哺乳動物細胞中使用獨特的高密度生長和轉染培養基與表達增強劑對的高產量瞬時表達的製作方法

2023-12-09 09:14:26

哺乳動物細胞中使用獨特的高密度生長和轉染培養基與表達增強劑對的高產量瞬時表達的製作方法
【專利摘要】本發明大體上是針對適用於將大分子和化合物(例如核酸分子)引入到細胞(例如真核細胞)中的細胞培養基(尤其是無血清、非動物來源和/或化學成分確定的培養基)。根據本發明，所述引入可以在所述培養基存在下進行。含有所述經引入的物質的細胞可以接著在所述培養基中加以培養，且所述經引入的物質對所述細胞的作用可以經測量或測定。具體來說，本發明允許將核酸分子(例如載體)引入到細胞(尤其真核細胞)中以及在所述細胞中表達由所述核酸分子編碼的蛋白質。本發明避免了每次用所述細胞執行不同程序(例如培養細胞對轉染細胞)時更換所述細胞培養基的需要。本發明還涉及適用於培養和轉化/轉染細胞的組合物和試劑盒。
【專利說明】晡乳動物細胞中使用獨特的高密度生長和轉染培養基與表 達增強劑對的高產量瞬時表達
[0001]【相關申請的交叉引用】
[0002] 本申請根據35 U.S.C. §119(e)要求2012年5月2日提交的美國臨時申請第 61/641，864號的優先權，其與本申請共同擁有且其全部內容特此明確以引用的方式併入， 就如同在本文中完全闡述般。 【【技術領域】】
[0003] 本發明大體上涉及轉染和細胞培養領域。具體來說，本發明提供一種適於在培養 的哺乳動物細胞中產量表達重組蛋白的轉染系統。本發明進一步涉及用於在哺乳動物細胞 中高產量表達重組蛋白的系統和方法。 【【背景技術】】
[0004] 細胞培養基提供在受控制的人造和體外環境中維持和生長細胞所必需的營養物。 細胞培養基的特徵和配方取決於具體細胞需求而改變。重要的參數包括滲透壓摩爾濃度、 PH和營養物組成。
[0005] 細胞培養基調配物在文獻中已有充分記載且大量培養基是可商購的。在 早期細胞培養工作中，培養基調配物是基於血液的化學組成和物理化學特性（例如 滲透壓摩爾濃度、pH等），且被稱為"生理溶液"（林格S. (Ringer，S.)，生理學雜誌 (J. Physiol. )3:380-393 (1880);威茅斯 C. (Waymouth，C.)，培養物中的細胞和組織（Cells and Tissues in Culture),第 1卷，學術出版社（Academic Press),倫敦（London),第 99-142頁（1965)中；威茅斯C.，體外（In Vitro) 6:109-127 (1970))。然而，哺乳動物身體 的不同組織中的細胞暴露於在氧氣/二氧化碳分壓以及營養物、維生素和微量元素的濃度 方面不同的微環境；因此，成功體外培養不同細胞類型可能需要使用不同培養基調配物。細 胞培養基的典型組分包括胺基酸、有機和無機鹽、維生素、微量金屬、糖、脂質和核酸，其類 型和量可能取決於給定細胞或組織類型的具體需求而改變。
[0006] 培養基調配物已用於培育多種細胞類型，包括動物、植物和細菌細胞。經培育的細 胞具有許多用途，包括研究生理過程以及產生有用的生物物質。所述有用的產物的實例包 括單克隆抗體、激素、生長因子、酶等。所述產物具有許多商業和治療性應用，並且，隨著重 組DNA技術的出現，細胞可以經工程改造以產生大量的這些產物。經培養的細胞還常規地 用於可以用作載體和/或疫苗的病毒的分離、鑑別和生長。因此，能夠體外培育細胞不僅對 於研究細胞生理學來說很重要，而且還是產生不可另外通過有成本效益的手段獲得的有用 物質所必需的。
[0007] 在已使用體外細胞培養基生長的各種細胞類型之中，特別令人感興趣的是來源於 上皮的細胞。上皮內襯於高等生物體的器官和腺體的內和外表面。由於此定位處於環境與 生物體之間的外部界面（例如皮膚）或處於器官與間質間隙之間的內部界面（例如腸黏膜 內襯），故上皮在維持內穩定方面具有主要作用。上皮例如通過調節營養物和廢棄物的運輸 和通透性來執行此功能（弗瑞旭尼R. I. (Freshney, R. I.)，上皮細胞的培養（Culture of Epithelial Cells),弗瑞旭尼 R. I.編，紐約：威立-利斯公司（New York:Wiley_Liss), 第 1-23 頁（1992)中）。
[0008] 構成上皮的細胞一般被稱為上皮細胞。這些細胞可以多層形式存在，如在皮膚中， 或以單層形式存在，如在肺泡中。如可能所預期的，上皮細胞的結構、功能和生理學通常是 組織特異性的。舉例來說，皮膚的表皮上皮細胞被組織為成層的鱗狀上皮且主要參與形成 生物體的保護屏障，而許多腺體的分泌性上皮細胞通常以單層的立方形細胞形式發現，其 在產生分泌性蛋白質和糖蛋白方面具有主要作用。然而，與其位置或功能無關，上皮細胞通 常是再生性的。也就是說，在正常條件下，或響應於損傷或其它活化刺激，上皮細胞能夠分 裂或生長。此再生能力已促進上皮細胞的體外操縱，達到多種原代上皮細胞和細胞系已在 體外得到成功培育的程度（弗瑞旭尼，同上）。
[0009] 雖然已在文獻中報導了多種上皮細胞和上皮細胞系的分離和使用，但已證實了展 現出上皮形態的人類胚胎腎細胞系293( "293細胞"）尤其適用於研究外源性配體受體的 表達、病毒的產生以及同種異體和異種重組蛋白的表達。舉例來說，美國專利第5, 166, 066 號描述了包含包括苯二氮卓結合位點的功能性GABA受體的穩定293細胞系的構建，已證實 其適用於鑑別和篩選精神活性的候選藥物。293細胞也已用於產生病毒，如天然和重組腺 病毒（加尼爾 A. (Gamier, A.)等人，細胞技術（Cytotechnol. ) 15:145-155 (1994);保特 A. (Bout, A.)等人，癌症基因療法（Cancer Gene Therapy) 3(6): S24,摘要 P-52 (1996); 王J.-W. (Wang, J.-W.)等人，癌症基因療法3(6): S24,摘要P-53 (1996))，所述病毒可用 於疫苗生產或構建用於重組蛋白表達的腺病毒載體。最後，已證實293細胞適用於大規模 生產多種重組人類蛋白質（伯格D. T (Berg, D.T.)等人，生物技術（BioTechniques) 14 (6 ):972-978(1993);佩夏 M.V. (Peshwa，M.V.)等人，生物技術與生物工程學（Biotechnol. Bioeng. )41:179-187(1993);加尼爾 A.等人，細胞技術 15:145-155(1994))。
[0010] 不嚴謹地稱為成纖維細胞的細胞已從許多不同組織中分離出來且被理解為結締 組織細胞。培養來自胚胎和成年組織的細胞系（不嚴謹地稱為成纖維細胞）明顯是可能的。 成纖維細胞特性上具有"紡錘體"外形。成纖維細胞樣細胞具有成纖維細胞典型的形態特 徵。在光學顯微鏡下，細胞在其於培養容器表面上生長為單層時呈現尖和細長形（"紡錘體 形狀")。細胞系在用適當標記物（如膠原蛋白I型）證實之後可被視為成纖維細胞或成纖 維細胞樣（弗瑞旭尼R. I.，上皮細胞培養，弗瑞旭尼R. I.編，紐約：威立-利斯公司，第 1-23 頁（1987))。
[0011] CHO細胞已被歸類為來源於中國倉鼠卵巢的上皮和成纖維細胞兩者。起始於中國 倉鼠卵巢的細胞系（CH0-K1)(高F. -T. (Kao, F. -T.)和普克Τ. T. (Puck，Τ. T.)，美國國家科 學院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 60:1275-1281 (1968))已被培養多年，但其身份仍未 經證實。
[0012] 大部分原代哺乳動物上皮細胞、哺乳動物成纖維細胞、上皮細胞系和成纖維細胞 系通常以單層培養物形式生長。然而，對於一些應用，將所述細胞培育為懸浮培養物將是有 利的。舉例來說，懸浮培養物生長在三維空間中。然而，類似大小容器中的單層培養物僅可 以二維生長在容器表面上。因此，與單層培養物相比，懸浮培養物可引起較高細胞產量，且 相對應地引起較高生物製劑（例如病毒、重組多肽等）產量。另外，懸浮培養物通常更易於 經由向培養容器中簡單加入新鮮培養基（稀釋傳代培養）而非如在單層培養物下通常所需 的進行胰蛋白酶消化和離心來進料和按比例擴大。進料的簡易性和可將懸浮培養物按比例 擴大的簡易性代表了在用於處理相當數目細胞的時間和人工方面的實質性節約。
[0013] 然而，許多錨著依賴性細胞（如原代上皮細胞、原代成纖維細胞、上皮細胞系和成 纖維細胞系）不易於被調適成懸浮培養物。因為其通常依賴於錨著於基底以實現最佳生 長，故這些細胞懸浮生長可需要將其連接於微載體（如乳膠或膠原蛋白珠粒）。因此，以此 方式生長的細胞雖然與傳統單層培養物相比能夠形成較高密度培養物，但仍在技術上連接 於表面；因此，這些細胞的傳代培養需要與用於傳代培養單層培養物的步驟類似的步驟。此 夕卜，在建立大批式或發酵罐培養物時，較大體積的微載體通常沉降到培養容器的底部，由此 需要更複雜的攪拌機制來保持微載體（且因此保持細胞）懸浮而不造成對細胞的剪切損傷 (佩夏M.V.等人，生物技術與生物工程學41:179-187 (1993))。
[0014] 儘管許多經轉化的細胞能夠懸浮生長（弗瑞旭尼R. I.，動物細胞的培養：基本技 術手冊（Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)，紐約：艾倫 R.利斯 公司（New York:Alan R.Liss，Inc.)，第123-125頁（1983))，但成功的懸浮培養物通常需 要相對高蛋白培養基或用血清或血清組分（如連接因子纖維粘連蛋白和/或玻璃粘連蛋 白）補充培養基、或複雜的灌注培養控制系統（京Y. -S. (Kyung，Y. -S.)等人，細胞技術 14:183-190(1994))，這可能是不利的。另外，許多上皮細胞在以懸浮形式生長時形成聚集 體或"凝集塊"，其可能會干擾成功傳代培養且減少生長速率和培養物產生的生物製品。在 發生凝集時，暴露於培養基的總細胞表面積減少，且細胞缺乏營養且不能將廢棄物有效交 換到培養基中。因此，生長減緩，獲得降低的細胞密度，且蛋白質表達受損。
[0015] 通常，細胞培養基調配物用一系列添加劑補充，包括成分不確定的組分，如胎 牛血清（FBS) (5%-20% v/v)或來自動物胚胎、器官或腺體的提取物（0.5%-10% v/ v)。雖然FBS是動物細胞培養基中最常施用的補充，但也常規使用其它血清來源，包 括新生小牛、馬和人類。已用於製備提取物以便補充培養基的器官或腺體包括下顎 腺體（柯亨 S. (Cohen, S.)，生物化學雜誌（J. Biol. Chem.) 237:1555-1565 (1961))、 垂體（佩爾 D. M. (Peehl, D. M.)和漢姆 R. G. (Ham, R. G.)，體外 16:516-525 (1980);美 國專利第4,673,649號）、下丘腦（馬恰格T. (Maciag，T.)等人，美國國家科學院院 刊76:5674-5678(1979);吉爾克裡斯特B.A. (Gi lchrest，B. A.)等人，細胞生理學雜 志（J.Cell Physiol.) 120:377-383(1984))、眼視網膜（巴裡託 D. (Barretault，D.) 等人，分化（Differentiation) 18:29-42 (1981))和腦（馬恰格Τ·等人，科學 (Science) 211:1452-1454 (1981))。這些類型的化學成分不確定的補充劑在細胞培養基中 提供數個有用功能（蘭伯特K.J. (Lambert，K.J.)等人，動物細胞生物技術（Animal Cell Biotechnology)，第1卷，施皮爾R. E. (Spier, R. Ε·)等人編，學術出版社紐約，第85-122 頁（1985)中）。舉例來說，這些補充劑向不穩定或水不溶性營養物提供載劑或螯合劑；結 合併中和毒性部分；提供激素和生長因子、蛋白酶抑制劑和必需的通常未經鑑別或成分不 確定的低分子量營養物；以及保護細胞免於物理應力和損傷。因此，血清或器官/腺體提取 物常用作相對低成本補充劑以向動物細胞的培養提供最佳培養基。
[0016] 令人遺憾的是，血清或器官/腺體提取物在組織培養應用中的使用具有數個缺點 (蘭伯特K. J.等人，動物細胞生物技術，第1卷，施皮爾R. E.等人編，學術出版社紐約， 第85-122頁（1985)中）。舉例來說，這些補充劑和血清的化學組成即使是來自單一製造商 也在批次之間存在變化。補充劑還可能會汙染有感染劑（例如支原體和病毒），所述感染劑 可能會嚴重地漸漸損害所培養的細胞的健康和最終產物的品質。成分不確定的組分（如血 清或動物提取物）的使用也妨礙對所培養的細胞的營養和激素需求的真實定義和闡明，由 此排除了以受控制的方式研究特異性生長因子或營養物對培養物中細胞生長和分化的作 用的能力。此外，成分不確定的補充劑防礙研究人員研究所培養的細胞中的異常生長和分 化和疾病相關的變化。最後且對於在工業生產生物物質中採用細胞培養基者來說最重要的 是，培養基的血清和器官/腺體提取物補充可因血清或提取物蛋白的非特異性共純化而使 從培養基中純化所需物質變得複雜並增加所述純化的成本。
[0017] 相對於在生長於用血清補充的培養基中的細胞中看到的表達水平，從生長於無血 清培養基中的細胞獲得重組蛋白表達水平改進（巴蒂斯塔P.J. (Battista，P.J.)等人，美 國生物技術實驗室（Am. Biotech. Lab. ) 12:64-68 (1994))。然而，無血清培養基可以仍含有 多種動物來源組分中的一或多者，包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素和其它蛋白質。蛋白質 或肽的存在使得重組蛋白的純化困難、耗時並昂貴。
[0018] 為了克服使用血清或器官/腺體提取物的這些缺點，已開發了多種所謂的"成分 確定的"培養基。這些通常經特定調配以支持單一細胞類型培養的培養基不含有成分不 確定的補充劑，並取而代之併入經定義量的通常由血清或提取物補充劑提供的經純化生長 因子、蛋白質、脂蛋白和其它物質。因為所述培養基中的組分（和其濃度）是精確已知的， 故這些培養基一般被稱為"成分確定的培養基"。有時與"成分確定的培養基"互換使用的 是術語"無血清培養基"或"SFM"。多種SFM調配物是可商購的，如被設計成用於支持內皮 細胞、角化細胞、單核細胞/巨噬細胞、淋巴細胞、造血幹細胞、成纖維細胞、軟骨細胞或肝 細胞培養的那些，其購自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司（Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif·)。然而，SFM與成分確定的培養基之間的區別在於，SFM 是不含血清和蛋白質部分（例如血清白蛋白）但不必不含其它成分不確定的組分（如器 官/腺體提取物）的培養基。實際上，已經報導或可商購的數種SFM含有所述成分不確 定的組分，包括支持角化細胞體外培養的數種調配物（博伊斯S.T. (Boyce，S.T.)和漢姆 R.G·，研究性皮膚病學雜誌（J. Invest. Dermatol. )81:33 (1983);威爾 J.J. (Wille，J.J.) 等人，細胞生理學雜誌（J· Cell. Physiol.) 121:31 (1984);皮特爾科 ER. (Pittelkow，Μ---·) 和斯科特 R.E. (Scott, R.E·)， 梅奧診所學報 （Mayo Clin. Proc. )61:771 (1986) ; 皮裡 希 L. (Pirisi，L.)等人，病毒學雜誌（J. Virol.) 61:1061 (1987);希普利 G. D. (Shipley, G. D.)和皮特爾科M. R.，皮膚病學文獻（Arch. DermatoL) 123:1541 (1987);希普利G.D.等 人，細胞生理學雜誌 138:511-518(1989);戴利 J.P. (Daley, J.P.)等人，F0CUS(GIBC0/ LTI) 12:68 (1990);美國專利第4, 673, 649號和第4, 940, 666號）。SFM由此在術語的真實 定義方面無法被視為成分確定的培養基。
[0019] 成分確定的培養基一般向使用者提供數種獨特的優點。舉例來說，使用成分確定 的培養基有助於研究特異性生長因子或其它培養基組分對細胞生理學的作用，所述作用在 細胞培育於含血清或含提取物的培養基中時可被掩蔽。另外，成分確定的培養基與含有血 清或提取物的培養基相比通常含有量低得多的蛋白質（實際上，成分確定的培養基通常被 稱為"低蛋白培養基"），使得對由在成分確定的培養基中培養的細胞產生的生物物質的純 化更簡單且更便宜。
[0020] -些極簡單的成分確定的培養基（其主要由維生素、胺基酸、有機和無機鹽以及 緩衝液組成）已用於細胞培養。然而，所述培養基（通常稱為"基礎培養基"）通常嚴重缺 乏大部分動物細胞所需的營養內含物。因此，大部分成分確定的培養基使其它組分併入到 基礎培養基中以使培養基在營養學上更複雜，但維持培養基的無血清和低蛋白含量。所述 組分的實例包括牛血清白蛋白（BSA)或人類血清白蛋白（HSA);來源於天然（動物）或重 組來源的某些生長因子，如表皮生長因子（EGF)或成纖維細胞生長因子（FGF);脂質，如月旨 肪酸、固醇和磷脂；脂質衍生物和複合物，如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；蛋白質和類固 醇激素，如胰島素、氫化可的松（hydrocortisone)和孕酮；核苷酸前體；以及某些微量元素 (由威茅斯C. (Waymouth，C.)分子和細胞生物學的細胞培養方法（Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology),第1卷：用於無血清動物細胞培養的培養基、補充劑 和底物的製備方法（Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture),巴爾內斯 D.W. (Barnes, D.W.)等人編，紐約：艾 倫R.利斯公司，第23-68頁（1984)和高斯泊達洛維奇D. (Gospodarowicz，D.)，同上，在 第 69-86 頁（1984)綜述）。
[0021] 然而，在細胞培養基中使用動物蛋白補充劑也具有某些缺點。舉例來說，存在這樣 的風險：從其純化的培養基和/或產物可以是免疫原性的，尤其在補充劑是來源於不同於 所培養的細胞來源的動物時。如果從所述培養基中純化待用作治療劑的生物物質，那麼一 定量的這些免疫原性蛋白質或肽可以被共純化且可在接受所述治療劑的動物中誘導免疫 反應（達到且包括全身性過敏反應）。
[0022] 為了排除這一潛在問題，可使用來源於與待培養的細胞相同的物種的補充劑。舉 例來說，可使用HSA作為補充劑促進人類細胞的培養，而用於培養牛細胞的培養基將改為 使用BSA。然而，這種方法會帶來將汙染物和不定的病原體引入到培養基中的風險（如來自 HSA製劑的克雅二氏病（Creutzfeld-Jakob Disease，CJD)，或來自BSA製劑的牛海綿狀腦 病（"狂牛症"）朊病毒），所述風險顯然可能會不利地影響所述培養基在製備動物和人類 治療劑中的使用。實際上，為了所述安全性原因，生物技術工業和政府機構逐漸管制、勸阻 且甚至禁止使用可含有所述病原體的含有動物來源蛋白的細胞培養基。
