU/分鐘/mg蛋白質])30-16、30-17、30-23、30-35、21-5、21-21、21-22、27-1、27-9表明得到的培養的菸草細胞轉化體克隆的身份編號OFF(VB-)未加入VBON(VB+)加入VB(最終VB-C6濃度為1μM)圖3顯示了試驗1的結果，即當將VB給予培養的菸草細胞時，實施例5通過給予含放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為基因轉移的誘導物)構成基因表達誘導系統的阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BRAE-3(BarA的一種靶序列)，而轉化培養的菸草細胞中，是否誘導了受BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
(符號說明)誘導速率(圖表的縱軸)當添加VB(最終VB-C6濃度1μM，ON)與未添加VB(OFF)相比時，因VB引起的基因表達誘導活性。以GUS基因表達活性的比例表示(GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))。
35S當採用不受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時35SD當用質粒pCaM35SD-gus作為受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時35SUDD當用質粒pCaM35SUDD-gus作為受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時barA-當barA基因不用作瞬時轉化時barA+當barA基因用於瞬時轉化時圖4顯示了試驗2的結果，即當將VB給予培養的菸草細胞時，實施例6通過給予含放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為基因轉移的誘導物)構成基因表達誘導系統的阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BRAE-3(BarA的一種靶序列)，而轉化培養的菸草細胞中，是否誘導了受BARE-3控制下的GUS報導基因的表達。
(符號說明)誘導速率(圖表的縱軸)當添加VB(最終VB-C6濃度1μM，ON)與未添加VB(OFF)相比時，因VB引起的基因表達誘導活性，以GUS基因表達活性的比例表示(GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))35S當採用不受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時35SU當採用質粒pCaM35SU-gus作為受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時35SD當採用質粒pCaM35SD-gus作為受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時35SUD當採用質粒pCaM35SUD-gus作為受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時35SUDD當用質粒pCaM35SUDD-gus作為受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時圖5顯示了測試的結果，即當將VB給予培養的菸草細胞時，實施例7通過給予含放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為基因轉化的誘導物)構成基因表達誘導系統的阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BRAE-3(BarA的一種靶序列)，而轉化培養的菸草細胞中，是否誘導了受BARE-3控制下的GUS報導基因的表達。
(符號說明)誘導速率(圖表的縱軸)當添加VB(最終VB-C6濃度1μM，ON)與未添加VB(OFF)相比時，因VB引起的基因表達誘導活性，以GUS基因表達活性的比例表示(GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))35SD當用質粒pCaM35SD-gus作為受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時0nM未加入VB(OFF)10nM加入VB(ON，VB-C6終濃度為10nM)100nM加入VB(ON，VB-C6終濃度為100nM)1000nM加入VB(ON，VB-C6終濃度為1000nM＝1μM)圖6顯示了測試的結果，即當將VB給予培養的菸草細胞時，實施例10通過給予含放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為基因轉化的誘導物)構成基因表達誘導系統的阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BRAE-3(BarA的一種靶序列)，而轉化培養的菸草細胞中，是否誘導了受BARE-3控制下的GUS報導基因的表達。
(符號說明)OFF(VB-)未加入VBON(VB+)加入VB(VB-C6終濃度為1μM)本發明最佳實施方式以下實施例進一步詳細說明了本發明。但這些實施例對本發明的範圍沒有任何限制。
實施例1通過基因轉移構建了一質粒載體，向某植物提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)與放線菌維吉尼亞鏈黴菌的自調節因子維吉尼亞丁內酯(VB)(作為誘導物)構成的基因表達誘導系統，即將阻遏子barA基因轉移入該植物對其進行轉化。
為此，用PCR從含有SEQ ID NO1所示的barA基因的質粒pET-p26k[Okamoto等人，J.Biol.Chem.(1995)，270，12319-12326]克隆了barA基因編碼區域。將化學合成的含有其中導入了限制酶BamHI和SacI識別位點的SEQ IDNO8和SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的寡-DAN，分別作為PCR的5』-和3』-引物。用限制酶BamHI和SacI處理PCR擴增的片斷，然後插入到質粒載體pBuluescriptII SK(-)[GenBank登錄號X52330]中，在多克隆區域中限制酶BamHI識別位點和SacI識別位點之間克隆。通過測序證實正確克隆了barA基因編碼區域。
將雙載體pBI121[Jefferson等人，EMBO J.(1987)，6，3901-3907]，含有β-葡糖醛酸酶(GUS)基因編碼區域連接於花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子3』下遊位點的一個結構且含有作為選擇性標記基因的卡那黴素抗性基因的結構，用限制酶BamHI和SacI處理來除去含有GUS基因編碼區的限制酶BamHI-SacI片斷。將殘留的載體片斷與含有barA基因編碼區域的限制酶BamHI-SacI片斷(用限制酶BamHI和SacI處理從質粒pbarA切下的)連接(雙載體pBICaMV35S-barA)。
還構建了將阻遏子barA基因轉移入植物對其進行瞬時轉化的質粒載體。所用的起始物是質粒NtADHp-GUS[Nagaya等人，J.Biosci.Bioeng.(2000)，89，231-235]，其具有的結構使GUS基因編碼區域連接於菸草酒精脫氫酶(NtADH)啟動子的3』下遊位點。已知該質粒的NtADH啟動子在菸草中表現出極強的啟動子活性。
用限制酶BamHI和SacI處理除去了質粒NtADHp-GUS中的含有GUS基因編碼區域的限制酶BamHI-SacI片斷。將殘留的載體片斷連接於含有barA基因編碼區域的限制酶BamHI-SacI片斷，此片斷是用限制酶BamHI和SacI處理從質粒pbarA切下的(質粒pNtADH-barA)。
用限制酶BamHI和SacI處理從質粒NtADHp-GUS中除去含有GUS基因編碼區域的限制酶BamHI-SacI片斷。將殘留的載體片斷做成鈍端，然後連接(質粒pNtADHΔBS)。
將大腸桿菌DH5α菌株[supE44，ΔlacU169(φ80，lacZΔM15)、hsdR17、recA1、ednA1、gyrA96、thi-1、relA1]用作重組DNA實驗的宿主。實驗程序應遵照標準程序[Molecular Cloning，Maniatis等人，1982，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.]。
將KOD NDA聚合酶[Toyobo Co.，Ltd]用於PCR，所用的條件見相關手冊所述。
用測序儀[P.E.Biosystems Japan Co.，Ltd.ABI PRISM310 Genetic Analyzer]進行測序。
實施例2通過基因轉移構建了一質粒載體，向某植物提供操縱子BARE-3(VB的受體蛋白BarA的一個靶序列)與放線菌維吉尼亞鏈黴菌的自調節因子維吉尼亞丁內酯(VB)(作為誘導物)構成的基因表達誘導系統，即將受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因轉移入該植物對其進行轉化。
在CaMV 35S啟動子TATA盒的3』下遊附近安置2個BARE-3序列，和在5』上遊位點附近安置1個BARE-3序列。
為此，合成了含有SEQ ID NO7所示核苷酸序列的雙鏈DNA片斷，即從含有CaMV 35S啟動子的TATA盒(5』-TATATAA-3』)的限制酶EcoRV-XbaI片斷(871bp CaMV 35S啟動子的第726核苷酸到第871核苷酸的片斷)衍生此片斷，方法是用BARE-3(26bp，如SEQ ID NO3所示)取代TATA盒5』上遊第2核苷酸到第27核苷酸的26bp和TATA盒3』下遊第2核苷酸到第27核苷酸間的26bp，並將BARE-3(26bp)插在TATA盒3』下遊第27核苷酸和28核苷酸之間。將10μl TE溶液與兩種化學合成的分別含有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11所示的核苷酸序列且彼此在3』末端互補超過16bp的寡-DAN(各100皮摩爾)混合，並將此混合物在95℃保持3分鐘，然後冷卻至室溫。在2μl上述反應混合物中加入大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片斷，總體積達到40μl，將如此得到的反應混合物在37℃保持30分鐘，然後用苯酚/氯仿處理使酶失活，將反應混合物的乙醇沉澱溶解於5μl TE溶液中。用限制酶EcoRV和XbaI處理2μl該溶液，將如此得到的限制酶EcoRV-XbaI片斷插入到質粒載體pBluescriptII SK(-)中，從而在多個克隆區域(質粒pBARE3UDD)中的限制酶EcoRV識別位點和XbaI識別位點之間克隆。通過測序證明BARE-3的正確位置。
為了構建在TATA盒的3』下遊附近有2個BARE-3序列且在5』上遊位點附近有1個BARE-3序列結構的CaMV 35S啟動子，用限制酶HindIII和EcoRV處理質粒pBI221[Jefferson等人，EMBO J(1987)，6，3901-3907]，其結構為GUS基因編碼區域連接於CaMV 35S啟動子的3』下遊位點，然後將如此切下的含有CaMV 35S啟動子第1核苷酸到第761核苷酸的片斷插入到質粒pBARE3UDD的限制酶HindIII識別位點和EcoRV識別位點之間(質粒pCaMV35SUDD)。
通過用限制酶HindIII和XbaI處理，從含有CaMV 35S啟動子的限制酶HindIII-XbaI片斷衍生雙載體pBI101HmB[Nakayama等人，Plant Physiol.(200)，122，1239-1247]，它的結構為GUS基因編碼區域連接於CaMV 35S啟動子的3』下遊且還含有作為選擇性標記基因的潮黴素抗性基因。將殘留的載體片斷與含有CaMV 35S啟動子的限制酶HindIII-XbaI片斷連接，後者的結構為用限制酶HindIII和XbaI處理從質粒pCaMV35SUDD切下後在TATA盒的3』下遊位點附近有2個BARE-3序列，在5』上遊位點附近有一個BARE-3序列(雙載體pBICaMV35SUDD-gus)。
還構建了用於將受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因轉移入植物中來瞬時轉化該植物的質粒載體。
將2個BARE-3序列安置在CaMV 35S啟動子TATA盒的3』下遊位點附近，1個BARE-3序列安置在其5』上遊位點的附近。
用限制酶HindIII和XbaI處理質粒pBI221除去含有CaMV 35S啟動子的限制酶HindIII-XbaI片斷。將殘留的載體片斷連接於含有CaMV 35S啟動子的限制酶HindIII-XbaI片斷，其結構為用限制酶HindIII和XbaI處理從質粒pCaM35SUDD切下後在TATA盒的3』下遊位點附近有2個BARE-3序列，在5』上遊位點附近有1個BARE-3序列[質粒pCaMV35SUDD-gus]。
還用相同的方式構建了質粒載體，含有結構為SEQ ID NO4所示的CaMV35S啟動子和在TAT盒的3』下遊位點附近有1個BARE-3序列(結構如SEQ IDNO5所示)和在TATA盒的5』上遊位點附近有1個BARE-3序列(結構如SEQ IDNO6所示)和在TATA盒的3』下遊位點附近和5』上遊位點附近各含有1個BARE-3序列(分別為質粒pCaMV35SD-gus、pCaMV35SU-gus和pCaMV35SUD-gus)。
實施例3通過基因轉移向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)性狀，該阻遏子與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了一基因表達誘導系統。換而言之，將阻遏子barA基因轉移入培養的菸草細胞對其進行轉化。
採用了土壤桿菌感染方法作基因轉移。首先通過barA基因轉移來轉化土壤桿菌，然後用得到的轉化體土壤桿菌感染培養的菸草細胞。
為了將基因轉移入土壤桿菌中，使用了電穿孔方法。將根癌土壤桿菌EHA101菌株[Elizanbeth等人，J.Bacteriol.(1986)，168，1291-1301]的感受態細胞(50μl)與200ng barA基因(實施例1，雙載體pBICaMV35S-barA]混合，然後將此混合物轉移到基因脈衝儀[Nippon Bio-Rad Laboratories]的小杯中[電極到電極距離2mm]。用2.5KV電壓、25μFD靜電容量和400Ω電阻在小杯電極間產生脈衝。脈衝產生的時間常數約為10毫秒。在含有100mg/l卡那黴素的LB培養基瓊脂平板上塗布脈衝後小杯中的所有內容物，並將此平板靜置在30℃的暗處。兩天後，30℃暗處，用5ml含有100mg/l卡那黴素的LB培養基振蕩培養該平板上出現的菌落2天。將此培養物用作轉化體土壤桿菌培養物。