[0023] 為了克服在SFM中使用動物蛋白的局限性，已數次嘗試構建完全不含動物蛋白 的動物細胞培養基。舉例來說，一些培養基已將酵母細胞的提取物併入到基礎培養基 中（參見例如英國專利申請第GB901673號；凱伊L. (Keay，L.)，生物技術與生物工程學 17:745-764 (1975))，從而提供氮和其它必需營養物的來源。在另一種方法中，已在加入或 不加入酵母提取物的情況下使用小麥麵筋的水解產物來促進動物細胞的體外生長（日本 專利申請第JP 2-49579號）。已開發了其它培養基，其中血清經傳統上已用於細菌培養 的肉或蛋白質（如α-乳白蛋白或酪蛋白（例如蛋白腖））的酶促消化物替換（拉斯法爾 格E·Y·(Lasfargues，E·Y·)等人，體外 8(6):494-500(1973);凱伊L·，生物技術與生物 工程學17:745-764(1975);凱伊L.，生物技術與生物工程學19:399-411 (1977);施拉格爾 Ε.-J. (Schlager，E.-J.)，免疫學方法雜誌（J. Immunol. Meth. ) 194:191-199 (1996))。然 而，這些方法中無一者提供對於培養多種動物細胞最佳的培養基。此外，已展示出來自某些 植物（包括小麥、大麥、黑麥和燕麥）的提取物會抑制來源於動物細胞的無細胞系統中的蛋 白質合成（科爾曼w. H. (Coleman, W. Η.)和羅伯茨W.K. (Roberts, W.K.)，生物化學與生物 物理學報（Biochim. Biophys. Acta) 696:239-244 (1982))，表明在細胞培養基中使用來源於 這些植物的肽可以實際上抑制而非刺激體外動物細胞的生長。最近，包含大米肽的動物細 胞培養SFM調配物已經描述且展示出適用於培養多種正常和經轉化的動物細胞（參見美國 專利第6, 103, 529號，其以全文引用的方式併入本文中）。
[0024] 不管由將動物來源的補充劑加入到細胞培養基中造成的潛在困難，所述補充劑是 常規使用的。時常加入到成分確定的培養基中的一種所述補充劑是轉鐵蛋白。轉鐵蛋白在 體內起到將鐵傳遞到細胞的作用。哺乳動物細胞攝取鐵的機制已經綜述（錢Z.M. (Qian，Z. Μ.)和唐P. L. (Tang, P. L.) (1995)生物化學與生物物理學報1269, 205-214)。由於包括能 量產生和氧化呼吸在內的許多代謝過程中需要鐵作為輔因子，故通常用轉鐵蛋白補充無血 清培養基，以便傳遞必需的鐵以實現大部分細胞體外的成功培育。關於轉鐵蛋白製備中各 種潛在不定的試劑的擔憂已刺激了對其它可用作轉鐵蛋白替代物的天然鐵載體化合物的 搜尋。這種搜尋因以下事實而複雜：天然鐵載體通常來源於血清且由此經歷上述血清補充 的局限性。
[0025] 為了克服使用天然來源金屬載體的局限性，正探索某些結合金屬的化合物以用 於向所培養的細胞供應金屬，尤其是鋅、鐵、錳和鎂。簡單載體，如螯合劑（例如EDTA)和 某些酸或其鹽（例如檸檬酸鹽、吡啶甲酸鹽、以及苯甲酸或異羥肟酸的衍生物）已展示出 適用於某些無血清生長培養基（參見美國專利第5, 045, 454號和第5, 118, 513號；特斯 塔（Testa)等人，英國血液學雜誌（Brit. J. Haematol. )60:491-502, (1985);伽內沙咕嗜 (Ganeshaguru)等人，生物化學與藥理學（Biochem. Pharmacol. )29:1275-1279 (1980);懷 特（White)等人，血液（Blood) 48:923-929 (1976))。
[0026] 儘管這些參考文獻公開了一些金屬載體，但對數據的解釋因數種實驗因素而復 雜。數據是從有限數目的細胞系搜集的且展示出單通道的結果。另外，培養基補充有血清。 血清固有地含有轉鐵蛋白和其它潛在鐵載體。即使在血清或轉鐵蛋白不存在下傳代一或兩 次之後，對已在補充血清的培養基中培養過的細胞的生長也有"延續作用"（參見例如基南 J. (Keenan，J.)和克萊因斯M. (Clynes，M·) (1996)體外細胞發育生物學-動物（In Vitro Cell Dev. Biol-Animal) 32, 451-453)。其它已知結合金屬的化合物已在醫學上用於從體內 去除鐵且不用於傳遞。令人遺憾的是，許多這些簡單鐵螯合化合物不提供足夠的可供所培 養的細胞使用或為所培養的細胞攝取的鐵。
[0027] -旦確定供具體細胞類型生長用的適合的培養基調配物，就時常需要改變所討論 的細胞以便將所需生物學物質的產生優化。有效產生並純化生物學物質中的關鍵步驟是將 一或多種大分子（例如肽、蛋白質、核酸等）引入到將產生所述物質的細胞中。這可通過各 種方法實現。一種廣泛使用的將大分子引入到細胞中的方法被稱為轉染。
[0028] 通常，目標細胞在針對細胞生長進行優化的細胞培養基中生長到所需細胞密度。 一旦達到所需密度，就將培養基更換為針對轉染方法進行優化的培養基。在大部分情形下， 用於轉染的培養基並不支持細胞生長，但轉染培養基僅用於將核酸引入到細胞中的目的。 因此，所述方法一般需要從培養物收集細胞（通常通過離心進行），洗滌細胞以去除生長培 養基的痕跡，將細胞在相關大分子存在下懸浮在轉染培養基中，將細胞在轉染培養基中孵 育足以攝取大分子的時間段，任選地去除轉染培養基，並從細胞洗滌轉染培養基的殘餘物， 且接著將經轉染的細胞再懸浮於生長培養基中。將生長培養基更換為轉染培養基、洗滌細 胞並將轉染培養基更換回生長培養基的步驟需要大量的細胞實際動手操作，由此實質上增 加重組DNA技術的時間和費用。
[0029] 作為一個歷史實例，293細胞已以單層培養物形式培育在補充血清型複合培養基 (即DMEM)中。在懸浮生長時，293細胞具有聚集成大細胞團簇的傾向。這些大細胞聚集體 的形成降低了細胞的存活力。因為在聚集體中心的細胞並不直接暴露於培養基，故這些細 胞對培養基中營養物的接近有限，且難以將廢棄物交換到培養基中。另外，這種對培養基的 接近減少使團簇中的細胞不適於利用引入到培養基中的因子進行遺傳操作（即，利用核酸 轉化）。由於這些困難，293細胞總體上尚未用於懸浮培養以用於生物物質的產生。
[0030] 因此，在所屬領域中仍然需要允許真核細胞懸浮生長同時允許以減少量的操作轉 染細胞的細胞培養基和瞬時轉染系統。這類培養基應優選地是無血清和/或化學成分明確 和/或無蛋白質的培養基和/或缺乏動物來源物質的培養基，其促進哺乳動物細胞生長到 高密度和/或增加重組蛋白的表達水平，減少細胞凝集，且其並不需要補充動物蛋白，如血 清、轉鐵蛋白、胰島素等。這類培養基優選地將允許通常是錨著依賴性的哺乳動物細胞（包 括上皮細胞和成纖維細胞，如293細胞和CHO細胞）的懸浮培育。優選地，這類培養基也將 能夠以比用當前可供使用的培養基通常可獲得的密度高的密度培育和培養上述細胞類型。 另外，所述培養基將允許更容易且更有成本效益且有效地產生並純化生物技術工業中通過 經培養的哺乳動物細胞產生的大量商業上或科學上重要的生物學物質（例如病毒、重組蛋 白、生物製品、重組抗體等），且將在採用哺乳動物細胞培育的方法中提供更一致的結果。本 發明滿足了這些和其它需求。
[0031] 【發明概述】
[0032] 本發明提供一種細胞培養和轉染系統，藉此所述系統藉助於一或多種大分子 (如，例如可表達的核酸）轉染到培養的多個真核細胞中並在所述細胞中後續表達來支持 引入，且進一步支持細胞在引入/轉染之後的培育和生長，其中至少一種細胞在不存在培 養基用新鮮培養基補充的情況下在培養基中繼續生長。
[0033] 在一些實施例中，不必在細胞的引入/轉染期間從存在的細胞去除、補給或更換 所用培養基來支持其進一步生長。在另一個優選實施例中，在引入/轉染之後，細胞的生長 以及從可表達的核酸產生表達的蛋白質可在一定體積的培養基中實現，所述體積是與進行 引入/轉染的培養基的體積大致相同的體積到不超過約10倍其體積。使用本發明的培養 基，在已將核酸引入到細胞中之後以及在已引入核酸的細胞被進一步培養以表達核酸之前 不必補給、更換或補充培養基。
[0034] 瞬時表達正迅速成為所選擇的用於快速的哺乳動物蛋白產生的系統。瞬時轉染的 靈活性允許從概念到在手中的蛋白質的快速實現時間，且許多不同蛋白質可同步或依序產 生。瞬時轉染技術的下一個關鍵發展是在不損失瞬時形式的速度和靈活性的情況下使用穩 定表達系統獲得的接近或相同的表達水平。我們首次報導了新穎瞬時轉染系統的開發，所 述系統利用高密度293F細胞培養物來在細胞經轉染之後7天內產生表達水平>lg/L (高達 約2g/L)的人類IgG和非IgG蛋白。
[0035] 為了獲得所述高水平的蛋白質表達，開發了一種新穎細胞培養系統，其包括新高 密度生長培養基與適宜於在所述培養基中高密度生長的懸浮細胞群體的組合，所述系統允 許某些哺乳動物細胞群體達到高達20 X IO6個細胞/毫升（更通常高達約15 X IO6個細胞 /毫升）的活細胞密度。這些超高密度培養物與傳統方案相比能夠在較高細胞密度下轉染， 顯著增加蛋白質的容積產量。添加劑還發現在轉染之後或期間加入一或多種表達增強劑調 配物會使蛋白質表達水平升高到比在當前可商購的瞬時轉染系統下可見的表達水平高多 達10到12倍的水平。親本懸浮培養哺乳動物細胞針對在高密度培養條件下改進的生長和 存活率特徵進行調適，且接著進一步針對增加的蛋白質產生進行選擇。所得高密度調適的 細胞與親本細胞系相比生長速率增加、細胞大小增加、且比生產量增加。最後，轉染方法通 過使用與一或多種表達增強劑調配物組合使用的一或多種轉染試劑來優化以進一步增加 總蛋白質產量。
[0036] 當所有這些改進組合到單一表達系統中時，蛋白質水平對於IgG和非IgG重組蛋 白兩者來說與可商購的Fr eeStyleTM293表達系統相比增加高達10倍，且針對多種蛋白質獲 得>lg/L的表達水平。另外，蛋白質功能性被證實對於在本發明的高產量表達系統中表達 的數種蛋白質來說在與流行的可商購的Fr eeStyleTM293系統相比時是相當的。總之，這些 結果指示出可使用將許多蛋白質表達技術的進展合併成單一易於使用形式的新穎瞬時哺 乳動物表達系統來獲得功能蛋白產量的顯著增加。
[0037] 本發明還提供了一種培育真核細胞的方法，其包含：(a)使細胞與本發明的細胞 培養基接觸；(b)將細胞維持在適於支持細胞在培養物中培育的條件下；以及（c)任選地表 達核酸以形成蛋白質產物。
[0038] 本發明還提供了一種將一或多種大分子引入到培養物中的至少一種真核細胞中 的方法，所述方法包含：(a)在培養物的根據權利要求1所述的培養基中培養至少一種真核 細胞；(b)將至少一種大分子在足以使所述至少一種大分子中的一或多者引入至少一種細 胞中的條件下引入到培養物中；以及（C)在培養基中培育至少一種細胞以產生產物，所述 產物的產生受所述至少一種分子控制，其中在不存在培養基用新鮮培養基替換的情況下至 少一種細胞在培養基中繼續生長，其中不必在引入期間從存在的至少一種細胞去除所用培 養基來支持所述至少一種細胞的生長，和/或其中在引入之後，生長是在一定體積的培養 基中培育中實現的，所述體積是與進行引入的培養基的體積大致相同的體積到不超過約10 倍其體積。
[0039] 本發明還提供了一種用於體外培育和轉染細胞的試劑盒，所述試劑盒包含本發明 的細胞培養基，且任選地進一步包含以下各項中的一或多者：一或多種用於將至少一種分 子引入到細胞中的試劑、一或多種大分子、至少一種細胞、和關於在培養物中培養至少一種 細胞和/或關於將至少一種大分子引入到培養物中的至少一種細胞中的說明書。
[0040] 本發明還提供了一種組合物，其包含本發明的細胞培養基和至少一種選自由以下 各項組成的群組的組分：至少一種真核細胞、一或多種用於將至少一種大分子引入到至少 一種細胞中的試劑以及一或多種大分子。
[0041] 所屬領域的技術人員根據本發明的以下圖式和描述以及權利要求書將清楚本發 明的其它實施例。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0042] 本文中參考隨附圖式僅藉助於實例描述本發明。現具體參考詳細圖式，強調所示 細節是作為舉例且僅出於說明性論述本發明優選實施例的目的，且以提供被認為是對本發 明的原理和概念方面的最有用且易於理解的描述的原因呈現。在這點上，未試圖比基本理 解本發明所必需更詳細地展示本發明的結構詳情。
[0043] 在附圖中：
[0044] 圖1是展示使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統可實現的細胞密度的 圖式。被調適用於高密度生長的細胞經3代緩慢調適到各種培養基中。細胞調適的培養基 包括根據本發明的一個實施例的高密度培養基（實心圓）、測試培養基1 (實心三角形）、測 試培養基2 (空心三角形）、測試培養基3 (空心菱形）。將細胞在每一培養基中培養多代， 隨後以0. 2 X IO6個細胞/毫升接種於30ml燒瓶中。經8天監測細胞密度和存活率；
[0045] 圖2是概述用於根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的細胞系表達優化的 條形圖。將親本293F細胞系分割成多個傳代培養物，隨後將所述多個傳代培養物調適到高 密度培養基中。能夠以高密度生長的各個傳代培養物接著針對其表達重組測試蛋白（人類 IgG)的能力進行選擇和評估。標記高產量調適的293F細胞的細胞的傳代培養物（右組條 形）與來源於相同親本293F細胞系的細胞的兩種不同傳代培養物相比表達多35 %到45 % 之間的重組IgG ;
[0046] 圖3是概述用於根據一些實施例的瞬時轉染系統的各種增強劑的作用的條形圖。 鑑別出顯著改進蛋白質產生的表達增強劑。組分被調配成2種穩定增強劑溶液。表達增強 齊U 1的加入使hlgG表達加倍（比較前兩個條形）。增強劑2本身的加入僅展示對IgG增強 表達的邊際作用，但當與增強劑1組合加入時，相較於對照提供多到幾乎3倍的hlgG (比較 第三和第四）；
[0047] 圖4展示使用根據一些實施例的高產量瞬時轉染系統和現有技術瞬時轉染系統 (Freestyle? 293系統）的4種不同且獨特蛋白質的表達水平的比較。圖4A展示在與可 商購的Freestyle? Max系統相比時使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的人類 IgG表達的大於5倍的增加。圖4B展示在與可商購的FreeStyle? Max系統相比時使用根 據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的Cripto表達的大於5. 2倍的增加。圖4C展示在 與可商購的FreeStyle? Max系統相比時使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的 β 2-腎上腺素受體表達的幾乎4倍的增加。圖4D展示在與可商購的FreeStyle? Max系統 相比時使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的兔IgG表達的大於11倍的增加；
[0048] 圖5是比較使用根據一些實施例的瞬時轉染系統與現有技術瞬時轉染系統實現 的EPO表達水平的條形圖。EPO使用本發明的瞬時表達系統和Freestyle? 293系統表達。 本發明系統可從Iml (24孔板形式）按比例擴大到1L(3L搖瓶形式）。在來自三個不同實驗 室的三個獨立分析員的結果中可見特定蛋白質表達水平的可靠再現性。 【【具體實施方式】】
[0049] 本發明提供了用於真核和原核細胞兩者生長的改進的培養基調配物。本發明培養 基支持細胞生長、將大分子引入到培養的細胞中以及在不需要在生長、引入和/或培育之 間補給、更換、補充或改變培養基的情況下進行細胞培育。本發明的培養基可用於支持或增 強任何細胞的生長和培育。本發明還提供了可用作一或多種非所需組分（例如動物來源組 分）的取代物或替代所述一或多種非所需組分的化合物。替代化合物提供非所需組分的至 少一種所需功能。
[0050]【定義】
[0051] 在隨後的描述中，廣泛地使用多個用於細胞培養和重組DNA技術的術語。為了提 供對說明書和權利要求書（包括欲給出所述術語的範圍）清楚且更一致的理解，提供以下 定義。
[0052] 術語將大分子或化合物"引入"到培養物中是指將大分子或化合物供應到培養基 中。
[0053] 術語將大分子或化合物"引入"到至少一種細胞中是指將大分子或化合物供應到 細胞，使得大分子或化合物變得內化在細胞中。舉例來說，大分子或化合物可使用轉染、轉 化、注射和/或脂質體引入來引入到細胞中，並且還可以使用所屬領域的技術人員已知的 其它方法引入到細胞中。優選地，大分子或化合物是通過脂質體引入來引入到細胞中的。大 分子優選地是蛋白質、肽、多肽或核酸。大分子可為蛋白質。或者，大分子可為肽。或者，大 分子可為多肽。大分子還可為核酸。
[0054] 如本文中所用，術語"大分子"涵蓋生物分子。在一個實施例中，術語大分子是指核 酸。在一個優選實施例中，術語大分子是指脫氧核糖核酸（DNA)和核糖核酸（RNA)。更優選 地，術語大分子是指DNA。更優選地，術語大分子是指互補DNA(cDNA)。大分子可帶電荷或 不帶電荷。DNA分子是帶電荷大分子的一個實例。在一些情況下，如本文中所用的術語"大 分子"可與術語"可表達的核酸"互換使用。
[0055] 術語"轉染"在本文中用於指將核酸、蛋白質或其它大分子傳遞到目標細胞，使得 核酸、蛋白質或其它大分子在所述細胞中得以表達或具有生物功能。
[0056] 如本文中所用的術語"可表達的核酸"與分子量無關地包括DNA和RNA兩者，且術 語"表達"意指細胞內核酸的功能性存在的任何表現，包括（但不限於）瞬時表達和穩定表 達兩者。功能方面包括通過寡核苷酸或蛋白質傳遞對表達進行抑制。
[0057] 術語"核酸的表達"和其等效說法是指核酸在細胞中複製、DNA轉錄成信使RNA、 RNA翻譯成蛋白質、蛋白質的翻譯後修飾和/或蛋白質在細胞中運輸或其變化形式或組合。
[0058] 術語"成分"是指可在細胞培養基中用於維持或促進細胞生長或增殖的任何化合 物（無論是化學來源還是生物來源）。術語"組分"、"營養物"和"成分"可互換使用且都意 欲指所述化合物。用於細胞培養基的典型成分包括胺基酸、鹽、金屬、糖、脂質、核酸、激素、 維生素、脂肪酸、蛋白質等。促進或維持細胞離體培育的其它成分可由所屬領域的技術人員 根據具體需要加以選擇。本發明的培養基可包括一或多種選自由以下各項組成的群組的組 分：牛血清白蛋白（BSA)或人血清白蛋白（HSA);-或多種來源於天然（動物）或重組來源 的生長因子，如表皮生長因子（EGF)或成纖維細胞生長因子（FGF);-或多種脂質，如脂肪 酸、固醇和磷脂；一或多種脂質衍生物和複合物，如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；一或多 種蛋白質；一或多種和類固醇激素，如胰島素、氫化可的松和孕酮；一或多種核苷酸前體； 以及一或多種微量兀素。