然後用得到的轉化體土壤桿菌感染培養的菸草BY2細胞(RIKEN GeneBank Plant Cell Bank RPC號1)[Nagata等人，Methods Enzymol.(1987)，148，34-39]。以1/50的稀釋率、以1周間隔振蕩培養方式，用改良的LS培養基[Nagata等人，Methods Enzymol.(1987)，148，34-39]在27℃暗處傳代培養培養的菸草BY2細胞，將處於對數生長期(最後一次傳代後3-5天)的細胞用於土壤桿菌感染。將5ml含有菸草BY2細胞的培養物與100μl轉化體土壤桿菌培養物混合，將此混合物轉移到培養皿上，將此培養皿靜置在25℃暗處。2天後，離心除去培養皿上的土壤桿菌，將殘留的菸草BY2細胞懸浮於2-3ml改良的LB培養液中，將此懸浮液塗布在含有100mg/l卡那黴素和250mg/l羧苄青黴素的改良LS培養基-凝膠(gellan)樹膠平板上，讓此平板靜置在25℃暗處。2-3周後，分離得到平板上形成的胼胝體，並作為培養的菸草細胞轉化體克隆在存在卡那黴素和羧苄青黴素下傳代培養。
用Western印跡方法分析如此得到的培養的菸草細胞轉化體中是否積聚了阻遏子BarA蛋白。
將培養的菸草細胞轉化體克隆的細胞懸浮於合適的細胞抽提緩衝液(如0.1M KPO4、2mM EDTA、5％甘油、2mM DTT，pH7.8)中，用超聲波發生器[KKTomy Seiko’s Handy Sonic UR-20P]裂解。高速離心含有破裂細胞的液體，將得到的上清液用作細胞提取物。用Bradford方法[Bradford，Anal.Biochem.(1976)，72，248-254]測定細胞提取物中蛋白質的濃度(mg/ml)。從SDS-PAGE(12.5％聚丙烯醯胺)凝膠中分離出相當於每個泳道20μg蛋白質的細胞提取物，然後轉移到PVDF膜[Nippon Bio-Rad Laboratories]上，與抗體反應。將兔抗BarA抗體[Nakano等人，J.Bacteriol.(1998)，180，3317-3322]用作第一抗體，將鹼性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG抗體作為第二抗體。各反應和洗滌程序都在3％脫脂乳中進行的。最後，將膜浸泡在鹼性磷酸酶反應混合物(0.017％5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸對-甲苯胺鹽、1ppm硝基籃四唑、100mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mMMgCl2、pH9.5)中，檢測膜上顯色的條帶。用大腸桿菌轉化體產生的BarA蛋白質(10ng)並經純化作為對照樣品。
結果，在一些培養的菸草細胞轉化體克隆中證受有BarA蛋白質的積聚。
實施例4通過基因轉移向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一個靶序列)性狀，這兩者與與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了一基因表達誘導系統。換而言之，將兩種基因，阻遏子barA基因和受操縱子BARE-2控制的GUS報導基因，轉移入培養的菸草細胞對其進行轉化。
進一步將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，雙載體pBICaMV35SUDD-gus)轉移入兩個表現為BarA蛋白質積聚水平較高的克隆中(圖1所示的No.30和No.21)和一個表現為BarA蛋白質只有小量積聚的克隆中(圖1所示的No.27)，這是通過對barA基因(實施例1，雙載體pBICaMV35S-barA)轉移入培養的菸草BY2細胞得到的培養的菸草細胞轉化體克隆進行Western分析作出的判斷。與實施例3相同，採用土壤桿菌感染方法來轉移基因。選出培養的菸草細胞轉化體克隆，並用含有20mg/l潮黴素、100mg/l卡那黴素和250mg/l羧苄青黴素的改良LS培養基傳代培養。
將誘導物VB給予如此獲得的培養的菸草細胞轉化體測定了是否誘導了受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
以1/25的稀釋率、以1周間隔振蕩培養的方式，用改良的LS培養基在27℃暗處傳代培養該菸草細胞轉化體。傳代時，加入誘導物VB，將從培養了4天的細胞製備的各細胞的提取物中的GUS基因表達活性(以單位重量蛋白質的GUS活性評估，稱為GUS的比活性)與未加入VB的相應細胞提取物比較。添加VB時，將VB-C6原液[Nihira，Hakko Kogaku Kaishi(1991)，第69卷，89-105頁](10mg/ml甲醇溶液)用水以1/50比例稀釋並將1/1000體積的稀釋液加到培養基中(VB-C6終濃度約為1μM)。離心除去上清液，收集1ml細胞懸液中的細胞，並將它們懸浮在500μl細胞提取緩衝液中(50mM NaH2PO4/Na2HPO4、10mMEDTA，10mM 2-巰基乙醇，pH7)，並用超聲波發生器[KK Tomy Seiko’s HandySonic UR-20P]裂解。高速離心含有裂解細胞的液體，將得到的上清液用作細胞提取物。用Bradford方法測定細胞提取物中蛋白質的濃度(mg/ml)。37℃在細胞提取物中加入1mM作為GUS底物的4-甲基傘形-β-D-葡糖醛酸(4MUG)後，根據單位時間酶促反應形成的螢光色素4-甲基傘形酮(4MU)的量，評估細胞提取物的GUS活性[Jefferson等人，EMBO J.(1987)，6，3901-3907]。在365nm波長激發，測定455nm波長的螢光來定量測定反應產物4MU，用標準品4MU產生的校準曲線計算GUS活性(nmol/4MU/min/ml)。將在相同實驗條件下進行的3次獨立實驗所得到的3個GUS比活性值的平均值[nmol 4MU/min/mg蛋白質]作為在上述實驗條件下GUS基因的表達活性。
結果，在許多培養的菸草細胞轉化體克隆中，加入VB-C6(ON(VB+))時的GUS基因表達活性比相同的未加VB-C6的(OFF(VB-))高，因此可以觀察到VB誘導的GUS基因表達(圖2)。將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，雙載體pBICaMV35SUDD-gus)進一步轉移入培養的菸草細胞轉化體克隆中，得到的培養的菸草細胞轉化體克隆(實施例3，圖1中的No.30和No.21)表現出相對高水平的BarA蛋白質積聚，如同將barA基因(實施例1，雙載體pBICaMV35S-barA)轉移入培養的菸草BY2細胞所得到的那樣，一些克隆[克隆No.30衍生的No.30-16、30-17、30-23、30-35和克隆No.21衍生的No.21-5、21-21和21-22]顯示添加VB-C6(ON)的GUS基因表達活性與未添加VB-C6(OFF)的比例(GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))，即用VB引起的基因表達誘導活性(誘導率)至多為30(誘導率≤30)。將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，雙載體pBICaMV35SUDD-gus)進一步轉移入培養的菸草細胞轉化體克隆中，得到的培養的菸草細胞轉化體克隆(實施例3，圖1中的No.27)表現只有少量的BarA蛋白質積聚，如同將barA基因(實施例1，雙載體pBICaMV35S-barA)轉移入培養的菸草BY2細胞所得到的那樣，一些克隆[No.27-1和27-9]顯示因VB引起的基因表達誘導活性小於2(誘導率＜2)。因此，隨著在培養的菸草細胞轉化體中積聚的BarA蛋白質量的增加，VB引起的基因表達誘導的活性也增加。
用這種方法，即通過向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一個靶序列)，它們與放線菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了基因表達誘導系統，並將VB給予如此獲得的培養的菸草細胞轉化體，可以在給予VB的部位誘導受BARE-3控制的基因的表達。
實施例5通過基因轉移向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一種靶序列)性狀，它們與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了基因表達誘導系統。換而言之，將兩種基因阻遏子barA基因和受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因，轉移入培養的菸草細胞對其進行轉化。
為了轉移基因，使用了電穿孔方法。因此，從培養的菸草細胞製備了原生質體。以1/50的稀釋比率、以1周間隔振蕩培養的方式，用改良的LS培養基在27℃暗處傳代培養此培養的菸草BY2細胞，將處於對數生長期(最後一次傳代後的3-5天)的細胞懸浮於酶溶液(0.1％果膠溶酶Y23[KK Yakult]、1％纖維素酶「Onozuka RS[Kikkoman KK]、0.4M甘露醇，pH5.5)中。讓酶促反應在30℃進行2-3小時，在此過程中以15分鐘間隔用移液管分散細胞。在顯微鏡下證明球形細胞基本上完全分散後，將這種狀態的細胞用作基因轉移的原生質體。用0.4M甘露醇洗滌這些原生質體，然後懸浮於電穿孔緩衝液(5mM 2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、70mM KCl、0.3M甘露醇)中，使細胞密度為3×106/ml。將用於監測基因轉移效率的barA基因(實施例1，質粒pNtADH-barA；50μg)、受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，質粒pCaMV35SUDD-gus或pCaMV35SD-gus；5μg)、和螢光素酶(LUC)基因(質粒pCaMV35S-luc[Millar等人，Plant Mol.Biol.Rep.(1992)，10，324-337]；1μg)與500μl此原生質體懸液混合，將此混合物轉移到基因脈衝儀[Nippon Bio-Rad Laboratories]的小杯[電極到電極距離2mm]中。用200V電壓、250μF靜電容量和400Ω電阻在小杯電極間產生脈衝。脈衝產生的時間常數約為15-20毫秒。將這些原生質體迅速地從脈衝後小杯轉移到培養皿(6cm直徑)中，加入4.5ml培養基(改良的LS培養基，10g/l蔗糖，0.4M甘露醇)。
將誘導物VB給予如此得到的瞬時轉化的培養的菸草細胞原生質體，來檢驗是否誘導了受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
將誘導物VB加到培養皿中瞬時轉化的培養的菸草細胞原生質體(VB-C6的終濃度為1μM)中，讓此培養皿靜置在25℃的暗處20小時，然後由此原生質體製備細胞提取物，將其GUS基因表達活性(以GUS活性對LUC活性的比例評估，稱為GUS/LUC值)與未添加VB的相比較。按與實施例4相同的方法進行VB的添加。從培養皿回收原生質體，離心除去上清液，懸浮於500μl細胞提取用的緩衝液(0.1M KPO4、2mM EDTA、5％甘油、2mM DTT，pH7.8)，用超聲波發生器[KK Tomy Seiko Handy Sonic UR-20]裂解細胞。高速離心含有破裂細胞的液體，將得到的上清液用作細胞提取物。用與實施例4所述相同的方法測定細胞提取物的GUS活性(nmol 4MU/min/ml)。當100μl含有470μM作為LUC底物的螢光素[Toyo Ink Manufacturing’s Pickagene]的細胞提取緩衝液與20μl細胞提取物室溫混合後，迅速用光度計[Berthold Institut(Germany)Lumat LB9501]測定10秒內發出的光量來評估細胞提取物的LUC活性。用標準品LUC繪製的校準曲線計算LUC活性(pmol LUC/ml)。將在相同實驗條件下用同一批原生質體進行的3次獨立實驗所得到的3個GUS/LUC值的平均值[nmol 4MU/min/pmolLUC]作為在上述實驗條件下GUS基因的表達活性。
結果，當將質粒pCaMV35SUDD-gus或pCaMV35SD-gus用作受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時，加有VB-C6(ON)的比未加VB-C6(OFF)的GUS基因表達活性高，因此可以觀察到GUS基因的表達受VB的誘導(圖3)。VB引起的基因表達誘導活性(誘導率GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))分別為誘導率5(圖3，barA+，35SUDD)和誘導率2(圖3，barA+，35SD)。因此，VB引起的基因表達誘導活性隨著BARE-3序列數量的增加而增加。另一方面，當barA基因不用於瞬時轉化時(不含有barA基因的對照質粒pNtADHΔBS用於瞬時轉化)(圖3，barA-)和當不受BARE-3控制的GUS報導基因(使用不含BARE-3的對照質粒pBI221)用於瞬時轉化時(圖3，35S)，都沒有觀察到由VB引起的基因表達誘導活性(誘導率1)。
用Western印跡方法(與實施例3相同)分析結果，證明在得到的瞬時轉化的培養的菸草細胞原生質體中有阻遏子BarA蛋白質積聚。
由這種方法，通過基因轉化向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一種靶序列)性狀，它們與作為誘導物的放線菌自調節因子VB構成了基因表達誘導系統，並將VB給予獲得的瞬時轉化的培養的菸草細胞，可以在給予VB的部位誘導受BARE-3控制的基因的表達。
實施例6通過基因轉移向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一個靶序列)性狀，它們與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了基因表達誘導系統。換而言之，將阻遏子barA基因轉移入培養的菸草細胞對其進行轉化，並將受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因也轉移入如此得到的培養的菸草細胞轉化體克隆中對其進行瞬時轉化。