[0059] 如本文中所用的術語"細胞"是指包括所有類型的真核和原核細胞。在優選實施 例中，所述術語是指真核細胞，尤其是哺乳動物細胞。在某些示例性但非限制性實施例中， 術語"細胞"意欲指人類293細胞或其變異體，如可懸浮生長的293變異體。尤其優選的是 可以在懸浮培養物中生長、增殖並轉染的293細胞的變異體，具體地說是可以高密度（例如 大於約2 X IO6個細胞/毫升，更優選地大於約3 X IO6個細胞/毫升，或甚至任選地大於約 4X IO6個細胞/毫升）培養的那些變異體。所述變異型293細胞系的一個實例是EXPI293? F細胞。在其它示例性但非限制性實施例中，術語"細胞"意欲指CHO細胞。
[0060] 如本文中所用，當用於根據本發明培養細胞以及出於進行轉染工作流程的目的 採用其的本發明方法的情形時，術語"高密度"一般是指已知細胞系、或已知細胞系的變異 體，其可在適當細胞培養基中生長或培養到大於約IX IO6個細胞/毫升、更優選地大於約 2X IO6個細胞/毫升、最優選地大於約3X IO6個細胞/毫升、或甚至任選地大於約4X IO6 個細胞/毫升、或更高達約20 X IO6個細胞/毫升的密度，同時仍然保持以高效率轉染的能 力並且能夠以高水平（例如超過200μ g/ml到高達約lmg/ml或更高的水平）表達目標蛋 白。
[0061] 短語"高密度培養基"在本文中用於指能夠維持哺乳動物細胞（優選地懸浮生長 的細胞）以高達約2X IO7個細胞/毫升的密度生長同時維持所述細胞超過約80%的存 活率且此外維持所述懸浮細胞有效轉染並表達高量重組蛋白的能力的任何培養基。本發 明的實踐中所用的"高密度培養基"可在不同應用和用途之間變化，且可能取決於所用細 胞系、瞬時表達的所需蛋白質的性質、選擇用於將表達載體轉移到細胞中的轉染模態的性 質以及加入到如下文所述的系統中的任何表達增強劑的量和性質。儘管如此，預期用於 本發明瞬時表達系統和方法的優選的"高密度培養基"將通常是無血清、無蛋白質的，允許 懸浮細胞培育和生長到高達約2X IO7個細胞/毫升、更通常在約2X IO6個細胞/毫升到 約I X IO7個細胞/毫升之間的密度，且將進一步實現在瞬時表達系統中產生的蛋白質產 量超過至少200 μ g/mL細胞培養物到2mg/mL細胞培養物、更通常在約500 μ g/ml細胞培 養物到約lmg/mL細胞培養物之間。理想地，根據本發明使用的高密度培養基將有助於細 胞以在約IX IO6到約20X IO6個細胞/毫升、約2X IO6到約2X IO6個細胞/毫升、或約 2. 5 X IO6到約6 X IO6個細胞/毫升範圍內的密度轉染。適用於本發明實踐的示例性高密 度培養基包括（但不限於）HuMEC基礎無血清培養基、KNOCKOUT? CTStm無外來物ESC/iPSC 培養基、STEMPR0?-34SFM培養基、STEMPRO? NSC培養基、ESSENTIAL?-8培養基、培養基 254、培養基106、培養基131、培養基154、培養基171、培養基171、培養基200、培養基231、 H印toZYME-SFM、人類內皮-SFM、GlBCO? FREESTYLE? 293 表達培養基、培養基 154CF/ PRF、培養基154C、培養基154CF、培養基106、培養基200PRF、培養基131、Essential?-6 培養基、stempro?-34培養基、Gibco?:星形膠質細胞培養基、AIM 培養基CTS?、 AMINOMAX? C-100 基礎培養基、AMIN0MAXtm-II 完全培養基、CD F0RTICH0? 培養基、CD CHO AGT 培養基、CHO-S-SFM 培養基、GIBCO?] FREESTYLE? CHO 表達培養基、CD OPTICHOtm 培養基、CD CHO培養基、CD DG44培養基、SF-900?培養基、EXPI293?表達培養基、LHC基 礎培養基、LHC-8培養基、293SFM培養基、CD 293培養基、AEM生長培養基、PER. C6?鈿 胞培養基、AIM V?；!培養基、EXPILIFE?:培養基、角質細胞-SFM培養基、LHC培養 基、LHC-8培養基、LHC-9培養基和其任何衍生物或修改型。在某些優選但非限制性的實施 例中，高密度培養基可為CD F0RTICH0?培養基、CD CHO AGT培養基、CHO-S-SFM培養基、 GIBCO? I FREESTYLE? CHO 表達培養基、CD 0PTICH0? 培養基、CD CHO 培養基、CD DG44 培養基、G1BCO? FREESTYLE?293表達培養基、EXPI293?表達培養基或類似培養基、或 其修改型。以上列出的示例性高密度培養基可尤其適於CHO細胞、CHO細胞變異體、293細 胞、293細胞變異體、CapT細胞、CapT細胞變異體或經調適用於高密度培養系統的任何其它 細胞的高密度生長、繁殖、轉染和維持。
[0062] 短語"被調適用於高密度培養物的細胞"意欲指已調適成以高密度生長在高密度 培養基中同時保持細胞存活率處於或高於約80%的細胞譜系或來源於同一親本細胞譜系 的細胞的（非克隆）群體。所述細胞可通過經>40、>50、>60、>70或>80次連續傳代以高 密度維持細胞且用所需高密度培養基逐漸更換生長培養基的比例來從親本細胞群體中分 離或選擇出。任選地，在所述方法期間，不同細胞池可個別地繁殖且經歷選擇程序，同時同 步評估轉染效率和或蛋白質表達效率，使得可選擇出可以高密度維持和生長、以高效率轉 染且表達高水平所需重組蛋白的細胞的非克隆群體。雖然熟練的從業者將易於清楚，多種 細胞類型和譜系可經歷這種選擇程序，但已確定來源於CHO細胞的細胞譜系、來源於293成 纖維細胞的細胞譜系和來源於CapT細胞的細胞尤其經受所述選擇方法以便被調適成高密 度生長條件。理想地，被調適用於高密度生長培養物且適用於本發明的細胞還將能夠以高 效率轉染和/或能夠以超過至少約200 μ g/mL細胞培養物到約2mg/mL細胞培養物、更通常 在約500 μ g/ml細胞培養物到約lmg/mL細胞培養物之間的產量表達重組蛋白。理想地，被 調適用於根據本發明使用的高密度培養物的細胞能夠以在約IX IO6到約20X IO6個細胞/ 毫升、約2 X IO6到約2 X IO6個細胞/毫升、或約2. 5 X IO6到約6 X IO6個細胞/毫升範圍內 的密度維持和轉染。
[0063] "細胞培養"或"培養"意指在人造體外環境中維持細胞。
[0064] "培育"意指在有利於生長和/或分化和/或持續存活力的條件下體外維持細胞。 "培育"可與"細胞培養"互換使用。培育是通過每毫升培養基活細胞數來評估的。在引入 大分子之後的培育優選地包括產生產物，例如病毒上的蛋白質產物。
[0065] 如本文中所用的術語"補給、更換或補充培養基"是指將一定體積的新鮮細胞培 養基加入到已存在於培養物中的培養基中，和/或用新鮮培養基更換已存在於培養物中的 培養基，和/或用新培養基補充已存在於培養物中的培養基。新鮮培養基是不含待引入 到至少一種細胞中的一或多種大分子或化合物的培養基或尚未與細胞接觸以支持其生長 培育的培養基。熟練的業內人士可通過利用所屬領域中已知的技術（如細胞計數（手動 或自動）、臺盼藍拒染（trypan blue exclusion)、產生蛋白質或其它物質、阿爾瑪藍分析 (alamar blue assay)、一或多種代謝產物的存在或濃度、細胞粘附、形態外觀、廢培養基的 分析等）監測細胞生長和/或存活率來判定去除和/或補給、更換或補充培養基是否有優 點或有此需要。監測技術中的一者或組合可用於判定是否需要培養基來支持生長、引入至 少一種大分子和/或在引入至少一種大分子之後進行培育。
[0066] "重組蛋白"是指由引入到宿主細胞中的核酸編碼的蛋白質。所述宿主細胞表達 所述核酸。術語"表達核酸"與"從由核酸編碼的RNA表達蛋白質"同義。如本文中所用的 "蛋白質"廣泛地是指聚合胺基酸，例如肽、多肽、蛋白質、脂蛋白、糖蛋白等。
[0067] 術語"蛋白質產量"是指由培養的細胞表達的蛋白質的量，且可例如根據每毫升培 養基所產生的蛋白質克數來測量。如果蛋白質不由細胞分泌，那麼蛋白質可通過所屬領域 的技術人員已知的方法從細胞內部分離。如果蛋白質由細胞分泌，那麼蛋白質可通過所屬 領域的技術人員已知的方法從培養基中分離。由細胞表達的蛋白質的量可易於由所屬領域 的技術人員測定。蛋白質可為重組蛋白。
[0068] "蛋白質產物"是與通過蛋白質產生或通過蛋白質起的作用有關的產物。蛋白質產 物可為蛋白質。蛋白質產物還可為由會產生產物的通過一或多種其它物質的蛋白質的作用 引起的產物。所述作用的一個實例是通過蛋白質的酶促作用。
[0069] "懸浮培養物"意指培養容器中大部分或所有細胞以懸浮形式存在、且培養容器中 少數或沒有細胞附著於容器表面或容器內的另一個表面的細胞培養物。優選地，"懸浮培養 物"在培養容器中具有大於75%的細胞呈懸浮形式，不附著於培養容器之上或之中的表面。 更優選地，"懸浮培養物"在培養容器中具有大於85%的細胞呈懸浮形式，不附著於培養容 器之上或之中的表面。甚至更優選的是"懸浮培養物"在培養容器中具有大於95%的細胞 呈懸浮形式，不附著於培養容器之上或之中的表面。
[0070] 本發明的培養基、方法、試劑盒和組合物適於細胞的單層或懸浮培養、轉染和培 育，且適於蛋白質在單層或懸浮培養的細胞中表達。優選地，本發明的培養基、方法、試劑盒 和組合物用於細胞的懸浮培養、轉染和培育，且用於蛋白質產物在懸浮培養的細胞中表達。
[0071] "培養容器"意指可向培養細胞提供無菌環境的任何容器，例如玻璃、塑料或金屬 容器。
[0072] 短語"細胞培養基"、"組織培養基"、"培養基"（在每一種情況下複數"培養基"）和 "培養基調配物"是指用於培育細胞或組織的營養性溶液。這些短語可互換使用。
[0073] 術語"組合"是指成分的混合或摻合。
[0074] 分子的衍生物包括包含基礎分子但具有其它或經修飾側基的一些化合物。優選 地，"衍生物"可通過使基礎分子與僅1個但可能是2、3、4、5、6個等反應物分子反應而形成。 單步驟反應是優選的，但多步驟，例如2、3、4、5、6步等反應在所屬領域中已知形成衍生物。 取代、縮合和水解反應是優選的且可組合以形成衍生化合物。或者，衍生化合物可為優選地 在1個中但可能是2、3、4、5、6個等反應中可形成基礎化合物或其取代或縮合產物的化合 物。
[0075] 細胞培養基由多種成分組成且這些成分在培養基間可有所不同。用於細胞培養基 的每一成分具有其獨特的物理和化學特徵。成分的相容性和穩定性部分地由成分在水溶液 中的"可溶性"確定。術語"可溶性"和"可溶"是指成分與其它成分形成且保持溶解狀態的 能力。成分由此在其可維持溶解狀態而不形成可測量或可檢測沉澱時是相容的。
[0076] "相容成分"還意指可一起維持在溶液中且形成"穩定"組合的那些培養基組分。 含有"相容成分"的溶液在成分不實質上沉澱、降解或分解使得可用於來自培養基的細胞的 一或多種組分的濃度降低到不再支持細胞最優或所需生長的水平時被稱為是"穩定的"。成 分在降解無法檢測時或當降解在與IX細胞培養基調配物中相同成分的分解相比時以較 慢速率發生時也被視為是"穩定的"。舉例來說，在IX培養基調配物中，已知穀氨醯胺降解 成吡咯烷酮羧酸和氨。穀氨醯胺與二價陽離子的組合由於隨時間推移在存在穀氨醯胺和二 價陽離子兩者的溶液或組合中可檢測到極少或無穀氨醯胺分解而被視為是"相容成分"。參 見美國專利第5, 474, 931號。因此，如本文中所用的術語"相容成分"是指在作為濃縮的或 IX調配物混合於溶液中時是"穩定"且"可溶"的具體培養基成分的組合。
[0077] 術語"IX調配物"意欲指含有以工作濃度見於細胞培養基中的一些或所有成分 的任何水溶液。"IX調配物"可以指例如細胞培養基或所述培養基成分的任何子組。IX 溶液中成分的濃度與用於體外維持或培育細胞的細胞培養調配物中可見的所述成分的濃 度大致相同。用於體外培育細胞的細胞培養基是根據定義的IX調配物。當存在多種成分 時，IX調配物中的每一成分的濃度約等於在細胞培養期間培養基中每一對應成分的濃度。 舉例來說，RPMI-1640培養基除了其它成分之外含有0. 2g/L L-精氨酸、0.05g/L L-天冬醯 胺和0.02g/L L-天冬氨酸。這些胺基酸的"IX調配物"在溶液中含有大致相同濃度的這 些成分。因此，當提及"IX調配物"時，預期溶液中的每一成分具有與所述細胞培養基中 可見的濃度相同或大致相同的濃度。所屬領域的技術人員熟知細胞培養基的IX調配物中 的成分濃度。參見例如，用於無血清動物細胞培養的培養基、補充劑和底物的製備方法艾倫 R.利斯（Allen R. Liss), N.Y. (1984)，微生物培養基手冊（Handbook of Microbiological Media),第二版，羅納德Μ.阿特拉斯（Ronald M. Atlas)編勞倫斯C.帕克斯（Lawrence C. Parks) (1997)佛羅裡達州波卡拉頓的CRC出版社（CRC Press, Boca Raton, Fla.)，和植 物培養基（Plant Culture Media),第 1卷：調配和使用（Formulations and Uses)E.F.喬 治（E. F. George)，D. J. M.帕陶克（D. J. M. Puttock)和 H. J.喬治（H. J. George) (1987)英格 蘭BA134QG威爾特郡韋斯特伯裡埃丁頓的解經公司（Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts，BA134QGEngland)，所述文獻中的每一者以全文引用的方式併入本文中。然而，與培 養基相比，I X調配物中的滲透壓摩爾濃度和/或pH可不同，尤其當I X調配物中含有更少 成分時。
[0078] "10 X調配物"意欲指一種溶液，其中所述溶液中每一成分的濃度與在細胞培養期 間培養基中每一對應成分的濃度相比多到約10倍。舉例來說，RPMI-1640培養基的IOX調 配物除了其它成分之外可含有2.0g/L L-精氨酸、0. 5g/L L-天冬醯胺和0. 2g/L L-天冬氨 酸（比較IX調配物，上文）。"10X調配物"可含有濃度是IX培養調配物中所見約10倍 的多種其它成分。如將易於清楚，"25X調配物"、"50X調配物"、"100X調配物"、"500X 調配物"和"1000X調配物"分別表示如與IX細胞培養調配物相比含有約25、50、100、500 或1000倍濃度的成分的溶液。此外，培養基調配物和濃縮溶液的滲透壓摩爾濃度和PH可 以變化。
[0079] 術語"微量元素"或"微量元素部分"是指相對於培養基中存在的其它部分或組分 的量或濃度僅以極低（即"微量"）的量或濃度存在於細胞培養基中的部分。在本發明中， 這些術語涵蓋 Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、C。2+、Cr 3+、Cu1+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ge 4+、Se4+、Γ、Μη2+、 F_、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn 2+和Zr4+和其鹽。舉例來說，以下鹽可用作本發明培養基中 的微量元素：AgN03、AlCl 3 · 6H20、Ba (C2H3O2) 2、CdSO4 · 8H20、CoCl2 · 6H20、Cr2(SO4)3 · 1H20、 Ge02、Na2Se03、H2Se03、KBr、KI、MnCl 2 · 4H20、NaF、Na2SiO3 · 9H20、NaV03、（NH4)6Mo 7O24 · 4H20、 NiSO4 · 6H20、RbCl、SnCl2和ZrOCl2 · 8H20。微量元素部分的適合濃度可由所屬領域的技術 人員僅使用常規實驗確定。
[0080] 術語"胺基酸"是指胺基酸或其衍生物（例如胺基酸類似物）以及其D和L形式。 所述胺基酸的實例包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬醯胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷 氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-穀氨醯胺、L-精氨 酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-羥基脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和 L-纈氨酸、N-乙醯基半胱氨酸。
[0081] "化學成分確定的"培養基是其中每一化學物質和其對應的量在其用於培養細胞 之前是已知的培養基。化學成分確定的培養基在沒有化學物質未知和/或未經定量的溶解 產物或水解產物的情況下製得。化學成分確定的培養基是本發明培養基的一個優選實施 例。
[0082] 術語"無血清培養條件"和"無血清條件"是指排除任何類型血清的細胞培養條件。 這些術語可互換使用。
[0083] "無血清培養基"(有時被稱為"SFM培養基"）是不含血清（例如胎牛血清（FBS)、小 牛血清、馬血清、山羊血清、人類血清等）的培養基且一般通過字母SFM表示。熟練的業內人 士熟悉的示例性但非限制性無血清培養基包括HuMEC基礎無血清培養基、KNOCKOUT? CTStm 無外來物 ESC/iPSC 培養基、STEMPR0?-34SFM 培養基、STEMPROtm NSC 培養基、ESSENTIAL?-8 培養基、培養基254、培養基106、培養基131、培養基154、培養基171、培養基171、培養基 200、培養基 231、H印toZYME-SFM、人類內皮-SFM、G1BCO? FREESTYLE? 293 表達培養 基、培養基154CF/PRF、培養基154C、培養基154CF、培養基106、培養基200PRF、培養基131、 Essential?-6培養基、STEMPR0?-34培養基、GibC0?.星形膠質細胞培養基、AM V?;培 養基 cts?、AMiNOMAx? c-loo 基礎培養基、Aminomaxtm-II 完全培養基、CD forticho? 培養 基、CDCHO AGT 培養基、CHO-S-SFM 培養基、Gl BCO? FREESTYLE? CHO 表達培養基、CD 0PTICH0?培養基、CD CHO培養基、CDDG44培養基、SF-900?培養基、EXPI293?表達培養基、 LHC基礎培養基、LHC-8培養基、293SFM培養基、CD 293培養基、AEM生長培養基、PER. C6? 細胞培養基、AIM V?培養基、EXPIUFE?:培養基、角質細胞-SFM培養基、LHC培養基、 LHC-8培養基、LHC-9培養基和其任何衍生物或修改型。
[0084] 短語"無蛋白質"培養基是指不含蛋白質（例如無血清蛋白（如血清白蛋白或連 接因子）、營養蛋白（如生長因子）或金屬離子載體蛋白（如轉鐵蛋白、銅藍蛋白）等）的 培養基。優選地，如果存在肽，那麼肽是較小肽，例如二肽或三肽。優選地，長度為十肽或更 長的肽是存在於無蛋白質培養基中的胺基酸的不到約1 %、更優選地不到約0. 1 %、且甚至 更優選地不到約0.01%。