進一步將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，質粒pBICaMV35SUDD-gus、pCaMV35SD-gus、pCaMV35SU-gus或pCaMV35SUD-gus)轉移到表現為BarA蛋白質積聚水平高的培養的菸草細胞轉化體的克隆中(實施例3，圖1所示的No.21)，這是將barA基因(實施例1，雙載體pBICaMV35S-barA)轉移入培養的菸草BY2細胞培養得到的克隆，以瞬時轉化該克隆。用與實施例5相同的方法將受BARE-3控制的GUS報導基因進行轉移。為了監測基因的轉移效果，還將LUC基因(質粒pCaMV35S-luc)用於瞬時轉化。
將誘導物VB給予如此得到的瞬時轉化的培養的菸草細胞原生質體來檢測是否誘導了受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
與實施例5相同，將誘導物VB加到(VB-C6的終濃度1μM)培養皿中的瞬時轉化的培養的菸草細胞原生質體培養物中，讓此培養物靜置在25℃暗處20小時，然後製備此原生質體的細胞提取物，將其GUS基因表達活性(以GUS活性對LUC活性的比例表達，即GUS/LUC值)與未添加VB得到的相比。
結果，當將各質粒pCaMV35SUDD-gus、pCaMV35SD-gus、pCaMV35SU-gus和pCaMV35SUS-gus用作受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時，加有VB-C6(ON)的比未加VB-C6(OFF)的GUS基因表達活性高，因此可以觀察到GUS基因表達受到VB的誘導(圖4)。VB引起的基因表達誘導活性(誘導率GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))分別為誘導率22(圖4，35SUDD)、誘導率4(圖4，35SD)、誘導率2(圖4，35SU)和誘導率13(圖4，35SUD)。因此，VB引起的基因表達誘導活性隨著BARE-3序列數量的增加而增加。將BARE-3置於TATA盒3』下遊位點附近比將其置於TATA盒的5』上遊位點附近，導致VB引起的基因表達誘導活性更高。另一方面，當GUS報導基因不受BARE-3控制(不含BARE-3的對照質粒pBI221)用於瞬時轉化時(圖4，35S)，未觀察到VB引起的基因表達的誘導活性(誘導率1)。
以這種方法，通過基因轉移向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一種靶序列)性狀，它們與作為誘導物的放線菌自調節因子VB構成了基因表達誘導系統，並將VB給予如此獲得的瞬時轉化的培養的菸草細胞，可以在給予VB的部位誘導受BARE-3控制的基因的表達。
實施例7通過基因轉化向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一個靶序列)性狀，它們與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了基因表達誘導系統，而且通過將低濃度的誘導物VB給予如此得到的瞬時轉化的培養的菸草細胞，檢測是否誘導了受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
與實施例6相同，進一步將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，質粒pCaMV35 SD-gus)轉移入表現為BarA蛋白質積聚水平高的培養的菸草細胞轉化體的克隆(實施例3，圖1所示的No.21)中，這是將barA基因(實施例1，雙載體pBICaMV35S-barA)轉移入培養的菸草BY2細胞培養得到的，以瞬時轉化該克隆。將誘導物VB加到如此得到的瞬時轉化的培養的菸草細胞原生質體培養物(VB-C6終濃度1μM，100nM和10nM)中，將由這些原生質體製備的細胞提取物靜置在25℃暗處20小時，然後將其GUS基因表達活性(以GUS活性對LUC活性的比例評價，即GUS/LUC值)與未添加VB得到的相比。
結果，當將質粒pCaMV35SD-gus用作受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時，加有VB-C6(ON)(各為1μM、100nM和10nM濃度)的比未加VB-C6(OFF)的GUS基因表達活性更高，因此可以觀察到GUS基因表達受到VB的誘導(圖5)。VB引起的基因表達誘導活性(誘導率GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))分別為誘導率5、誘導率4和誘導率1.4。因此，在VB-C6濃度不小於100nM時，可以觀察到令人滿意程度的VB引起的基因表達誘導活性，雖然它隨著VB濃度的減少而遞減。
以這種方法，通過基因轉移向培養的菸草細胞提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一種靶序列)性狀，它們與作為誘導物的放線菌自調節因子VB構成了基因表達誘導系統，並將濃度低至100nM的VB給予如此獲得的瞬時轉化的培養的菸草細胞，可以在給予VB的部位誘導受BARE-3控制的基因的表達。
實施例8通過基因轉移向菸草植株提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)性狀，該阻遏子與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了基因表達誘導系統。換而言之，將阻遏子barA基因轉移入菸草植株對其進行轉化。
採用了土壤桿菌感染方法進行基因轉移。首先通過barA基因的轉移來轉化土壤桿菌，然後用得到的轉化體土壤桿菌感染菸草植株。
通過葉片打孔法，用與實施例3所用相同的轉化體土壤桿菌感染菸草(Nicotiana tabacum L.)。從在凝膠-樹脂罐中MS培養基(Murashige等人，Physiol.Platnarum(1962)，15，473-498)上生長的無菌菸草植株的一些葉片上切下方形(5-10mm)或圓形葉子切片，浸泡在培養皿中的無菌水裡，將幾毫升轉化體土壤桿菌培養物與其混合。取出這些葉子切片，將葉面朝下置於MS胼胝體培養基(含有2mg/lα-萘乙酸和0.2mg/l 6-苄基腺嘌呤)-凝膠樹脂平板上。從該平板回收葉子切片，讓它們在生物氣候室(25℃，16小時光照，8小時黑暗)靜置2天，用無菌水衝洗幾次，並葉面朝下置於含有100mg/l卡那黴素和250mg/l羧苄青黴素的MS胼胝體培養基-凝膠樹膠平板上。在生物氣候室靜置1到2周後，將這些葉子切片轉移並重新放置在含有卡那黴素和氨苄青黴素的MS幼芽(shooting)培養基(含有0.02mg/l α-萘乙酸和1mg/l 6-苄基腺嘌呤)-凝膠樹膠平板上。在各葉子切片上證明形成了胼胝體。讓該平板在生物氣候室中靜置，直到從葉子切片形成幼芽。切下形成的幼芽，種植在含有卡那黴素和氨苄青黴素的MS培養基-凝膠樹脂罐中。挑選出在罐中能生根站立的個體，將它們作為轉化體菸草植株在含有20mg/l潮黴素、100mg/l卡那黴素和250mg/l氨苄青黴素的MS培養基-凝膠樹膠罐中維持傳代培養。