[0085] 如本文中所用的短語"低蛋白質"培養基是指僅含有低量蛋白質（通常是含有標 準量蛋白質的培養基（如補充有5%-10%血清的標準基礎培養基）中可見的總蛋白質的 量或濃度的不到約10%、不到約5%、不到約1%、不到約0.5%、或不到約0. 1% )的培養 基。
[0086] 如本文中所用的術語"動物來源的"物質是指完全或部分來源於動物來源的物質， 包括重組動物DNA或重組動物蛋白質DNA。優選的培養基不含有動物所需物質。
[0087] 術語"表達增強劑"一般是指用於補充根據目前所述實施例的培養基調配物的一 或多種液體（優選地水性）添加劑，所述添加劑經選擇以改進在根據目前所述實施例的瞬 時蛋白質表達系統中產生的所表達蛋白質的產量。所述術語涵蓋了影響細胞周期進程、抑 制細胞凋亡、減緩細胞生長和/或促進蛋白質產生的數種化合物中的任一或多者。在本發 明的情形下，術語"表達增強劑"一般是指加入到瞬時轉染系統中的任一或多種化合物，所 述一或多種化合物的存在增強或促進目標蛋白的表達高於在不存在所述表達增強劑下可 見的表達水平至少2倍到約10倍。適合與目前所述實施例一起使用的示例性表達增強劑 包括（但不限於）添加劑，如丙戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞碸（DMASO)、 包括半乳糖的糖、胺基酸混合物、或丁酸或上述的任何組合。每一特定表達增強劑的最佳濃 度可根據表達系統的個別特徵和使用者的需求變化，且對在給定實驗情境中構成任一或多 種表達增強劑的最佳濃度的要素的測定充分處於在所屬領域中具有普通技能水平的從業 者的範圍內。僅舉例來說，在一些實施例中，本發明的實踐中所用的丙戊酸（VPA)的最佳最 終濃度範圍可能在約0. 20mM到約25mM範圍內。更優選地，VPA的最終濃度可能在以下範圍 內：約 0. 25mM 到約 24mM、約 0. 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0. 30mM 到約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、 約 0. 40mM 到約 14mM、約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 I ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 到約 5mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 55mM 到約 3mM、 0. 6mM到約2mM或0. 75到約I. 5mM。在一些優選但非限制性的實施例中，本發明的實踐中所 用的VPA的最終濃度可能在約0. 15mM到約I. 5mM之間、在約0. 16mM到約I. 5mM之間、在約 0. 17mM到約I. 5mM之間、在約0. 18mM到約I. 5mM之間、在約0. 19mM到約I. 5mM之間、在約 0. 20mM到約I. 5mM之間、在約0. 25mM到約I. 5mM之間、在約0. 30mM到約I. 5mM之間、在約 0. 40mM到約I. 5mM之間、在約0. 50mM到約I. 5mM之間、在約0. 60mM到約I. 5mM之間、在約 0. 70mM到約I. 5mM之間、在約0. 80mM到約I. 5mM之間、在約0. 90mM到約I. 5mM之間或在約 0. IOmM到約I. 5mM之間。在一些優選但非限制性的實施例中，本發明的實踐中所用的VPA 的最終濃度可能在約約〇. 20到約I. 5mM之間、在約0. 21到約I. 4mM之間、在約0. 22到約 1. 4mM之間、在約0. 23到約I. 4mM之間、在約0. 24到約I. 4mM之間、在約0. 25到約I. 3mM 之間、在約0. 25到約I. 2mM之間、在約0. 25到約I. ImM之間或在約0. 25到約I. OmM之間。
[0088] 在其它實施例中，本發明的實踐中所用的丙酸鈉（NaPP)的最佳最終濃度可能在 約0. 2mM到約IOOmM範圍內。在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終濃度可 能在以下範圍內：約〇. 5到約80mM、約0. 4mM到約70mM、約0. 5mM到約60mM、約0. 6mM到約 50mM、約 0. 7mM 到約 40mM、約 0. 8mM 到約 30mM、約 0. 9mM 到約 20mM、約 ImM 到約 15mM、約 2mM 到約10mM、約3mM到約9mM、約4mM到約8mM或約5mM到約7mM。在某些優選但非限制性的 實施例中，NAPP的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約 2mM到約3mM、約3mM到約4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM至Ij 約8mM、約8mM到約9mM或約9mM到約10mM。在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的 最佳最終濃度可能是約lmM、約I. 5mM、約2mM、約2. 5mM、約3mM、約3. 5mM、約4mM、約4. 5mM、 約 5mM、約 5. 5mM、約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 IOmM0
[0089] 在其它實施例中，本發明的實踐中所用的乙酸鋰（LiAc)的最佳最終濃度可能在 以下範圍內：約0. 25到約25mM、約0. 26mM到約20mM、約0. 27mM到約15mM、約0. 28mM到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM到約2. 5mM、約ImM到約3mM、約I. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0090] 在其它實施例中，本發明的實踐中所用的丁酸的最佳最終濃度可能在以下範圍 內：約 0. 25 到約 25mM、約 0. 26mM 到約 20mM、約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 至Ij 約2. 5mM、約ImM到約3mM、約I. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0091] 根據本發明使用的表達增強劑可在即將轉染之前或在轉染之後在收穫細胞和所 表達的蛋白質之前加入到培養基中。在下文描述的一些特定但非限制性實施例中，"增強劑 1" 一般是指0. 25mM-lmM丙戊酸，且"增強劑2" 一般是指丙酸鈉。然而，如果另外 指示，那麼術語增強劑1和增強劑2可涵蓋不同增強劑化合物。表達增強劑可依序或以混 合物形式加入到培養基中。
[0092] 如本文中所用的術語"載體"打算指能夠運輸其已連接的另一種核酸的核酸分子。 一種類型的載體是"質粒"，其是指可接合其它DNA區段的環狀雙鏈DNA。另一種類型的載 體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區段可接合到病毒基因組 中。某些載體能夠在其被引入到其中的宿主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起點的細 菌載體和游離型哺乳動物載體）。其它載體（例如非游離型哺乳動物載體）當引入到宿主 細胞中時可整合到宿主細胞的基因組中，且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能 夠引導其可操作地連接的基因的表達。此類載體在本文中被稱為"重組表達載體"（或簡單 地說是"表達載體")。一般來說，用於重組DNA技術中的表達載體通常呈質粒形式。在本說 明書中，"質粒"和"載體"可以可互換地使用，這是由於質粒是最常用的載體形式。根據本 文中所述的本發明實踐使用的某些載體可為在所屬領域中所用的熟知載體，如PCDNA 3. 3 或其修飾型。可適於本發明實踐的載體修飾類型的非限制性實例包括（但不限於）修飾， 如加入一或多種增強子、一或多種啟動子、一或多種核糖體結合位點、一或多種複製起點等 的修飾。在某些優選但非限制性的實施例中，且本發明的實踐中所用的表達載體可包括一 或多種經選擇以改進所關注蛋白質在本發明瞬時表達系統中的表達的增強子元件。所選增 強子元件可位於用於表達所關注蛋白質的可表達的核酸序列的5'或3'。尤其優選但非限 制性的增強子元件是土拔鼠肝炎轉錄後調節元件（WPRE)。
[0093] 如本文中所用，短語"含有能夠產生所表達蛋白質的基因序列的表達載體"通常是 指如上所定義的載體，其除了一或多種支持其在細胞或無細胞表達系統中表達所需的核酸 序列或元件之外還能夠容納具有所需所關注蛋白質的至少一個開放閱讀框架的可表達的 核酸序列。可存在於如本文中所定義的表達載體中的所述其它核酸序列或元件可包括一 或多種啟動子序列、一或多種增強子元件、一或多種核糖體結合位點、一或多種翻譯起始序 列、一或多種複製起點或一或多種可選擇標記物。服務這一目的的多種核酸序列或元件為 熟練的業內人士所熟悉，且選擇其中一或多種用於本發明的實踐充分處於熟練的從業者的 範圍內。
[0094] 如本文中所用的術語"多核苷酸"和"核酸"是指任何核酸，包括脫氧核糖核 酸（DNA)和核糖核酸（RNA)。在優選實施例中，"核酸"是指DNA(包括基因組DNA、互補 DNA(cDNA))和寡核苷酸（包括寡DNA)。在某些優選但非限制性的實施例中，"核酸"是指 基因組DNA和/或cDNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基 和/或其類似物、或可通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應併入到聚合物中的任何底物。 多核苷酸可包含經修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和其類似物。如果存在，那麼可在聚合物 組裝之前或之後賦予對核苷酸結構的修飾。核苷酸的序列可間雜有非核苷酸組分。多核苷 酸可包含在合成之後進行的修飾，如與標籤結合。其它類型的修飾包括例如"蓋"；一或多 個天然存在的核苷酸經類似物取代；核苷酸修飾，如具有不帶電鍵（例如甲基膦酸酯、磷酸 三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等）和具有帶電鍵（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的 修飾，含有側接部分、如蛋白質（例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等）的修飾， 具有嵌入劑（例如吖啶、補骨脂素等）的修飾，含有螯合劑（例如金屬、放射性金屬、硼、氧 化金屬等）的修飾，含有烷基化劑的修飾，具有經修飾的鍵（例如α異頭核酸等）的修飾， 以及多核苷酸的未經修飾形式。此外，通常存在於糖中的任何羥基可例如被膦酸酯基、磷酸 酯基替代，被標準保護基保護，或活化以製備與額外核苷酸的額外鍵聯，或可結合於固體或 半固體支撐物。5'和3'末端OH可為經磷酸化或經1到20個碳原子的胺或有機封端基團 部分而取代。其它羥基也可衍生成標準保護基。多核苷酸還可含有所屬領域中通常已知的 核糖或脫氧核糖的類似形式，包括例如2' -0-甲基_、2' -0-烯丙基_、2' -氟基-或2' -疊 氮基-核糖、碳環糖類似物、α-異頭糖、差向異構糖（如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖）、吡喃 糖、呋喃糖、景天庚糖、非環狀類似物和鹼基核苷類似物（例如甲基核糖苷）。一或多個磷 酸二酯鍵可被替代性連接基團替代。這些替代性連接基團包括（但不限於）其中磷酸酯基 被P (0) S ( "硫代酸酯基"）、P (S) S ( "二硫代酸酯基"）、（0) NR2 ("醯胺化物"）、P (0) R、P (0) OR'、CO或CH2 ( "甲縮醛"）替代的實施例，其中每個R或R'獨立地是H或任選地含有醚 (-〇-)鍵的經取代或未經取代的烷基（1-20C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基、或芳烷基。多 核苷酸中所有的鍵不需要都一致。前面描述適用於本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA 和 DNA。
[0095] 如本文中所用的"寡核苷酸"通常是指短的、通常是單鏈的、通常是合成多核苷酸， 其通常（但不必）長度不到約200個核苷酸。術語"寡核苷酸"和"多核苷酸"並非相互排 斥。以上關於多核苷酸的描述同樣且完全適用於寡核苷酸。
[0096] 如本文中所用，短語"第一時間段"當用於根據本文中所述的本發明方法瞬時轉染 細胞的方法的情形時通常是指在細胞群體經可表達的核酸轉染與一或多種表達增強劑加 入到經轉染的細胞中之間的時間間隔。第一時間段通常將在約2小時到約4天範圍內。在 某些優選但非限制性的實施例中，第一時間段可能在以下範圍內：約3到約90小時、約4到 約85小時、約5到約80小時、約6到約75小時、約7到約70小時、約8到約65小時、約9 到約60小時、約10到約55小時、約11到約50小時、約12到約45小時、約13到約40小 時、約14到約35小時、約15到30小時、約16到約24小時、約17到約24小時、約18到約 24小時、約19到約24小時、約20到約24小時、約21到約24小時、約22到約24小時或 約23到約24小時。在其它優選非限制性實施例中，第一時間段可能高達約15小時、高達 約16小時、高達約17小時、高達約18小時、高達約19小時、高達約20小時、高達約21小 時、高達約22小時、高達約23小時、高達約24小時、高達約25小時、高達約26小時、高達 約27小時、高達約28小時、高達約29小時或高達約30小時。
[0097] 如本文中所用，短語"第二時間段"當用於根據本文中所述的本發明方法瞬時轉染 細胞的方法的情形時通常是指在加入一或多種表達增強劑與或者加入一或多種其它增強 劑或者收穫經轉染的細胞並對其中表達的蛋白質進行純化或分離之間的時間間隔。第二時 間段通常將在約10小時到約10天範圍內，但其它時間間隔在確定對於所表達蛋白質最佳 時可以使用。在一些優選但非限制性的實施例中，第二時間段可能在以下範圍內：2小時到 5天、2. 5小時到4天、約3到約90小時、約4到約85小時、約5到約80小時、約6到約75 小時、約7到約70小時、約8到約65小時、約9到約60小時、約10到約55小時、約11到 約50小時、約12到約45小時、約13到約40小時、約14到約35小時、約15到30小時、約 16到約24小時、約17到約24小時、約18到約24小時、約19到約24小時、約20到約24 小時、約21到約24小時、約22到約24小時或約23到約24小時。在其它優選非限制性實 施例中，第一時間段可能高達約15小時、高達約16小時、高達約17小時、高達約18小時、 高達約19小時、高達約20小時、高達約21小時、高達約22小時、高達約23小時、高達約24 小時、高達約25小時、高達約26小時、高達約27小時、高達約28小時、高達約29小時或高 達約30小時。
[0098] 如本文中所用，短語"第三時間段"當用於根據本文中所述的本發明方法瞬時轉染 細胞的方法的情形時通常是指在加入至少一種第一表達增強劑與至少一種第二表達增強 劑之間的時間間隔。在加入第一與第二表達增強劑之間的時間間隔可為約數秒到數天，但 在一些實施例中，所述第一和第二表達增強劑可基本上同步加入，或可任選地以單一調配 物形式提供。
[0099] 如本文中所用，術語"複合反應"、"複合培養基"等通常是指其中核酸與轉染試劑 調配物複合的生理上可接受的培養基或反應。通常，被引入到細胞中以便表達蛋白質的核 酸首先與適合的轉染試劑（如陽離子脂質調配物）複合成脂質/核酸複合物或聚集體。 [0100] "過渡元素"或"過渡金屬"（其可互換使用）意指內部電子價殼層而非外部殼層 僅經部分填充的元素，使得所述元素充當給定系列元素中最多與最少正電性之間的過渡連 接。過渡元素的特徵通常在於高熔點、高密度、高偶極或磁力矩、多價以及能夠形成穩定絡 合離子。適用於本發明的所述過渡元素的實例包括鈧（Sc)、鈦（Ti)、釩（V)、鉻（Cr)、錳 (Mn)、鐵（Fe)、鈷（Co)、鎳（Ni)、銅（Cu)、鋅（Zn)、釔（Y)、鋯（Zr)、鈮（Nb)、鑰（Mo)、鎝（Tc)、 銣（Ru)、銠（Rh)、鈀（Pd)、銀（Ag)、鎘（Cd)、鑭（La)、鉿（Hf)、鉭（Ta)、鎢（W)、錸（Re)、鋨 (Os)、銥（Ir)、鉬（Pt)、金（Au)、汞（Hg)以及錒（Ac)。特別令人感興趣的是用於培養基組 合物的過渡元素（包括本發明的那些）是鐵的離子、螯合物、鹽以及絡合物（Fe 2+或Fe3+)。 [0101] 多種技術和試劑可用於將大分子在稱為"轉染"的過程中引入到目標細胞中。常用 試劑包括例如磷酸鈣、DEAE-葡聚糖以及脂質。關於使用這些類型試劑的詳細方案的實例， 許多參考文獻文本可用於實例，當前分子生物學方案（Current Protocols in Molecular Biology),第9章，奧斯貝（Ausubel)等人編，約翰威利父子公司（John Wiley and Sons)，1998。轉染細胞的其它方法在所屬領域中是已知，且可包括電穿孔（基因電轉移）、 聲孔作用、光學轉染、原生質體融合、刺穿感染（impalefection)、磁性轉染或病毒轉導。
[0102] "用於將大分子引入到細胞中的試劑"或"轉染試劑"是所屬領域的技術人員已 知有助於大分子進入到細胞中的任何物質、調配物或組合物。舉例來說，參見美國專利第 5, 279,833號。在一些實施例中，試劑可為"轉染試劑"且可為增加一或多種核酸攝取到 一或多種目標細胞中的任何化合物和/或組合物。所屬領域的技術人員已知多種轉染試 齊U。適合的轉染試劑可包括（但不限於）一或多種化合物和/或組合物，其包含陽離子聚 合物（如聚乙二亞胺（PEI))、帶正電荷胺基酸的聚合物（如聚賴氨酸和聚精氨酸）、帶正電 荷樹枝狀聚合物和斷裂的樹枝狀聚合物、含有陽離子β_環糊精的聚合物（CD-聚合物）、 DEAE-葡聚糖等。在一些實施例中，用於將大分子引入到細胞中的試劑可包含一或多種可為 陽離子脂質和/或中性脂質的脂質。優選的脂質包括（但不限於）氯化N-[I-(2, 3-二油醯 基氧基）丙基]-N，N，N-三甲銨（DOTMA)、二油醯基磷脂醯膽鹼（DOPE)、1，2-雙（油醯基氧 基）-3-(4'_三甲銨基）丙烷（DOTAP)、1，2-二油醯基-3-(4'-三甲銨基）丁醯基-sn-甘 油（D0TB)、1，2-二油醯基-3-琥珀醯基-sn-甘油膽鹼酯（D0SC)、（4'_三甲銨基）丁酸 膽固醇酯（ChoTB)、溴化十六烷基三甲銨（CTAB)、溴化1，2-二油醯基-3-二甲基-羥乙銨 (DORI)、溴化1，2-二油醯基氧基丙基-3-二甲基-羥乙銨（DORIE)、溴化1，2-二肉豆蘧氧 基丙基-3-二甲基-羥乙銨（DMRIE)、氯化雙十二烷基-N-[對（2-三甲氨基乙氧 基）苯甲醯基]-N，N，N-三甲銨、結合於一或多種脂質的精胺（例如5-羧基精胺基甘氨酸雙 十八烷基醯胺（DOGS)、N，N 1，N11，Nin-四甲基-N，N1，N11，N in-四棕櫚基精胺（TM-TPS)和二棕 櫚醯基磷脂醯基乙醇胺5-羧基精胺基醯胺（DPPES))、脂聚賴氨酸（結合於DOPE的聚賴氨 酸）、TRIS(三（羥甲基）氨基甲烷，氨基丁三醇）結合的脂肪酸（TFA)和/或肽，如三賴氨 醯基-丙氨醯基-TRIS單-、二-和三-棕櫚酸酯、（3 β - [N- (Ν'，Ν' -二甲氨基乙烷）-氨 基甲醯基]膽固醇（DC-Chol)、氯化Ν_( α -三甲氨基乙醯基）_雙十二烷基-D-穀氨酸酯 (TMAG)、溴化二甲基雙十八烷銨（DDAB)、三氟乙酸2, 3-二油醯基氧基-N-[2 (精胺-甲醯胺 基）乙基]-Ν，N-二甲基-1-丙銨（DOSPA)和其組合。
[0103] 所屬領域的技術人員將理解上述脂質的某些組合已展示出尤其適於將核酸引入 到細胞中，例如DOSPA與DOPE的3:1 (w/w)組合以商標名LIPOFECTAMINE?購自加利福尼 亞州卡爾斯巴德的生命技術公司（Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif·)， DOTMA與DOPE的I: I (w/w)組合以商標名LIPOFECTIN?,購自加利福尼亞州卡爾 斯巴德的生命技術公司，DMRIE與膽固醇的1:1 (M/M)組合以商標名DMRIE-C試劑購自加 利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司，TM-TPS與DOPE的1:1. 5(M/M)組合以商標名 CellFECTIN?購自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司，且DDAB與DOPE的 1:2. 5(w/w)組合以商標名LipfectACE?,購自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公 司。除了上述脂質組合之外，包含脂質與其它化合物的摻合物、具體來說與包含核定位序列 的肽和蛋白質的摻合物的其它調配物是所屬領域的技術人員已知的。舉例來說，參見國際 申請第PCT/US99/26825號，作為WO 00/27795公開，其兩者都以引用的方式併入本文中。
[0104] 已發現脂質聚集體（如脂質體）適用作將大分子傳遞到細胞中的試劑。具體來說， 已證實包含一或多種陽離子脂質的脂質聚集體在將陰離子大分子（例如核酸）傳遞到細胞 中時極其有效。一種常用陽離子脂質是氯化N-[l-(2,3-二油醯基氧基）丙基]-N，N，N-三 甲銨（DOTMA)。包含單獨DOTMA或與二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE)的1:1混合物的脂質體 已被用於將核酸引入到細胞中。D0TMA:D0PE的1:1混合物可以商標名LIP0FECTIN?購自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司。已用於將核酸引入到細胞中的另一種陽離子脂 質是1，2-雙（油醯基氧基）-3-3-(三甲銨基）丙烷（DOTAP)。DOTAP與DOTMA的不同之處 在於油醯基部分在DOTAP中經由醚鍵鍵聯到丙胺主鏈，而其在DOTMA中是經由酯鍵鍵聯的。 DOTAP被認為更易於被目標細胞降解。其中三甲銨部分的一個甲基經羥乙基替代的結構上 相關的化合物組在結構上與磷脂酶A的羅森塔爾抑制劑（Rosenthal inhibitor, RI)類似 (參見羅森塔爾等人，（I960)生物化學雜誌（J. Biol. Chem. )233:2202-2206)。RI具有鍵 聯到丙胺核心的硬脂醯基酯。RI的二油醯基類似物通常簡稱為D0R1-醚和D0R1-酯，取決 於脂質部分與丙胺核心的鍵聯。羥乙基部分的羥基可進一步例如通過酯化成羧基精胺來衍 生。
[0105] 已用於將大分子引入到細胞中的另一類化合物包含與脂質連接的羧基精胺部分 (參見貝爾（Behr)等人，（1989)美國國家科學院院刊（Proceedings of the National Academy of Sciences, USA) 86:6982-6986 和 EPO 0394111)。這類化合物的實例包括二 軟脂醯基磷脂醯乙醇胺5-羧基精胺基醯胺（DPPES)和5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基 醯胺（DOGS)。DOGS可以商標名TRANSFECTAM?購自威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司 (Promega, Madison, Wis.) 〇
[0106] 膽固醇的陽離子衍生物（3 β - [N-- (Ν'，Ν' -二甲氨基乙烷）-氨基甲醯基]膽固 醇，DC-Chol)已經合成且與DOPE-起調配到脂質體中（參見高（Gao)等人，（1991)BBRC 179 (1) : 280-285)且用於將DNA引入到細胞中。由此調配的脂質體據報導有效地將DNA以 低細胞毒性水平引入到細胞中。通過將聚賴氨酸結合於DOPE所形成的脂聚賴氨酸（參見 周（Zhou)等人，（1991)BBA 1065:8-14)據報導在將核酸在血清存在下引入到細胞中時有 效。
[0107] 已用於將核酸引入到細胞中的其它類型的陽離子脂質包括高度填充聚陽離子銨、 鋶和鱗脂質，如美國專利第5, 674, 908號和第5, 834, 439號和國際申請第PCT/US99/26825 號（作為WO 00/27795公開）中所述的那些。根據本發明一種尤其優選但非限制性的用 於傳遞大分子的轉染試劑是購自生命技術公司的LIP0FECTAMINE 2000? (參見美國國際申 請第PCT/US99/26825號，作為WO 00/27795公開）。適於將大分子傳遞到細胞中的另一種 優選但非限制性轉染試劑是EXPIFECTAMINE?。其它適合的轉染試劑包括LI0FECTAMINE? RNAiMAX、LIPOFECTAMINE? LTX、0LIG0FECTAMINE?、Cellfectin?、INVIV0FECTAMINE?、 INVIVOFECTAMINE? 2.0以及楊（Yang)等人的美國專利申請公開第2012/0136073號中所 公開的任何脂質試劑或調配物（所述公開以引用的方式併入本文中）。多種其它轉染試劑 是熟練的業內人士已知的且可針對其對於本文中所述的瞬時轉染系統和方法的適合性進 行評估。
[0108] 本發明是針對一種高產量瞬時轉染系統，其支持（a)將至少一種大分子（優選地 是可表達的核酸分子）引入到培養物中的真核細胞中，（b)培育其中已引入至少一種大分 子的細胞，以及任選地（c)在其中已引入至少一種大分子的細胞中產生重組蛋白產物或表 達核酸，其中含有大分子的培養基並不需要在將至少一種大分子引入到細胞中之後以及在 培育並產生蛋白質產物或表達核酸之前從培養物中移出並用新鮮培養基更換。
[0109] 本發明的瞬時轉染系統、其根據本文中所描述方法的使用引起所關注蛋白質在細 胞培養系統中快速且可重現的高水平表達。通常，本發明瞬時轉染系統和方法能夠以在約 200 μ g蛋白質/L培養物到約2g蛋白質/L培養物範圍內的水平產生重組表達的蛋白質， 取決於所需重組蛋白的個別表達特徵和所用細胞類型。使用為本文提供的瞬時轉染系統和 方法，使用者可獲得超過目前使用標準可商購的瞬時轉染系統可獲得水平約2倍到高達約 20倍的所表達的蛋白質水平。使用為本文提供的瞬時轉染系統和方法，使用者可獲得與用 當代瞬時表達系統可見水平相比約2. 5倍、約3倍、約3. 5倍、約4倍、約4. 5倍、約5倍、約 5. 5倍、約6倍、約6. 5倍、約7倍、約7. 5倍、約8倍、約8. 5倍、約9倍、約9. 5倍或高達約 10倍或更大的所表達的蛋白質水平。舉例來說，使用本發明瞬時轉染系統來產生重組蛋白， 使用者可獲得比使用為在懸浮細胞中產生重組蛋白而優化的可商購的瞬時轉染系統（如 FREESTYLE?表達系統）獲得的蛋白質產量高在約2倍到約10倍之間的蛋白質產量。
[0110] 使用本發明的系統，所述系統除了其它要素之外包括至少一種高密度培養基、至 少一種被調適用於高密度生長的懸浮細胞群體、任選地一或多種表達載體、任選地一或多 種轉染試劑以及任選地一或多種表達增強劑，在已將至少一種大分子引入到至少一種細胞 中之後以及在其中已引入至少一種大分子的細胞被進一步培養以產生蛋白質產物或表達 核酸之前不必補給、更換或補充培養基。在本發明的系統中，培養基理想地是無血清培養基 和/或化學成分確定的培養基和/或無蛋白質或實質上低蛋白質培養基、和/或不含動物 來源組分的培養基、或具有這些特徵的組合的培養基。
[0111] 在本發明的一個非限制性方面，就將化合物或大分子（例如核酸）引入到培養物 中的細胞中來說，本發明的高產量培養基有助於與使用目前可用的瞬時轉染系統通常可獲 得的細胞轉染效率相比更高的細胞轉染效率。在本發明的另一個相關但非限制性方面，系 統還不需要以欲在轉染之後培養細胞的較小體積轉染細胞。在本發明的另一個相關但非限 制性方面，系統與目前可用的瞬時轉染系統相比有助於較高細胞存活率。在另一個相關但 非限制性方面，系統與目前可用的瞬時轉染系統相比有助於較高細胞密度（即每毫升培養 基細胞數）。在本發明的另一個相關但非限制性方面，系統與目前可用的瞬時轉染系統相 比有助於培養物中細胞的較高重組蛋白表達水平。優選地但未必地，相同體積的培養基可 用於將至少一種大分子引入到細胞中以及在不必更換、去除、補充或補給已發生細胞轉染 的培養基的情況下進行的後續培育。或者，將細胞分割或培養基體積增加不到約2倍、約5 倍、約8倍或約10倍。
[0112] 本發明的培養基、方法、試劑盒以及組合物打算用於引入至少一種大分子或在任 何體積的培養基中轉染並培養細胞。所述引入優選地以用於培養待轉染細胞的培養基的量 的0.1到10倍實現。優選地，細胞培養物體積大於約一毫升。更優選地，細胞培養物體積 是約200 μ 1到100升。更優選地，細胞培養物體積是約2ml到約50升，最優選地約5ml到 約5升。更優選地，細胞培養物體積是約IOOml到約50升。更優選地，細胞培養物體積是 約500ml到約50升。更優選地，細胞培養物體積是約500ml到約25升。更優選地，細胞培 養物體積是約500ml到約10升。更優選地，細胞培養物體積是約500ml到約5升。更優選 地，細胞培養物體積是約500ml到約1升。
[0113] 在本發明的培養基、方法、試劑盒以及組合物中，培養基任選地不含可幹擾大分子 引入或轉染的化合物，例如聚陰離子化合物，如聚磺酸化和/或聚硫酸化的化合物。優選 地，培養基不含硫酸葡聚糖。
[0114] 本發明的培養基、方法、試劑盒以及組合物允許在不需要更換培養基的情況下將 化合物或大分子（尤其是大分子，例如核酸、蛋白質以及肽）引入到所培養的細胞中（例如 通過轉染進行）。在一個優選實施例中，本發明提供一種用於培育和轉染真核細胞的培養 基。
[0115] 使用本發明的培養基、方法、試劑盒以及組合物，所屬領域的技術人員可以將大分 子或化合物（例如核酸）引入到培養物中的細胞中。優選地，大分子或化合物（例如核酸） 被引入到至少約20%細胞中。更優選地，大分子或化合物（例如核酸）被引入到約20%到 約100%細胞中。更優選地，大分子或化合物（例如核酸）被引入到約30%到約100%細 胞中。更優選地，大分子或化合物（例如核酸）被引入到約50%到約100%細胞中。實際 上，大分子或化合物可被引入到約20%到約90%細胞、約20%到約80%細胞、約30%到約 60%、70%、80%或90%細胞、約20%、30%、40%或50%到約70%、75%、80%、85%、90%、 95%或98%細胞等中。甚至約60%、70%、75%或80%到約90%或接近100%的細胞可含 有所引入的分子或化合物。
[0116] 在本發明的培養基、方法、試劑盒以及組合物的優選實施例中，一或多種非所需組 分（即，一或多種血清組分、一或多種成分不確定的組分、一或多種蛋白質組分和/或一或 多種動物來源的組分）已經一或多種替代化合物在一或多種功能方面取代或替代。本發明 的替代化合物可任選地包括一或多種結合金屬的化合物和/或一或多種過渡元素絡合物， 所述絡合物包含與一或多種結合金屬的化合物絡合的一或多種過渡元素或其鹽或離子。優 選地，培養基能夠在不存在一或多種天然來源金屬載體（如轉鐵蛋白或其它動物來源蛋白 質或提取物）的情況下支持細胞體外培育。結合金屬的化合物可在將結合金屬的化合物加 入到培養基中之前與過渡金屬絡合。在其它實施例中，結合金屬的化合物在將結合金屬的 化合物加入到培養基中之前不與過渡金屬絡合。優選地，本發明的培養基不含轉鐵蛋白和 /或不含胰島素。
[0117] 本發明還涉及通過將培養基與一或多種替代化合物組合而獲得的細胞培養基。優 選地，培養基可為無血清培養基和/或化學成分確定的培養基和/或無蛋白質或低蛋白質 培養基和/或可為缺乏動物來源組分的培養基。培養基優選地不含轉鐵蛋白和/或不含胰 島素。在一些優選實施例中，培養基可能夠支持細胞體外培育和/或可允許將大分子引入 到細胞中。在一些實施例中，一或多種替代化合物可為結合金屬的化合物和/或可為過渡 元素絡合物，所述絡合物包含與至少一種結合金屬的化合物絡合的至少一種過渡元素或其 鹽或離子。優選的用於本發明這一方面的過渡元素、結合金屬的化合物以及過渡元素絡合 物包括本文中詳細地描述的那些。
[0118] 本發明的替代化合物可有助於過渡金屬傳遞到體外培養的細胞中。在優選實施例 中，替代化合物可傳遞鐵並替代轉鐵蛋白。優選的替代化合物是羥基吡啶衍生物。優選地， 羥基吡啶衍生物選自由以下各項組成的群組：2_羥基吡啶-N-氧化物、3-羥基-4-吡喃酮、 3-羥基哌吡啶-2-酮、3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基吡啶-4-酮、1-羥基吡啶-2-酮、1，2-二 甲基-3-羥基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基-2 (IH)-吡啶酮、和吡哆醛 異菸鹼基腙、菸鹼酸-N-氧化物、2-羥基-菸鹼酸。最優選地，羥基吡啶衍生物是2-羥基吡 啶-N-氧化物。
[0119] 本發明的替代化合物可與任何培養基一起使用，包括用於培育或生長真核和/或 原核細胞、組織、器官等的培養基。所述培養基包括（但不限於）CD F0RTICH0?培養基、 Expi293?表達培養基、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最小必需培養基（MEM)、基礎培養基伊格爾（Basal Medium Eagle，BME)、 RPMI-1640、漢姆氏F-10(Ham's F-10)、漢姆氏F-12、α最小必需培養基（αΜΕΜ)、格拉斯 哥氏最小必需培養基（Glasgow's Minimal Essential Medium，G-MEM)和伊斯科夫氏改 良杜爾貝科氏培養基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)。可商購的（例如 來自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司）或所屬領域中另外已知的其它培養基可 根據本發明等效地使用，包括（但不限於）293SFM、⑶-CHO培養基、VP SFM、BGJb培養基、 布林斯特氏BM0C-3培養基（Brinster' s BM0C-3medium)、細胞培養冷凍培養基、CMRL培 養基、EHAA培養基、eRDF培養基、費舍爾氏培養基（Fischer's medium)、網堡氏B-5培養 基（Gamborg' s B-5medium)、GLUTAMAX?補充培養基、格雷斯氏昆蟲細胞培養基（Grace's insect cell media)、HEPES 緩衝培養基、裡克特氏改良 MEM(Richter's modified MEM)、 IPL-41昆蟲細胞培養基、萊博維茨氏L-15培養基（Leibovitz's L-15media)、麥考伊氏5A 培養基（McCoy's 5A media)、MCDB 131培養基、培養基199、改良伊格爾培養基（Modified Eagle's Medium，MEM)、培養基 NCTC-109、施奈德氏果妮培養基（Schneider's Drosophila medium)、TC-100 昆蟲培養基、威茅斯氏MB 752/1 培養基（Waymouth' s MB 752/lmedia)、威 廉氏培養基E (William's Media E)、無蛋白質雜交瘤培養基II (PFHM II)、AIM V培養基、 角質細胞SFM、成分確定的角質細胞SFM、STEMPRO? SFM、STEMPRO?完全甲 基纖維素培養基、HepatoZYME-SFM、Neurobasal?培養基、神經基質-A培養基、Hibernate. TM. A培養基、Hibernate E培養基、內皮SFM、人類內皮SFM、雜交瘤SFM、PFHM II、Sf 900 培養基、Sf 900TI SFM、EXPRESS FIVE? 培養基、CHO-S-SFM、AMINOMAX-II 完全培養 基、AMIN0MAX-C100完全培養基、AMINOMAX-C 100基礎培養基、PB-ΜΑΧ?核型分析培養基、 KARY0MAX骨髓核型分析培養基、KNOCKOUT D-MEM和CO2非依賴性培養基。以上培養基從所 屬領域的技術人員已知的製造商獲得，如JRH、西格瑪公司（Sigma)、海克隆公司（HyClone) 和拜奧惠特克公司（BioWhittaker)。適用於本發明的實踐的培養基的其它實例可見於美國 專利第5, 135, 866號和第5, 232, 848號以及國際公開第WO 88/02774號、第WO 98/15614 號、第WO 98/08934號和歐洲專利第0282942號，所述專利的全文特別地以引用的方式併入 本文中。
[0120] 本發明還提供了一種用於將大分子引入到細胞中的方法，其包含在本發明的培養 基中培養細胞且使培養基中的細胞與一或多種大分子在使得大分子被一或多種細胞吸收 的條件下接觸。優選地，培養基是無血清培養基和/或化學成分確定的培養基和/或無蛋 白質或低蛋白質培養基和/或可為缺乏動物來源組分的培養基。優選的細胞包括真核細 胞。更優選地，細胞是哺乳動物細胞。培養基可包含一或多種替代化合物且優選地不含轉 鐵蛋白和/或不含胰島素。在一些優選實施例中，培養基允許細胞在相同培養基中生長和 轉染。在一些實施例中，大分子可包含一或多種核酸，且使得核酸分子被細胞吸收的條件包 括使核酸與會引起核酸被引入到一或多種細胞中的試劑接觸。