實施例9通過基因轉移向菸草植物株提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一個靶序列)性狀，它們與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了基因表達誘導系統。換而言之，將阻遏子barA基因轉移入菸草植株對其進行轉化，並將受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因也轉移入如此得到的轉化體菸草植株中對其進行瞬時轉化。
進一步將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，質粒pCaMV35SD-gus)轉移入轉化體菸草植株中(實施例8)，此轉化體菸草植株是通過將barA基因(實施例1，雙載體pBICaVM35S-barA)轉移入菸草(Nicotiana tabacum L.)得到的，對其進行瞬時轉化。
採用了電穿孔法進行基因轉移。因此，處理菸草植株將其轉變成原生質體。從該菸草植株的幾張葉片上切下方形(5-10mm)葉子切片，並懸浮於酶溶液(0.1％果膠溶酶Y23[KK Yakult]、1％纖維素酶「Onozuka」RS[Kikkoman KK]、0.4M甘露醇、pH5.5)中。讓此酶促反應在室溫中進行數小時。當在葉片表面觀察到剝離層時，用孔徑為70μm的篩網過濾此酶溶液，離心濾液。將沉澱下的綠色細胞塊作為基因轉移用的原生質體。用0.4M甘露醇洗滌此原生質體，然後懸浮於電穿孔用的緩衝液(5mM MES、70mM KCl、0.3M甘露醇)中，細胞密度為6×106/ml。將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，質粒pCaMV35SD-gus；10μg)和監測基因轉移效率的LUC基因(質粒pCaMV35S-luc；1μg)與500μl原生質體懸浮液混合，將此混合液轉移到轉移到基因脈衝儀[Nippon Bio-RadLaboratories]的小杯中[電極到電極距離4mm]。用300V電壓、250μF靜電容量和400Ω電阻在小杯電極間產生脈衝。脈衝產生的時間常數約為16毫秒。迅速將兩份等量的原生質體從脈衝後的小杯移至兩個培養皿(6cm直徑)中，在各培養皿中加入4.75ml培養基(改良的LS培養基，10g/l蔗糖，0.4M甘露醇)。
在如此得到的瞬時轉化的菸草原生質體中加入誘導物VB，以檢測是否誘導了受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
在一個培養皿中，將誘導物VB(VB-C6的終濃度為1μM)加到瞬時轉化的菸草原生質體培養物中，讓此培養皿靜置在25℃暗處22小時，然後製備此原生質體的細胞提取物，並將其GUS基因表達活性(以GUS活性對LUC活性的比例評估，稱為GUS/LUC值)與未添加VB的相比較。按與實施例4相同的方法進行VB的添加。從各培養皿回收原生質體，離心除去上清液，懸浮於500μl細胞提取用的緩衝液(0.1M KPO4、2mM EDTA、5％甘油、2mM DTT，pH7.8)中，用超聲波發生器[KK Tomy Seiko Handy Sonic UR-20]破裂細胞。高速離心含有破裂的細胞的液體，將得到的上清液用作細胞提取物。用與實施例4和實施例5所述相同的方法分別測定細胞提取物的GUS活性和LUC活性。在相同實驗條件下進行了兩次獨立的實驗。
結果，當將質粒pCaMV35SD-gus用作受BARE-3控制的GUS報導基因進行瞬時轉化時，加有VB-C6(ON)的比未加VB-C6(OFF)的GUS基因表達活性更高，因此可以觀察到GUS基因的表達受到VB的誘導。VB引起的基因表達誘導活性(誘導率GUS基因表達活性(ON)/GUS基因表達活性(OFF))在各試驗中為誘導率2。
以這種方法，通過基因轉移向培養的菸草植株提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一種靶序列)性狀，它們與作為誘導物的放線菌自調節因子VB構成了基因表達誘導系統，並將VB給予如此得到的瞬時轉化的菸草，可以在給予VB的部位誘導受BARE-3控制的基因的表達。
實施例10通過基因轉移向培養的菸草植株提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一個靶序列)性狀，它們與放線菌維吉尼亞鏈黴菌自調節因子VB(作為誘導物)構成了基因表達誘導系統。換而言之，將兩種基因阻遏子barA基因和受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因，轉化入菸草植株對其進行轉化。
進一步將受BARE-3控制的GUS報導基因(實施例2，雙載體pBICaMV35SUDD-gus)轉移入轉化體菸草植株(實施例8)，此轉化體菸草植株是通過將barA基因(實施例1，雙載體pBICaVM35S-barA)轉移入菸草(Nicotianatabacum L.)得到的。與實施例8相同，採用了土壤桿菌感染方法進行基因轉移。在含有20mg/l潮黴素、100mg/l卡那黴素和250mg/l氨苄青黴素的MS培養基上選擇轉化體菸草植株，並通過傳代培養維持。
給予如此得到的轉化體菸草植株誘導物VB，以檢測是否誘導了受操縱子BARE-3控制的GUS報導基因的表達。
通過在補充有VB(VB-C6的終濃度為1μM)的MS培養基罐中再種植，傳代培養了該轉化體菸草植株的側芽，測試了在生物氣候室中生長約3周的轉化體菸草植株葉片的GUS基因表達活性(以在GUS活性染色中所觀察到的染色程度來評估)，與未加入VB所得到的活性相比。在GUS活性染色中，將切下的葉片浸泡在含有1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸環己基銨鹽(X-gluc)(作為GUS的底物)的細胞提取用緩衝液中，讓此反應物37℃反應過夜。觀察到在葉片中形成了藍色色素，這是GUS酶促反應的結果。
結果，加有VB-C6(ON(VB+))轉化體菸草植株中的GUS基因表達活性比相同的未加VB-C6(OFF(VB-))的高，因此可以觀察到GUS基因的表達受到VB的誘導(圖6)。
以這種方法，通過基因轉移向培養的菸草植株提供阻遏子BarA(VB的受體蛋白)和操縱子BARE-3(BarA的一種靶序列)性狀，它們與作為誘導物的放線菌自調節因子VB構成了基因表達誘導系統，並將VB給予如此獲得的轉化體菸草植株，可以在給予VB的部位誘導受BARE-3控制的基因的表達。
工業應用本發明提供的方法，包括向植物提供阻遏子和操縱子性狀，它們與作為誘導物的放線菌自調節因子構成了基因表達誘導系統，並將放線菌自調節因子給予轉化的植物，以誘導在給予放線菌自調節因子部位上受操縱子控制的基因的表達，這種方法使得可以在所需時間和部位引起所需基因的表達，這些甚至可使植物產生代謝產物，否則對植物的生長不利。這種方法通過控制植物的繁殖力，可用於防止轉化體植物在環境中擴散。與其它已知誘導植物基因表達的方法相比，這種方法還可以使用較低濃度的特性優越和具有基因表達誘導活性的誘導物，同時還開闢了拓寬可用作誘導物的備選物範圍的方法。
序列表110鍾淵化學工業株式會社(Kaneka Corporation)120誘導植物中基因表達的方法及用其處理的植物130T619.PBT-2150JP2000-1804661512000-06-15160112101211699212DNA213維吉尼亞鏈黴菌(Streptomyces virginiae)220
221CDS222(1)…(699)300
301Okamoto，S.，Nakamura，K.，Nihira，T.和Yamada，Y.