[0121] 本發明還提供了一種包含本發明的培養基和細胞的組合物。優選地，培養基是無 血清培養基和/或化學成分確定的培養基和/或無蛋白質或低蛋白質培養基和/或缺乏動 物來源組分的培養基。優選的細胞包括真核細胞。更優選地，細胞是哺乳動物細胞。最優 選的是來源於293成纖維細胞的懸浮細胞。培養基可包含一或多種替代化合物且優選地不 含轉鐵蛋白和/或不含胰島素。優選地，培養基支持細胞在相同培養基中生長和轉染，更優 選地，培養基支持表達重組蛋白的哺乳動物細胞的生長和培育，其中所述培養基並不必在 出於產生重組蛋白的目的引入其中可表達的核酸之後進行補給、更換或另外補充。
[0122] 本發明還提供了包含本發明的培養基和一或多種用於將大分子引入到一或多種 細胞中的試劑的組合物。優選地，培養基是無血清培養基和/或化學成分確定的培養基和 /或無蛋白質或低蛋白質培養基和/或缺乏動物來源組分的培養基。培養基可包含一或多 種替代化合物且優選地不含轉鐵蛋白和/或不含胰島素。優選地，培養基含有轉染試劑且 大分子是核酸。大分子還可為蛋白質和/或肽。在一些實施例中，試劑包含一或多種脂質， 其中一或多種可為陽離子脂質。更優選地，試劑包含中性和陽離子脂質的混合物。在一些 實施例中，試劑包含一或多種肽和/或蛋白質，其可單獨或與一或多種脂質摻合提供。
[0123] 本發明還提供了包含本發明的培養基和待引入到細胞中的一或多種大分子的組 合物。優選地，培養基是無血清培養基和/或化學成分確定的培養基和/或無蛋白質或低蛋 白質培養基和/或缺乏動物來源組分的培養基。培養基可包含一或多種替代化合物且優選 地不含轉鐵蛋白和/或不含胰島素。大分子可為例如核酸和/或蛋白質和/或肽，且可為 非複合的或可呈與一或多種用於將大分子引入到細胞中的試劑的複合物的形式。優選地， 大分子是核酸且可呈與一或多種轉染試劑的複合物形式。
[0124] 本發明還提供了一種組合物，其包含至少一種選自由以下各項組成的群組的組分 (或其組合）：本發明的培養基、至少一種細胞、至少一種大分子、至少一種用於將至少一種 大分子引入到至少一種細胞中的試劑。優選地，細胞是真核細胞。更優選地，細胞是哺乳動 物細胞。優選地，培養基是無血清培養基和/或化學成分確定的培養基和/或無蛋白質或 低蛋白質培養基和/或缺乏動物來源組分的培養基。培養基可包含一或多種替代化合物且 優選地不含轉鐵蛋白和/或不含胰島素。在一些優選實施例中，試劑是轉染試劑且大分子 是核酸，例如RNA和/或DNA。或者，大分子是蛋白質和/或肽。
[0125] 在一些實施例中，試劑包含一或多種脂質，其中一或多種可為陽離子脂質。更優選 地，試劑包含中性和陽離子脂質的混合物。在一些實施例中，試劑包含一或多種肽和/或蛋 白質，其可單獨或與一或多種脂質摻合提供。在優選實施例中，試劑與大分子複合以將大分 子引入到細胞中。
[0126] 本發明還提供了用於培養和轉染細胞的試劑盒，其包含至少一個包含用於培養和 轉染細胞的培養基的容器。所述試劑盒還可包含至少一種選自由以下各項組成的群組的組 分（或其組合）：本發明的培養基、至少一種細胞、至少一種大分子、至少一種用於將至少一 種大分子引入到至少一種細胞中的試劑、至少一種緩衝液或緩衝鹽、以及關於使用試劑盒 來將至少一種大分子引入到至少一種細胞中的說明書。優選地，培養基是無血清培養基和 /或化學成分確定的培養基和/或無蛋白質或低蛋白質培養基和/或缺乏動物來源組分的 培養基。培養基可包含一或多種替代化合物且優選地不含轉鐵蛋白和/或不含胰島素和/ 或不含動物生長因子。培養基可包含一或多種可為結合金屬的化合物的替代化合物和/或 可包含一或多種包含一或多種替代化合物的絡合物。在一些實施例中，培養基可包含一或 多種絡合物，所述絡合物包含絡合一或多種可為結合金屬的化合物的替代化合物的一或多 種過渡元素或其鹽或離子。在一些實施例中，所述培養基能夠支持細胞體外培育且允許其 中培養的細胞的轉染。在一些實施例中，本發明的試劑盒可以進一步包含至少一個包含用 於轉染細胞的脂質的容器。在一些實施例中，本發明的試劑盒可包含至少一個包含核酸的 容器。
[0127] 根據本發明的一個方面，過渡元素優選地選自由以下各項組成的群組：鈧、鈦、釩、 鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、釔、鋯、鈮、鑰、鎝、銣、銠、鈀、銀、鎘、鑭、鉿、鉭、鎢、錸、鋨、銥、鉬、 金、汞和錒或其鹽或離子，且優選地是鐵鹽。適合的鐵鹽包括（但不限於）FeCl3、Fe(N03) 3 或FeSO4或含有Fe+++或Fe++離子的其它化合物。
[0128] 優選的替代化合物包括（但不限於）結合金屬的化合物。參見例如國際專利申請 第 PCT/US00/23580 號，公開第 WO 01/16294 號。
[0129] 本發明的結合金屬的化合物包括可與過渡元素相互作用或結合且有助於其被細 胞攝取的任何大分子。所述相互作用/結合的性質可為共價或非共價的。在本發明的這一 方面所用的結合金屬的化合物優選地選自由以下各項組成的群組：多元醇、羥基吡啶衍生 物、1，3, 5-Ν，Ν'，N〃-三（2, 3-二羥基苯甲醯基）氨基-甲苯、乙二胺-N，Ν' -四亞甲基磷酸、 翠蘇素（trisuccin)、酸性糖類（如葡萄糖酸亞鐵）、葡糖胺聚糖、二亞乙三胺五乙酸、菸鹼 酸-N-氧化物、2-羥基-菸鹼酸、單、雙、三取代的2, 2'-二吡啶、異羥肟酸鹽衍生物（如乙異 輕月虧酸）、胺基酸衍生物、去鐵胺、鐵草銨（ferrioxamine)、鐵基卩卜吩和其衍生物、DOTA-賴 氨酸、德卟啉（texaphyrin)、薩普卟啉（sapphyrin)、多氨基羧酸、α-輕基羧酸、聚乙烯氨 基甲酸鹽、乙基麥芽酚、3-羥基-2-吡啶和IRC011。在一個優選實施例中，結合金屬的化 合物是多元醇，如山梨糖醇或葡聚糖，且尤其是山梨糖醇。在一個相關實施例中，結合金屬 的化合物是羥基吡啶衍生物，如2-羥基吡啶-N-氧化物、3-羥基-4-吡喃酮、3-羥基哌吡 啶-2-酮、3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基吡啶-4-酮、1-羥基吡啶-2-酮、1，2-二甲基-3-羥 基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基-2 (IH)-吡啶酮、乙基麥芽酚或吡哆醛 異菸鹼基腙，且優選地是2-羥基吡啶-N-氧化物。在根據本發明這一方面的尤其優選實施 例中，過渡金屬絡合物可為山梨糖醇-鐵絡合物或2-羥基吡啶-N-氧化物-鐵絡合物。本 發明的結合金屬的化合物還可結合二價陽離子，如Ca++和Mg++。
[0130] 本發明涉及細胞培養基，其包含一或多種可為結合金屬的化合物的替代化合物且 進一步包含一或多種選自由以下各者組成的成分群組的成分：至少一種胺基酸（如L-丙氨 酸、L-精氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-穀氨酸、L-穀氨醯胺、甘氨酸、 L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲 氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-纈氨酸、N-乙醯基-半胱氨酸）、至少一種維生 素（如生物素、氯化膽鹼、D-Ca++-泛酸鹽、葉酸、i-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、硫胺或 維生素 B12)、至少一種無機鹽（如鈣鹽、CuS04、FeS04、Fe (NO3) 3、FeCl3、KC1、鎂鹽、錳鹽、乙 酸鈉、似(：1、似!10)3、似 2即04、似2504、硒鹽、矽鹽、鑰鹽、釩鹽、鎳鹽、錫鹽、211(：1 2、21^04或其它 鋅鹽）、腺嘌呤、乙醇胺、D-葡萄糖、一或多種細胞因子、肝素、氫化可的松、硫辛酸、酚紅、磷 酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘化甲腺氨酸、PLURONIC F68和胸苷。
[0131] 本發明的培養基可任選地包括一或多種緩衝劑。適合的緩衝劑包括（但不限於） N-[2-羥乙基]-哌嗪-Ν'- [2-乙磺酸](HEPES)、M0PS、MES、磷酸鹽、碳酸氫鹽和適用於細胞 培養應用的其它緩衝劑。適合的緩衝劑是提供緩衝能力而對所培養的細胞無實質性細胞毒 性的緩衝劑。對適合緩衝劑的選擇處於在細胞培養領域中具普通技能者的範圍內。
[0132] 根據本發明，適用於形成本發明細胞培養基的培養基可包含一或多種成分，且 可例如通過將一或多種選自由以下各項組成的群組的成分組合來獲得：腺嘌呤、乙醇胺、 D-葡萄糖、肝素、緩衝劑、氫化可的松、硫辛酸、酚紅、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘化甲 腺氨酸、胸苷、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-穀氨酸、 L-穀氨醯胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙 氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、N-乙醯基-半胱 氨酸、生物素、氯化膽鹼、D-Ca++-泛酸鹽、葉酸、i-肌醇、菸鹼醯胺、吡哆醇、核黃素、硫胺、維 生素 B12、Pluronic F68、重組胰島素、鈣鹽、CuS04、FeS04、FeCl3、Fe (NO3) 3、KCl、鎂鹽、錳鹽、 乙酸鈉、似(：1、似!10)3、似2即04、似250 4、硒鹽、矽鹽、鑰鹽、釩鹽、鎳鹽、錫鹽、211(：12、21^04或其 它鋅鹽,其中每一成分都以支持細胞體外培育的量加入。
[0133] 本發明還針對細胞培養基，其包含選自以下各者的成分：乙醇胺、D-葡萄糖、 HEPES、胰島素、亞油酸、硫辛酸、酚紅、PLURONIC F68、腐胺、丙酮酸鈉、轉鐵蛋白、L-丙氨酸、 L-精氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-穀氨酸、L-穀氨醯胺、甘氨酸、L-組 氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨 酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、生物素、氯化膽鹼、D-Ca++-泛酸鹽、葉酸、 i-肌醇、菸鹼醯胺、批咳醇、核黃素、硫胺、維生素 B12、一或多種鈣鹽、Fe(N03)3、KCl、一或多 種鎂鹽、一或多種錳鹽、NaCl、NaHC0 3、Na2HPO4、一或多種硒鹽、一或多種釩鹽和一或多種鋅 鹽，其中每一成分都以支持哺乳動物上皮細胞體外懸浮培育的量存在。本發明還針對此類 培養基，其可任選地進一步包含一或多種選自由以下各項組成的群組的補充劑：一或多種 細胞因子、肝素、一或多種動物肽、一或多種酵母肽和一或多種植物肽（最優選地是大米、 蘆薈、大豆、玉米、小麥、豌豆、南瓜、菠菜、胡蘿蔔、馬鈴薯、甘薯、木薯、鱷梨、大麥、椰子和/ 或綠豆和/或一或多種其它植物中的一或多者），例如參見國際申請第PCT/US97/18255號， 作為WO 98/15614公開。
[0134] 由本發明提供的培養基可為無蛋白質的，且可為IX調配物或濃縮成例如10X、 20X、25X、50X、10X、500X 或 1000X 培養基調配物。
[0135] 本發明的培養基還可以不同形式製備，如乾粉培養基（"0?1〇、顆粒狀製備物（其 需要加入水，但無其它處理，如調節pH)、液體培養基或呈培養基濃縮物形式。
[0136] 基礎培養基（即，僅適用於維持但不用於生長或產物產生的培養基）可包含多種 成分，包括胺基酸、維生素、有機和無機鹽、糖和其它組分，每一成分都以支持哺乳動物上皮 細胞體外培育的量存在。
[0137] 在本發明的培養基、方法、試劑盒以及組合物中，培養基可用於培養多種細胞。優 選地，培養基用於培養真核細胞。更優選地，培養基用於培養植物和/或動物細胞。更優 選地，培養基用於培養哺乳動物細胞、魚細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞或禽類細胞。更優 選地，培養基用於培養哺乳動物細胞。更優選地，培養基可用於培養哺乳動物細胞，包括原 代上皮細胞（例如角質細胞、頸椎上皮細胞、支氣管上皮細胞、氣管上皮細胞、腎臟上皮細 胞和視網膜上皮細胞）和建立的細胞系和其品系（例如293胚胎腎臟細胞、BHK細胞、HeLa 頸椎上皮細胞和PER-C6視網膜細胞、MDBK(NBL-I)細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、 CapT 細胞、CHO 細胞、BeWo 細胞、張氏細胞（Chang cell)、Detroit 562 細胞、HeLa 229 細 胞、HeLa S3 細胞、！fep-2 細胞、KB 細胞、LS180 細胞、LS174T 細胞、NCI-H-548 細胞、RPMI 2650 細胞、SW-13 細胞、T24 細胞、WI-28VA13、2RA 細胞、WISH 細胞、BS-C-I 細胞、LLC-MK2 細 胞、Clone M-3 細胞、1-10 細胞、RAG 細胞、TCMK-I 細胞、Y-I 細胞、LLC-PK1 細胞、PK (15)細 胞、GH1細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC 256細胞、MH1C1細胞、XC細胞、MDOK細胞、VSW細胞 和TH-I、Bl細胞或其衍生物）、來自任何組織或器官（包括（但不限於）心、肝、腎、結腸、 腸、食道、胃、神經組織（腦、脊髓）、肺、血管組織（動脈、靜脈、毛細管）、淋巴組織（淋巴腺 體、腺樣體、扁桃體、骨髓和血液）、脾）的成纖維細胞、以及成纖維細胞和成纖維細胞樣細 胞系（例如CHO細胞、TRG-2細胞、頂R-33細胞、Don細胞、GHK-21細胞、瓜氨酸血症細胞 (citrullinemia cell)、登普西細胞（Dempsey cell)、Detroit 551 細胞、Detroit 510 細 胞、Detroit 525 細胞、Detroit 529 細胞、Detroit 532 細胞、Detroit 539 細胞、Detroit 548 細胞、Detroit 573 細胞、HEL 299 細胞、頂R-90 細胞、MRC-5 細胞、WI-38 細胞、WI-26 細胞、MiCl1細胞、CHO細胞、CV-I細胞、COS-I細胞、C0S-3細胞、C0S-7細胞、Vero細胞、 DBS-FrhL-2 細胞、BALB/3T3 細胞、F9 細胞、SV-T2 細胞、M-MSV-BALB/3T3 細胞、K-BALB 細胞、 BL0-11細胞、N0R-10細胞、C3H/I0TI/2細胞、HSDM1C3細胞、KLN 2O5細胞、麥考伊細胞、小鼠 L 細胞、品系2071 (小鼠 L)細胞、L-M品系（小鼠 L)細胞、L-MTK_(小鼠 L)細胞、NCTC克隆 株2472和2555、SCC-PSAl細胞、Swiss/3T3細胞、印度麂細胞、SIRC細胞、C 11細胞和延森 細胞（Jensen cell)或其衍生物）。最優選地，培養基用於培養選自由以下各項組成的群組 的哺乳動物細胞：293細胞、293F細胞或其衍生物、PER-C6細胞或其衍生物、CHO細胞或其 衍生物、CapT細胞或其衍生物、C0S-7L細胞或其衍生物和Sp2/0細胞或其衍生物、或能夠以 如上所定義的高細胞密度培養的任何其它懸浮細胞系或衍生物。更優選地，培養基用於培 養293細胞或經修飾的293細胞系，其被專門調適用於在形成本發明基礎的細胞培養基中 最佳生長。在一些優選但非限制性方面，培養基用於懸浮培養細胞。
[0138] 通過本發明的培養基支持的細胞可來源於任何動物，優選地是哺乳動物，且最優 選地是小鼠或人類。在本發明培養基中培育的細胞可為正常細胞或異常細胞（即，經轉化 的細胞、建立的細胞或來源於患病組織樣品的細胞）。
[0139] 本發明還提供了使用本文中所公開的培養基調配物培育哺乳動物上皮或成纖維 細胞的方法，其包含（a)使細胞與本發明的細胞培養基接觸；和（b)在適於支持細胞培育的 條件下培育細胞。在一些實施例中，本發明的方法可任選地包括使所培養的細胞與包含一 或多種大分子（優選地包含一或多種核酸）的溶液在使得所述大分子中的一或多者引入到 所述細胞中的一或多者中的條件下接觸的步驟。優選地，根據這些方法培育的細胞（其可 包括上述細胞中的任一者）被懸浮培育。
[0140] 在一些方面，瞬時轉染和重組蛋白系統可包括適於所培養的哺乳動物細胞以在約 I X IO6到約20 X IO6個細胞/毫升範圍內、更優選地在約2 X IO6到約6 X IO6範圍內的密度 生長並繁殖的高密度培養基。任何培養基都可用於本發明的實踐，其條件是所用培養基能 夠維持哺乳動物細胞（優選地懸浮生長的細胞）以高達約2X IO7個細胞/毫升的密度生 長同時維持所述細胞超過約80%的存活率且此外維持所述懸浮細胞有效轉染並表達高量 重組蛋白的能力。本發明的實踐中所用的高密度培養基可在不同應用和用途之間變化，且 可能取決於所用細胞系、瞬時表達的所需蛋白質的性質、選擇用於將表達載體轉移到細胞 中的轉染模態的性質以及加入到如下文所述的系統中的任何表達增強劑的量和性質。儘管 如此，預期用於本發明瞬時表達系統和方法的優選的高密度培養基將通常是無血清、無蛋 白質的，允許懸浮細胞培育和生長到高達約2 X IO7個細胞/毫升、更通常在約2 X IO6個細 胞/毫升到約IX IO7個細胞/毫升之間的密度，且將進一步實現在瞬時表達系統中產生的 蛋白質產量超過至少200 μ g/mL細胞培養物到2mg/mL細胞培養物、更通常在約500 μ g/ml 細胞培養物到約lmg/mL細胞培養物之間。理想地，根據本發明使用的高密度培養基將有助 於細胞以在約IX IO6到約20X IO6個細胞/毫升、約2X IO6到約2X IO6個細胞/毫升、或 約2. 5 X IO6到約6 X IO6個細胞/毫升範圍內的密度轉染。
[0141] 適於本發明實踐的尤其優選的高密度生長培養基可為化學成分確定的培養基，其 中每一化學物質和其對應的量在其用於培養細胞之前是已知的。所選化學成分確定的培養 基可任選地在沒有化學物質未知和/或未經定量的細胞或組織溶解產物或水解產物的情 況下製得。
[0142] 在本發明的一些方面，對於本發明的實踐尤其適合的培養基類型是無血清培養 基（有時被稱為"SFM培養基"），其完全不含例如胎牛血清（FBS)、小牛血清、馬血清、山 羊血清、人類血清等。熟練的業內人士熟悉的示例性但非限制性無血清培養基包括HuMEC 基礎無血清培養基、KNOCKOUT? CTS?無外來物ESC/iPSC培養基、STEMPR0?-34SFM培養 基、STEMPRO? NSC培養基、ESSENTIAL?-8培養基、培養基254、培養基106、培養基131、 培養基154、培養基171、培養基171、培養基200、培養基231、H印toZYME-SFM、人類內 皮-SFM、G丨BCO? FREESTYLE? 293表達培養基、培養基154CF/PRF、培養基154C、培 養基 154CF、培養基 106、培養基 200PRF、培養基 131、Essential?-6 培養基、STEMPR0?-34 培養基、Gibco?.星形膠質細胞培養基、aim v?培養基CTS?、AMIN0MAX? C-100基礎培 養基、AmiNOMAXtm-II 完全培養基、CD F0RTICH0? 培養基、CD CHO AGT 培養基、CHO-S-SFM 培養基、Gi BCO?: FREESTYLE? CHO表達培養基、CD 0PTICH0?培養基、CD CHO培養基、 CD DG44培養基、SF-900?培養基、EXPI293?表達培養基、LHC基礎培養基、LHC-8培養基、 293SFM培養基、⑶293培養基、AEM生長培養基、PER. C6?細胞培養基、AM V?:培養基、 EXP丨LIFE?培養基、角質細胞-SFM培養基、LHC培養基、LHC-8培養基、LHC-9培養基 和其任何衍生物或修改型。