302維吉尼亞鏈黴菌的維吉尼亞丁內酯結合蛋白。證據表明VbrA不是維吉尼亞丁內酯結合蛋白，是真結合蛋白的重新鑑定。
303生物化學雜誌(The Journal of Biological Chemistry)3042703052030612319-123263071995-05-19308D322513091994-07-194001atg gca gtg cga cac gaa cgg gtg gca gtg cga cag gaa cgg gcc gtc 48Met Ala Val Arg His Glu Arg Val Ala Val Arg Gln Glu Arg Ala Val1 5 10 15cgc acg cgg cag gcg atc gtg cgg gca gcc gcc tcg gtc ttc gac gag 96Arg Thr Arg Gln Ala Ile Val Arg Ala Ala Ala Ser Val Phe Asp Glu20 25 30tac ggg ttc gag gcc gcc aca gtg gca gag atc ctc tcg cgg gcc tcg 144Tyr Gly Phe Glu Ala Ala Thr Val Ala Glu Ile Leu Ser Arg Ala Ser35 40 45gtc acc aag ggc gcg atg tac ttc cac ttc gct tcc aag gaa gag ctg 192Val Thr Lys Gly Ala Met Tyr Phe His Phe Ala Ser Lys Glu Glu Leu50 55 60gcc cgc ggc gtg ctg gcc gag cag acc ctg cac gtg gcg gtg ccg gaa 240Ala Arg Gly Val Leu Ala Glu Gln Thr Leu His Val Ala Val Pro Glu65 70 75 80tcc ggc tcc aag gcg cag gaa ctg gta gac ctc acc atg ctg gtc gcc 288Ser Gly Ser Lys Ala Gln Glu Leu Val Asp Leu Thr Met Leu Val Ala85 90 95cac ggc atg ctg cac gat ccg atc ctg cgg gcg ggc acg cgg ctc gca 336His Gly Met Leu His Asp Pro Ile Leu Arg Ala Gly Thr Arg Leu Ala100 105 110ctg gac cag ggg gcg gtg gac ttc tcc gac gcc aac ccg ttc ggc gag 384Leu Asp Gln Gly Ala Val Asp Phe Ser Asp Ala Asn Pro Phe Gly Glu115 120 125tgg ggc gac atc tgc gcc cag ctc ctg gcg gag gca cag gaa cgg ggg 432Trp Gly Asp Ile Cys Ala Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gln Glu Arg Gly130 135 140gag gtg ctt ccg cac gtg aac ccg aaa aag acc ggc gac ttc atc gtc 480Glu Val Leu Pro His Val Asn Pro Lys Lys Thr Gly Asp Phe Ile Val145 150 155 160ggc tgc ttc acc ggg ctc cag gcg gtc tcc cgg gtc acc tcc gac cgc 528Gly Cys Phe Thr Gly Leu Gln Ala Val Ser Arg Val Thr Ser Asp Arg165 170 175cag gac ctc ggc cac cgg atc tcg gtg atg tgg aac cac gtg ctg ccc 576Gln Asp Leu Gly His Arg Ile Ser Val Met Trp Asn His Val Leu Pro180 185 190agc atc gtg ccg gcg tcc atg ctg acc tgg atc gaa acc ggc gag gag 624Ser Ile Val Pro Ala Ser Met Leu Thr Trp Ile Glu Thr Gly Glu Glu195 200 205cgg atc ggg aag gtc gcg gcg gcg gcc gag gcc gcc gag gct gcg gag 672Arg Ile Gly Lys Val Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Glu210 215 220gcc tcc gag gcc gcc tcc gac gag tag 699Ala Ser Glu Ala Ala Ser Asp Glu225 2302102211232212PRT213維吉尼亞鏈黴菌(Streptomyces virginiae)4002Met Ala Val Arg His Glu Arg Val Ala Val Arg Gln Glu Arg Ala Val1 5 10 15Arg Thr Arg Gln Ala Ile Val Arg Ala Ala Ala Ser Val Phe Asp Glu20 25 30Tyr Gly Phe Glu Ala Ala Thr Val Ala Glu Ile Leu Ser Arg Ala Ser35 40 45Val Thr Lys Gly Ala Met Tyr Phe His Phe Ala Ser Lys Glu Glu Leu50 55 60Ala Arg Gly Val Leu Ala Glu Gln Thr Leu His Val Ala Val Pro Glu65 70 75 80Ser Gly Ser Lys Ala Gln Glu Leu Val Asp Leu Thr Met Leu Val Ala85 90 95His Gly Met Leu His Asp Pro Ile Leu Arg Ala Gly Thr Arg Leu Ala100 105 110Leu Asp Gln Gly Ala Val Asp Phe Ser Asp Ala Asn Pro Phe Gly Glu115 120 125Trp Gly Asp Ile Cys Ala Gln Leu Leu Ala Glu Ala Gln Glu Arg Gly130 135 140Glu Val Leu Pro His Val Asn Pro Lys Lys Thr Gly Asp Phe Ile Val145 150 155 160Gly Cys Phe Thr Gly Leu Gln Ala Val Ser Arg Val Thr Ser Asp Arg165 170 175Gln Asp Leu Gly His Arg Ile Ser Val Met Trp Asn His Val Leu Pro180 185 190Ser Ile Val Pro Ala Ser Met Leu Thr Trp Ile Glu Thr Gly Glu Glu195 200 205Arg Ile Gly Lys Val Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Glu210 215 220Ala Ser Glu Ala Ala Ser Asp Glu225 230210321126212DNA213維吉尼亞鏈黴菌(Streptomyces virginiae)300301Kinoshita，H.，Tsuji，T.，Ipposhi，H.，Nihira，T.和Yamada，Y.302鏈黴菌丁內酯自調節受體結合序列的特性303Journal of Bacteriology304181305163065075-50803071999-08308D322513091994-07-194003agatacatac caaccggttc ttttga 262104211110212DNA213人工序列220223設計的CaMV 35S啟動子序列，被修飾成正好在其TATA-盒的下遊含有操縱子BARE-3元件4004gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc 60tctatataag agatacatac caaccggttc ttttgacggg ggactctaga1102105211110212DNA213人工序列220223設計的CaMV 35S啟動子序列，被修飾成正好在其TATA-盒的上遊含有操縱子BARE-3元件4005gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcagata cataccaacc ggttcttttg 60actatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactctaga1102106211110212DNA
213人工序列220
223設計的CaMV 35S啟動子序列，被修飾成正好在其TATA-盒的下遊和上遊含有操縱子BARE-3元件4006gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcagata cataccaacc ggttcttttg 60actatataag agatacatac caaccggttc ttttgacggg ggactctaga1102107211136212DNA213人工序列220
223設計的CaMV 35S啟動子序列，被修飾成正好在其TATA-盒的下遊和上遊含有3個操縱子BARE-3元件4007gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcagata cataccaacc ggttcttttg 60actatataag agatacatac caaccggttc ttttgaagat acataccaac cggttctttt 120gacgggggac tctaga 136210821127212DNA213人工序列220
223設計的反向引物序列，其含有限制酶BamH I識別序列，用於PCR擴增barA基因編碼區域，可用該酶切割而克隆4008taggatccat aaatggcagt gcgacac 27210921127212DNA213人工序列220
223設計的正向引物序列，其含有限制酶Sac I識別序列，用於PCR擴增barA基因編碼區域，可用該酶切割而克隆4009tagagctcct actcgtcgga ggcggcc 27
2101021167212DNA213人工序列220
223設計的配對寡DNA之一的序列，用於構建在TATA盒的下遊和上遊含有3個操縱子BARE-3元件的修飾的CaMV 35S啟動子40010cggatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatcaga tacataccaa ccggttcttt 60tgactat 672101121189212DNA213人工序列220
223設計的另一配對寡DNA序列，用於構建在TATA盒的下遊和上遊含有3個操縱子BARE-3元件的修飾的CaMV 35S啟動子40011gctctagagt cccccgtcaa aagaaccggt tggtatgtat cttcaaaaga accggttggt 60atgtatctct tatatagtca aaagaaccg 89
權利要求
1.一種誘導植物中基因表達的方法，其特徵在於，所述的方法包括通過基因轉移向植物提供阻遏子和操縱子特性，所述的阻遏子和操縱子與作為誘導物的放線菌自調節因子構成基因表達誘導系統，並將放線菌自調節因子施用於此轉化的植物，從而在給予放線菌自調節因子的部位誘導受該操縱子控制的基因的表達。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的放線菌屬於鏈黴菌屬。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的放線菌是維吉尼亞鏈黴菌。
4.如權利要求1-3任一所述的方法，其特徵在於，所述的自調節因子是丁內酯自調節因子。
5.如權利要求1-3任一所述的方法，其特徵在於，所述的自調節因子是維吉尼亞丁內酯。
6.如權利要求1-5任一所述的方法，其特徵在於，所述的基因表達誘導系統參與抗菌素的產生。
7.如權利要求1-3任一所述的方法，其特徵在於，所述的基因表達誘導系統參與維吉尼黴素的產生。
8.如權利要求1-7任一所述的方法，其特徵在於，所述的阻遏子基因是barA基因。
9.如權利要求1-8任一所述的方法，其特徵在於，所述的阻遏子基因含有包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列的區域。
10.如權利要求1-9任一所述的方法，其特徵在於，所述的阻遏子基因含有編碼SEQ ID NO2所示胺基酸序列的區域。
11.如權利要求1-10任一所述的方法，其特徵在於，所述的阻遏子基因的啟動子是植物啟動子。
12.如權利要求11所述的方法，其特徵在於，所述的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
13.如權利要求1-12任一所述的方法，其特徵在於，所述的操縱子的核苷酸序列衍生自barA、barB或barX基因。
14.如權利要求1-12任一所述的方法，其特徵在於，所述的操縱子的核苷酸序列是BARE-1、BARE-2或BARE-3。
15.如權利要求1-12任一所述的方法，其特徵在於，所述的操縱子的核苷酸序列是BARE-3。
16.如權利要求1-15任一所述的方法，其特徵在於，所述操縱子的核苷酸序列含有包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的區域。
17.如權利要求1-16任一所述的方法，其特徵在於，所述的受操縱子控制的基因的啟動子是植物啟動子。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
19.如權利要求17或18所述的方法，其特徵在於，所述的操縱子位於所述植物啟動子中的至少一個位置。
20.如權利要求17或18所述的方法，其特徵在於，所述的操縱子位於所述植物啟動子TATA盒的3』下遊位點附近或5』上遊位點附近的至少一個位置。
21.如權利要求17-20任一所述的方法，其特徵在於，所述的操縱子和所述植物啟動子的TATA盒，以SEQ ID NO4到SEQ ID NO7任一形式排列在一起。
22.如權利要求1-21任一所述的方法，其特徵在於，所述的受操縱子控制的基因是能向植物提供繁殖力的基因。
23.一種用權利要求1-22任一所述方法轉化的植物。
24.用權利要求1-22任一所述的方法轉化的菸草(Nicotiana tabacum L.)。
25.一種用權利要求1-22任一所述方法轉化的培養的植物細胞。
26.一種用權利要求1-22任一所述方法轉化的培養的菸草細胞。
27.一種由權利要求1-22任一所述的方法轉化的培養的菸草BY2細胞。
28.一種阻遏子基因，其特徵在於，所述的阻遏子基因與作為誘導物的放線菌自調節因子構成基因表達誘導系統，且所述的阻遏子基因的啟動子是植物啟動子。
29.如權利要求28所述的阻遏子基因，其特徵在於，所述的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
30.如權利要求28或29所述的阻遏子基因，其特徵在於，所述的阻遏子基因是barA基因。
31.如權利要求28-30任一所述的阻遏子基因，其特徵在於，所述的阻遏子基因含有包括SEQ ID NO1所示核苷酸序列的區域。
32.如權利要求28-31任一所述的阻遏子基因，其特徵在於，所述的阻遏子基因含有編碼SEQ ID NO2所示胺基酸的區域。
33.一種修飾的啟動子，其特徵在於，所述的啟動子中，與作為誘導物的放線菌自調節因子構成基因表達誘導系統的操縱子，位於植物啟動子TATA盒的3』下遊位點附近或5』上遊位點附近的至少一個位置。
34.如權利要求33所述的修飾的啟動子，其特徵在於，所述的植物啟動子是花椰菜花葉病毒35S啟動子。
35.如權利要求33或34所述的修飾的啟動子，其特徵在於，所述的操縱子的核苷酸序列是BARE-1、BARE-2或BARE-3。
36.如權利要求33-35任一所述的修飾的啟動子，其特徵在於，所述操縱子的核苷酸序列含有包括SEQ ID NO3所示核苷酸序列的區域。
37.如權利要求33-36任一所述的修飾的啟動子，其特徵在於，其中所述的操縱子與所述植物啟動子的TATA盒，以SEQ ID NO4到SEQ ID NO7任一形式排列在一起。
全文摘要
本發明提供了一種通過基因轉移向提供植物阻遏子和操縱子性狀的方法,所述阻遏子和操縱子與作為誘導物的放線菌自調節因子構成基因表達誘導系統,並將放線菌自調節因子給予此轉化的植物,從而在給予放線菌自調節因子的部位誘導受操縱子控制的基因的表達。這種方法可以使所需的基因在所需的時間和部位表達,從而使植物甚至能夠產生代謝產物,否則對植物的生長是不利的。還可以控制其繁殖力防止轉化體植物在環境中的擴散。
文檔編號C12N15/63GK1383451SQ01801717
公開日2002年12月4日 申請日期2001年6月15日 優先權日2000年6月15日
發明者新名惇彥, 加藤晃, 山田靖宙, 仁平卓也, 進藤卓也 申請人:鍾淵化學工業株式會社