[0143] 在本發明的一些方面，對於本發明的實踐尤其適合的培養基類型是無蛋白質培養 基（有時被稱為"PFM培養基"），其完全不含蛋白質（例如無血清蛋白（如血清白蛋白或 連接因子）、營養蛋白（如生長因子）或金屬離子載體蛋白（如轉鐵蛋白、銅藍蛋白）等）。 優選地，如果存在肽，那麼肽是較小肽，例如二肽或三肽。優選地，長度為十肽或更長的肽是 存在於無蛋白質培養基中的胺基酸的不到約1%、更優選地不到約0. 1%、且甚至更優選地 不到約0. 01%。
[0144] 理想地，預期用於本發明的無血清和無蛋白質培養基兩者將進一步不含任何動物 來源物質、或任何完全或部分地來源於動物來源的物質，包括重組動物DNA或重組動物蛋 白 DNA。
[0145] 適用於本發明實踐的示例性高密度培養基包括（但不限於）HuMEC基礎無血清 培養基、KNOCKOUT? CTStm 無外來物 ESC/iPSC 培養基、STEMPR0?-34SFM 培養基、STEMPRO? NSC培養基、ESSENTIAL?-8培養基、培養基254、培養基106、培養基131、培養基154、培養 基171、培養基171、培養基200、培養基231、H印toZYME-SFM、人類內皮-SFM、GIBCO? FREESTYLE? 293表達培養基、培養基154CF/PRF、培養基154C、培養基154CF、培養基106、培 養基200PRF、培養基131、Essential?-6培養基、STEMPR0?-34培養基、Gibco?.星形膠質 細胞培養基、am V?培養基cts?、aminomax? c-loo基礎培養基、Aminomaxtm-II完全培養 基、CD F0RTICH0?培養基、CD CHO AGT 培養基、CHO-S-SFM 培養基、G丨 BCO? FREESTYLE? CHO表達培養基、CD 0PTICH0?培養基、CD CHO培養基、CD DG44培養基、SF-900?培養基、 LHC基礎培養基、LHC-8培養基、293SFM培養基、⑶293培養基、AEM生長培養基、PER. C6?. 細胞培養基、AIM V?;培養基、EXPILIFE?;培養基、角質細胞-SFM培養基、LHC培養 基、LHC-8培養基、LHC-9培養基和其任何衍生物或修改型。在某些優選但非限制性的實施 例中，高密度培養基可為CD FORTICHO?培養基、CD CHO AGT培養基、CHO-S-SFM培養基、 GIBCO?: FREESTYLE? CHO 表達培養基、CD 0PTICH0? 培養基、CD CHO 培養基、CD DG44 培養基、G1BCO? FREESTYLE? 293表達培養基、EXPI293?表達培養基或類似培養基、 或其修改型。以上列出的示例性高密度培養基可尤其適於CHO細胞、CHO細胞變異體、293 細胞、293細胞變異體、CapT細胞、CapT細胞變異體或經調適用於高密度培養系統的任何其 它細胞的高密度生長、繁殖、轉染和維持。任選地，使用者可希望調配具有本文中所述特性 的新培養基，或可改為選擇重新調配或修改現有培養基。
[0146] 在一些方面，高密度生長培養基可選自所述清單。所述培養基包括（但不限於）CD F0RTICH0?培養基、Expi293?表達培養基、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基（DMEM)、最小必 需培養基（MEM)、基礎培養基伊格爾（BME)、RPMI-1640、漢姆氏F-10、漢姆氏F-12、α最小 必需培養基U MEM)、格拉斯哥氏最小必需培養基（G-MEM)和伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏 培養基（MDM)。可商購的（例如來自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司）或所屬 領域中另外已知的其它培養基可根據本發明等效地使用，包括（但不限於）293SFM、CD-CH0 培養基、VP SFM、BGJb培養基、布林斯特氏BM0C-3培養基、細胞培養冷凍培養基、CMRL培 養基、EHAA培養基、eRDF培養基、費舍爾氏培養基、網堡氏B-5培養基、GLUTAMAX?補充培 養基、格雷斯氏昆蟲細胞培養基、HEPES緩衝培養基、裡克特氏改良MEM、IPL-41昆蟲細胞 培養基、萊博維茨氏L-15培養基、麥考伊氏5A培養基、MCDB 131培養基、培養基199、改良 伊格爾培養基（MEM)、培養基NCTC-109、施奈德氏果蠅培養基、TC-100昆蟲培養基、威茅斯 氏MB 752/1培養基、威廉氏培養基、無蛋白質雜交瘤培養基II (PFHM II)、AIM V培養基、 角質細胞SFM、成分確定的角質細胞SFM、STEMPRO? SFM、STEMPRO?.完全甲 基纖維素培養基、HepatoZYME-SFM、Neurobasal?培養基、神經基質-A培養基、Hibernate? A培養基、Hibernate E培養基、內皮SFM、人類內皮SFM、雜交瘤SFM、PFHM II、Sf 900培 養基、Sf 900TI SFM、EXPRESS FIVE? 培養基、CHO-S-SFM、AMIN0MAX-II 完全培養基、 AMIN0MAX-C100完全培養基、AMIN0MAX-C 100基礎培養基、PB-ΜΑΧ?核型分析培養基、 KARY0MAX骨髓核型分析培養基、KNOCKOUT D-MEM和CO2非依賴性培養基。以上培養基從所 屬領域的技術人員已知的製造商獲得，如JRH、西格瑪公司、海克隆公司和拜奧惠特克公司。 適用於本發明的實踐的培養基的其它實例可見於美國專利第5, 135, 866號和第5, 232, 848 號以及國際公開第W088/02774號、第WO 98/15614號、第WO 98/08934號和歐洲專利第 0282942號，所述專利的全文特別地以引用的方式併入本文中。任選地，使用者可希望調配 具有本文中所述特性的新培養基，或可改為選擇重新調配或修改現有培養基。
[0147] 本發明進一步提供包含本發明培養基的組合物，其任選地可進一步包含一或多種 哺乳動物上皮或成纖維細胞，如上述那些，尤其是一或多種293細胞、293F細胞、PER-C6細 胞、CHO細胞、CapT細胞、C0S-7L細胞和Sp2/0細胞或其任何衍生物。
[0148] 在本發明的一些方面，本發明的高產量瞬時轉染系統可包括一或多種已被調適用 於在高密度條件下生長而不實質性損失其存活率、有效轉染的能力或其表達高水平重組蛋 白的能力的細胞或細胞系。優選地，細胞是適用於在本發明中所培養的哺乳動物細胞以在 約I X IO6到約20 X IO6個細胞/毫升範圍內、更優選地在約2 X IO6到約6 X IO6範圍內的密 度生長並繁殖的細胞系。可非限制性地使用任何細胞系，限制條件為細胞系能夠在如上所 定義的高密度條件下生長，同時以超過約80 %的高密度維持其存活率，並保持其以高效率 轉染並以高達約2g/L培養物的水平表達重組蛋白的能力。所述細胞系的鑑別充分處於熟 練的業內人士的範圍內，且所述個人可在不背離本發明的精神和範圍的情況下鑑別適用於 本發明的細胞系。被調適用於高密度培養物的細胞可為已調適成以高密度生長在高密度培 養基中同時保持細胞存活率處於或高於約80%的細胞譜系或來源於同一親本細胞譜系的 細胞的（非克隆）群體。所述細胞可通過經>40、>50、>60、>70或>80次連續傳代以高密 度維持細胞且用所需高密度培養基逐漸更換生長培養基的比例來從親本細胞群體中分離 或選擇出。任選地，在所述方法期間，不同細胞池可個別地繁殖且經歷選擇程序，同時同步 評估轉染效率和或蛋白質表達效率，使得可選擇出可以高密度維持和生長、以高效率轉染 且表達高水平所需重組蛋白的細胞的非克隆群體。雖然熟練的從業者將易於清楚，多種細 胞類型和譜系可經歷這種選擇程序，但已確定來源於CHO細胞的細胞譜系、來源於293成纖 維細胞的細胞譜系和來源於CapT細胞的細胞尤其經受所述選擇方法以便被調適成高密度 生長條件。理想地，被調適用於高密度生長培養物且適用於本發明的細胞還將能夠以高效 率轉染和/或能夠以超過至少約200 μ g/mL細胞培養物到約2mg/mL細胞培養物、更通常在 約500 μ g/ml細胞培養物到約lmg/mL細胞培養物之間的產量表達重組蛋白。理想地，被調 適用於根據本發明使用的高密度培養物的細胞能夠以在約IX IO6到約20 X IO6個細胞/毫 升、約2 X IO6到約2 X IO6個細胞/毫升、或約2. 5 X IO6到約6 X IO6個細胞/毫升範圍內的 密度維持和轉染。
[0149] 藉助於非限制性實例，根據本文中所述的實施例可被調適用於高密度培養的細胞 或細胞系可包括細胞，如培養的真核細胞，更優選地培養的植物和/或動物細胞，更優選地 培養的哺乳動物細胞、魚細胞、昆蟲細胞、兩棲動物細胞或禽類細胞。在某些優選但非限制 性實施例中，根據本文中所述的實施例可被調適用於高密度培養的細胞或細胞系可包括培 養哺乳動物細胞，包括原代上皮細胞（例如角質細胞、頸椎上皮細胞、支氣管上皮細胞、氣 管上皮細胞、腎臟上皮細胞和視網膜上皮細胞）和建立的細胞系和其品系（例如293胚胎 腎臟細胞、BHK細胞、HeLa頸椎上皮細胞和PER-C6視網膜細胞、MDBK(NBL-I)細胞、911細 胞、CRFK細胞、MDCK細胞、CapT細胞、CHO細胞、BeWo細胞、張氏細胞、Detroit 562細胞、 HeLa 229 細胞、HeLa S3 細胞、!fep-2 細胞、KB 細胞、LS180 細胞、LS174T 細胞、NCI-H-548 細 胞、RPMI 2650 細胞、SW-13 細胞、T24 細胞、WI-28VA13、2RA 細胞、WISH 細胞、BS-C-I 細胞、 LLC-MK2 細胞、Clone M-3 細胞、1-10 細胞、RAG 細胞、TCMK-I 細胞、Y-I 細胞、LLC-PK1 細胞、 PK (15)細胞、GHl細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC 256細胞、MH1C1細胞、XC細胞、MDOK細 胞、VSW細胞和TH-I、B1細胞或其衍生物）、來自任何組織或器官（包括（但不限於）心、肝、 腎、結腸、腸、食道、胃、神經組織（腦、脊髓）、肺、血管組織（動脈、靜脈、毛細管）、淋巴組織 (淋巴腺體、腺樣體、扁桃體、骨髓和血液）、脾）的成纖維細胞、以及成纖維細胞和成纖維細 胞樣細胞系（例如CHO細胞、TRG-2細胞、頂R-33細胞、Don細胞、GHK-21細胞、瓜氨酸血症 細胞、登普西細胞、Detroit 551 細胞、Detroit 510 細胞、Detroit 525 細胞、Detroit 529 細胞、Detroit 532 細胞、Detroit 539 細胞、Detroit 548 細胞、Detroit 573 細胞、HEL 299 細胞、頂R-90細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、WI-26細胞、MiCl1細胞、CHO細胞、CV-I細胞、 C0S-1 細胞、C0S-3 細胞、C0S-7 細胞、Vero 細胞、DBS-FrhL-2 細胞、BALB/3T3 細胞、F9 細胞、 SV-T2 細胞、M-MSV-BALB/3T3 細胞、K-BALB 細胞、BLO-Il 細胞、N0R-10 細胞、C3H/I0TI/2 細 胞、HSDM1C3細胞、KLN2O5細胞、麥考伊細胞、小鼠 L細胞、品系2071 (小鼠 L)細胞、L-M品系 (小鼠 U 細胞、L-ΜΤΓ(小鼠 L)細胞、NCTC 克隆株 2472 和 2555、SCC-PSA1 細胞、Swiss/3T3 細胞、印度麂細胞、SIRC細胞、C11細胞和延森細胞（Jensen cell)或其衍生物）。最優選 地，培養基用於培養選自由以下各項組成的群組的哺乳動物細胞：293細胞、293F細胞或其 衍生物、PER-C6細胞或其衍生物、CHO細胞或其衍生物、CapT細胞或其衍生物、C0S-7L細胞 或其衍生物和Sp2/0細胞或其衍生物、或能夠以如上所定義的高細胞密度培養的任何其它 懸浮細胞系或衍生物。更優選地，培養基用於培養293細胞或經修飾的293細胞系，其被專 門調適用於在形成本發明基礎的細胞培養基中最佳生長。在本發明的一些優選但非限制性 方面，被調適用於高密度培養的細胞是懸浮細胞或已被調適用於懸浮生長的附著細胞。
[0150] 通過本發明的培養基支持的細胞可來源於任何動物，優選地是哺乳動物，且最優 選地是小鼠或人類。在本發明培養基中培育的細胞可為正常細胞或異常細胞（即，經轉化 的細胞、建立的細胞或來源於患病組織樣品的細胞）。
[0151] 被調適用於根據本文中所述的實施例高密度培養的細胞可任選地表達一或多種 表達增強性蛋白質。如本文中所用，術語"表達增強性蛋白質"是指由細胞表達的任何蛋白 質；所述蛋白質的表達增強重組蛋白的表達。出於本發明實施例的目的，細胞系或細胞群體 對表達增強性蛋白質的表達可為穩定或瞬時的。多種此類表達增強性蛋白質是所屬領域中 已知的，且可包括如PKBa、P21、P18、AKT等的蛋白質。在本發明的一些方面，本發 明的高產量瞬時轉染系統可包括一或多種用於瞬時表達所關注重組蛋白的表達載體。可提 供已含有可表達的核酸的表達載體（如，評估在與優化的對照蛋白質相比時的表達效率的 陽性對照），或可替代地，表達載體可以一種形式提供，藉此使用者可易於插入含有所關注 蛋白質的開放閱讀框架的可表達的核酸，使得所關注蛋白質可以重組方式且以高效率表達 在細胞中。
[0152] 為了重組產生所關注蛋白質，編碼所述蛋白質的可表達的核酸被分離且插入到可 複製載體中以便進一步克隆（擴增DNA)或表達。編碼蛋白質的DNA可易於使用常規程序 (例如通過使用能夠特異性結合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針）進行分離並 測序。許多載體是可供使用的。載體組件通常包括（但不限於）以下各項中的一或多者： 信號序列、複製起點、一或多種標記物基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。
[0153] 【（a)信號序列組件】
[0154] 所關注蛋白質可以不僅直接重組地產生，而且以與異源多肽的融合多肽形式產 生，所述異源多肽優選地是信號序列或在成熟蛋白質或多肽的N端處具有特異性裂解位點 的其它多肽。所選擇的異源信號序列優選地是會被宿主細胞識別並加工（即，通過信號肽 酶裂解）的信號序列。在哺乳動物細胞表達中，哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導子（例 如單純皰疹病毒gD信號）是可供使用的。
[0155] 【（b)複製起點】
[0156] 表達載體或克隆載體都含有使得載體能夠在一或多種所選宿主細胞中複製的核 酸序列。一般來說，在克隆載體中，這一序列是使得載體能夠獨立於宿主染色體DNA複製的 序列，並包括複製起點或自主複製序列。所述序列對於多種細菌、酵母和病毒來說是熟知 的。來自質粒PBR322的複製起點適用於大多數革蘭氏陰性細菌，2μ質粒起點適用於酵母， 並且各種病毒起點（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用於哺乳動物細胞中的克隆載 體。一般來說，哺乳動物表達載體不需要複製起點組件（SV40起點可通常僅由於其含有早 期啟動子而被使用）。
[0157] 【（c)選擇基因組件】
[0158] 表達載體和克隆載體可以含有也稱為可選擇標記物的選擇基因。典型選擇基因 編碼如下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其它毒素（例如氨苄西林（ampicillin)、新黴素 (neomycin)、甲氨蝶呤（methotrexate)或四環素（tetracycline))的抗性；（b)補充營養 缺陷型缺乏；或（c)供應不可獲自複合培養基的關鍵營養素，例如編碼用於桿菌的D-丙氨 酸消旋酶的基因。
[0159] 選擇方案的一個實例利用藥物來遏止宿主細胞的生長。經異源基因成功轉化的那 些細胞產生賦予耐藥性的蛋白質並由此經受住選擇方案。此類顯性選擇的實例使用藥物新 黴素、黴酚酸（mycophenolic acid)和潮黴素（hygromycin)。
[0160] 適用於哺乳動物細胞的可選擇標記物的另一個實例是能夠鑑別有能力吸收編碼 抗體的核酸的細胞的標記物，如DHFR、穀氨醯胺合成酶（GS)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和金 屬硫蛋白-II，優選地是靈長類動物金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
[0161] 舉例來說，經DHFR基因轉化的細胞通過將轉化體培養在含有甲氨蝶呤（Mtx， DHFR的競爭性拮抗劑）的培養基中來加以鑑別。在這些條件下，DHFR基因與任何其它共 轉化的核酸一起擴增。可使用缺乏內源性DHFR活性的中國倉鼠卵巢（CHO)細胞系（例如 ATCCCRL-9096)。
[0162] 或者，經GS基因轉化的細胞通過將轉化體培養在含有L-甲硫氨酸磺醯亞胺（Msx， GS的抑制劑）的培養基中來加以鑑別。在這些條件下，GS基因與任何其它共轉化的核酸一 起擴增。GS選擇/擴增系統可與上述DHFR選擇/擴增系統組合使用。
[0163] 或者，經編碼所關注抗體的DNA序列、野生型DHFR基因和另一種可選擇標記物 (如氨基糖苷3' -磷酸轉移酶（APH))轉化或共轉化的宿主細胞（尤其是含有內源性DHFR 的野生型宿主）可通過細胞生長在含有針對可選擇標記物（如氨基糖苷抗生素，例如卡 那黴素（kanamycin)、新黴素或G418)的選擇劑的培養基中來加以選擇。參見美國專利第 4, 965, 199 號。
[0164] 用於酵母的適合選擇基因是存在於酵母質粒YRp7中的trpl基因（斯丁寇姆 (Stinchcomb)等人，自然（Nature)，282:39 (1979))。trpl基因向缺乏生長於色氨酸中的能 力的酵母突變菌株（例如ATCC第44076號或PEP4-1)提供了選擇標記物。瓊斯（Jones)，遺 傳（Genetics)，85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中存在trpl損傷則提供了有效環境以 便在不存在色氨酸的情況下生長來檢測轉化。類似地，Leu2缺失型酵母菌株（ATCC 20, 622 或38, 626)用負載Leu2基因的已知質粒補充。
[0165] 另夕卜，來源於1. 6 μ m環狀質粒pKDl的載體可用於轉化克魯維酵母 (Kluyveromyces yeast)。或者，針對乳酸克魯維酵母（K. Iactis)報導了用於大 規模製造重組牛凝乳酶的表達系統。範登博格（Van den Berg)，生物技術（Bio/ Technology)，8:135 (1990)。用於通過工業克魯維酵母菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白 的穩定多拷貝表達載體也已公開。弗利爾（Fleer)等人，生物技術，9:968-975(1991)。
[0166] 【⑷啟動子組件】
[0167] 表達載體和克隆載體通常含有啟動子，所述啟動子由宿主生物體識別且可操作地 連接於編碼所關注蛋白質的核酸。真核生物的多種啟動子序列是已知的。幾乎所有真核基 因都具有富AT區，其位於轉錄起始位點上遊約25到30個鹼基處。在許多基因轉錄起點上 遊70到80個鹼基處可見的另一個序列是CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真 核基因的3'端處是AATAAA序列，其可為聚A尾加入到編碼序列的3'端的信號。所有這些 序列都適合地插入到真核表達載體中。
[0168] 從哺乳動物宿主細胞中的載體轉錄蛋白質可例如通過從以下各者獲得的啟動子 而受到控制：病毒基因組，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（如腺病毒2)、牛乳頭瘤 病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒、猴病毒40 (SV40);或異源哺 乳動物啟動子（例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子）；熱休克啟動子，限制條件為此 類啟動子與宿主細胞系統相容。
[0169] SV40病毒的早期和晚期啟動子方便地以還含有SV40病毒複製起點的SV40限制 性片段形式獲得。人類巨細胞病毒的立即早期啟動子方便地以HindIII E限制性片段形 式獲得。在哺乳動物宿主中使用牛乳頭瘤病毒作為載體表達DNA的系統公開於美國專利 第4, 419, 446號中。對這一系統的修改描述於美國專利第4, 601，978號中。也參見雷耶斯 (Reyes)，自然297:598-601(1982)關於在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下 在小鼠細胞中表達人類β-幹擾素 cDNA。或者，勞斯氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus)長 末端重複序列可用作啟動子。
[0170] 【（e)增強子元件組件】
[0171] 高等真核生物對根據本發明的編碼所關注蛋白質的DNA的轉錄通常通過將增強 子序列插入到載體中而得以增加或增強。許多增強子序列現從哺乳動物基因已知（球蛋 白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素）。通常但非排他性地，將使用來自真核細胞 病毒的增強子。實例包括在複製起點的後側（bp 100-270)上的SV40增強子、巨細胞病毒 早期啟動子增強子、在複製起點的後側上的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。還參見亞尼 夫（Yaniv)，自然297:17-18(1982)關於用於活化真核啟動子的增強元件。增強子可在抗體 編碼序列的5'或3'位處剪接到載體中，但優選地位於始於啟動子的5'位點處。其它增強 子在所屬領域中是已知的，且可包括例如獲自或來源於哺乳動物或病毒基因的增強子。預 期在此使用的一種尤其優選的增強子是土拔鼠肝炎轉錄後調節元件（WPRE)。
[0172] 【（f)轉錄終止組件】
[0173] 用於真核宿主細胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或來自其它多細胞生物體 的有核細胞）中的表達載體還將含有終止轉錄和穩定化mRNA所需的序列。所述序列通常 可獲自真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶爾3'非翻譯區。這些區域含有作為聚腺苷酸化 片段在mRNA編碼抗體的非翻譯部分中轉錄的核苷酸區段。一種有用的轉錄終止組件是牛 生長激素聚腺苷酸化區。參見W094/11026和其中公開的表達載體。
[0174] 在一些方面，非常適用於本發明實踐的表達載體可為所屬領域中使用的熟知載體 中的任一者，如PCDNA 3. 3或其修飾型。可適於本發明實踐的載體修飾類型的非限制性實 例包括（但不限於）修飾，如加入一或多種增強子、一或多種啟動子、一或多種核糖體結合 位點、一或多種複製起點等的修飾。在某些優選但非限制性的實施例中，且本發明的實踐中 所用的表達載體可包括一或多種經選擇以改進所關注蛋白質在本發明瞬時表達系統中的 表達的增強子元件。所選增強子元件可位於用於表達所關注蛋白質的可表達的核酸序列的 5'或3'。尤其優選但非限制性的增強子元件是土拔鼠肝炎轉錄後調節元件（WPRE)。
[0175] 在一個優選但非限制性實施例中，根據目前所述本發明使用的表達載體可為 pcDNA載體，或尤其是pcDNA 3. 3載體，更具體地說是pcDNA 3. 3載體的變異體。載體可 任選地包括經增強啟動子，如和經增強CMV啟動子。任選地，載體可包括腺T+M區，任選 地SV40ori位點，任選地SV40剪接供體/受體位點，或任選地土拔鼠肝炎轉錄後調節元件 (WPRE) 〇
[0176] 在本發明的一些方面，本發明的高產量瞬時轉染系統可包括一或多種表達增強 齊IJ。表達增強劑可為含有一或多種會在瞬時表達系統中增加重組蛋白表達的化合物的水溶 液。多種表達增強劑在所屬領域中是已知的，且任一或多種可非限制性地用於本發明的實 踐。
[0177] 一般來說，一或多種轉染增強劑與表達蛋白質的細胞群體在所述細胞已經可表達 的核酸或表達載體轉染期間或之後接觸。當使用兩種或更多種表達增強劑時，每一表達增 強劑可在實質上同一時間與細胞接觸，或可替代地表達增強劑可依序與表達蛋白質的細胞 接觸，任選地在使細胞與第一表達增強劑接觸與使細胞與第二表達增強劑接觸之間過了一 段時間之後。
[0178] 雖然熟練的業內人士將容易了解到任何數目的表達增強劑都可非限制性地用於 本發明的實踐，且對構成適用於本發明實施例的表達增強劑的要素的鑑別充分在所述個人 的範圍內，下文將描述多種示例性但非限制性表達增強劑，但應了解其敘述並不限制可預 期用於本發明實踐的適合表述的範圍。
[0179] 在一些方面，一或多種表達增強劑可包括用於補充根據目前所述實施例的培養基 調配物的液體（優選地水性）添加劑，所述添加劑經選擇以改進在根據目前所述實施例的 瞬時蛋白質表達系統中產生的所表達蛋白質的產量。一或多種表達增強劑可包括會影響細 胞周期進程、抑制細胞凋亡、減緩細胞生長和/或促進蛋白質產生的數種化合物中的一或 多者。在本發明的情形下，術語"表達增強劑"一般是指加入到瞬時轉染系統中的任一或多 種化合物，所述一或多種化合物的存在增強或促進目標蛋白的表達高於在不存在所述表達 增強劑下可見的表達水平至少2倍到約10倍。適合與目前所述實施例一起使用的示例性 表達增強劑包括（但不限於）添加劑，如丙戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞 碸（DMSO)、包括半乳糖的糖、胺基酸混合物、或丁酸或上述的任何組合。每一特定表達增強 劑的最佳濃度可根據表達系統的個別特徵和使用者的需求變化，且對在給定實驗情境中構 成任一或多種表達增強劑的最佳濃度的要素的測定充分處於在所屬領域中具有普通技能 水平的從業者的範圍內。
[0180] 在一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有丙戊酸的調配物。本發明的實踐 中所用的丙戊酸（VPA)的最佳最終濃度範圍可改變，但將優選地在約0. 20mM到約25mM範 圍內，或由此範圍涵蓋的任何子範圍或濃度值。更優選地，VPA的最終濃度可能在以下範圍 內：約 0· 25mM 到約 24mM、約 0· 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0. 30mM 到約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、 約 0. 40mM 到約 14mM、約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 I ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 到約 5mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 55mM 到約 3mM、 0. 6mM到約2mM或0. 75到約I. 5mM。在一些優選但非限制性的實施例中，本發明的實踐中 所用的VPA的最終濃度可能在約0. 15mM到約I. 5mM之間、在約0. 16mM到約I. 5mM之間、在 約0. 17mM到約1.5mM之間、在約0. 18mM到約1.5mM之間、在約0. 19mM到約1.5mM之間、在 約0. 20mM到約I. 5mM之間、在約0. 25mM到約I. 5mM之間、在約0. 30mM到約I. 5mM之間、在 約0. 40mM到約I. 5mM之間、在約0. 50mM到約I. 5mM之間、在約0. 60mM到約I. 5mM之間、在 約0. 70mM到約I. 5mM之間、在約0. 80mM到約I. 5mM之間、在約0. 90mM到約I. 5mM之間或 在約0. IOmM到約I. 5mM之間。在一些優選但非限制性的實施例中，本發明的實踐中所用的 VPA的最終濃度可能在約0. 20到約I. 5mM之間、在約0. 21到約I. 4mM之間、在約0. 22到約 1. 4mM之間、在約0. 23到約I. 4mM之間、在約0. 24到約I. 4mM之間、在約0. 25到約I. 3mM 之間、在約0. 25到約I. 2mM之間、在約0. 25到約I. ImM之間或在約0. 25到約I. OmM之間。
[0181] 在另一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有丙酸鈉（NaPP)的調配物。任選 地，NaPP可單獨或與如上丙戊酸組合提供。本發明的實踐中所用的NaPP的最佳最終濃度 範圍可能改變，但將優選地在約範圍內在其它實施例中，本發明的實踐中所用的NaPP的最 佳最終濃度可能在約0. 2mM到約IOOmM範圍內，或此範圍內涵蓋的任何子範圍或個別濃度。 在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約0. 5到約 80mM、約 0. 4mM 到約 70mM、約 0. 5mM 到約 60mM、約 0. 6mM 到約 50mM、約 0. 7mM 到約 40mM、約 0. 8mM 到約 30mM、約 0. 9mM 到約 20mM、約 ImM 到約 15mM、約 2mM 到約 10mM、約 3mM 到約 9mM、 約4mM到約8mM或約5mM到約7mM。在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終 濃度可能在以下範圍內：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約2mM到約3mM、約3mM到約 4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM到約8mM、約8mM到約9mM或 約9mM到約10mM。在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終濃度可能是約ImM、 約 I. 5mM、約 2mM、約 2. 5mM、約 3mM、約 3. 5mM、約 4mM、約 4. 5mM、約 5mM、約 5. 5mM、約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 10mM。
[0182] 在另一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有乙酸鋰（LiAc)的調配物。任選 地，LiAc可能單獨或與如上NaPP或丙戊酸組合提供。在其它實施例中，本發明的實踐中所 用的乙酸鋰（LiAc)的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約0. 25到約25mM、約0. 26mM到約 20mM、約 0· 27mM 到約 15mM、約 0· 28mM 到約 10mM、約 0· 29mM 到約 5mM、約 0· 3mM 到約 4. 5mM、 約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到 約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0183] 在另一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有丁酸的調配物。本發明的實踐 中所用的丁酸的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約〇. 25到約25mM、約0. 26mM到約20mM、 約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到約 2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0184] 根據本發明使用的表達增強劑可在即將轉染之前或在轉染期間、或在轉染之後但 在收穫細胞和所表達的蛋白質之前加入到培養基中。在下文描述的一些特定但非限制性實 施例中，"增強劑1"一般是指〇. 25mM-lmM丙戊酸，且"增強劑2"一般是指丙酸鈉。 然而，如果另外指示，那麼術語增強劑1和增強劑2可涵蓋不同增強劑化合物。表達增強劑 可依序或以混合物形式加入到培養基中。
[0185] 在本發明的一些方面，本發明的高產量瞬時轉染系統可包括一或多種用於將大分 子引入到所培養的細胞中的試劑（所述試劑通常被稱為"轉染試劑"）。根據目前所述實施 例使用的轉染試劑可為用於將生物分子（尤其是核酸分子）引入到細胞中的任何化合物或 其它化學模態，由此核酸可發揮生物功能，或在可表達的核酸的情況下，其中由所述可表達 的核酸編碼的基因或蛋白質可被表達。多種適合的轉染試劑在所屬領域中是已知的，且任 一或多種可非限制性地用於本發明的實踐。
[0186] 用於本發明實施例的轉染試劑是所屬領域的技術人員已知有助於大分子進入到 細胞中的任何調配物或組合物。舉例來說，參見美國專利第5, 279, 833號。在一些實施例 中，試劑可為"轉染試劑"且可為增加一或多種核酸攝取到一或多種目標細胞中的任何化合 物和/或組合物。所屬領域的技術人員已知多種轉染試劑。適合的轉染試劑可包括（但不 限於）一或多種化合物和/或組合物，其包含陽離子聚合物（如聚乙二亞胺（PEI))、帶正 電荷胺基酸的聚合物（如聚賴氨酸和聚精氨酸）、帶正電荷樹枝狀聚合物和斷裂的樹枝狀 聚合物、含有陽離子β -環糊精的聚合物（CD-聚合物）、DEAE-葡聚糖等。在一些實施例 中，用於將大分子引入到細胞中的試劑可包含一或多種可為陽離子脂質和/或中性脂質的 脂質。優選的脂質包括（但不限於）氯化N-[l-(2,3-二油醯基氧基）丙基]-N，N，N-三甲 銨（DOTMA)、二油醯基磷脂醯膽鹼（DOPE)、1，2-雙（油醯基氧基）-3-(4' -三甲銨基）丙烷 (DOTAP)、1，2-二油醯基-3-(4'-三甲銨基）丁醯基-sn-甘油（DOTB)、1，2-二油醯基-3-琥 珀醯基-sn-甘油膽鹼酯（DOSC)、（4' -三甲銨基）丁酸膽固醇酯（ChoTB)、溴化十六烷基三 甲銨（CTAB)、溴化1，2-二油醯基-3-二甲基-羥乙銨（DORI)、溴化1，2-二油醯基氧基丙 基-3-二甲基-羥乙銨（DORIE)、溴化1，2-二肉豆蘧氧基丙基-3-二甲基-羥乙銨（DMRIE)、 氯化0, 0' -雙十二烷基-N-[對（2-三甲氨基乙氧基）苯甲醯基]-N，N，N-三甲銨、結合於一 或多種脂質的精胺（例如5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基醯胺（DOGS)、N，N 1，N11，Nin-四甲 基-N，N1，N 11，Nin-四棕櫚基精胺（TM-TPS)和二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇胺5-羧基精胺基醯 胺（DPPES))、脂聚賴氨酸（結合於DOPE的聚賴氨酸）、TRIS (三（羥甲基）氨基甲烷，氨基丁 三醇）結合的脂肪酸（TFA)和/或肽，如三賴氨醯基-丙氨醯基-TRIS單-、二-和三-棕櫚 酸酯、（3 β _[Ν--(Ν'，Ν' -二甲氨基乙烷）-氨基甲醯基]膽固醇（DC-Chol)、氯化Ν-( α -三 甲氨基乙醯基）-雙十二烷基-D-穀氨酸酯（TMAG)、溴化二甲基雙十八烷銨（DDAB)、三氟乙 酸2, 3-二油醯基氧基-Ν-[2(精胺-甲醯胺基）乙基]-Ν，N-二甲基-1-丙銨（DOSPA)和 其組合。
[0187] 所屬領域的技術人員將理解上述脂質的某些組合已展示出尤其適於將核酸 引入到細胞中，例如DOSPA與DOPE的3:1 (w/w)組合以商標名LIPOFECTAMINE?購自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司，DOTMA與DOPE的l :l(w/w)組合以商標名 LIPOFECTIN?購自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司，DMRlE與膽固醇 的I: I (M/M)組合以商標名DMRIE-C試劑購自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司， TM-TPS與dope的I: l. 5 (μ/m)組合以商標名CellFECTIN?,購自加利福尼亞州卡爾斯 巴德的生命技術公司，且DDAB與DOPE的1:2. 5 (w/w)組合以商標名Lip_fectACE?購自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司。除了上述脂質組合之外，包含脂質與其它化合 物的摻合物、具體來說與包含核定位序列的肽和蛋白質的摻合物的其它調配物是所屬領域 的技術人員已知的。舉例來說，參見國際申請第PCT/US99/26825號，作為WO 00/27795公 開，其兩者都以引用的方式併入本文中。
[0188] 已發現脂質聚集體（如脂質體）適用作將大分子傳遞到細胞中的試劑。具體來說， 已證實包含一或多種陽離子脂質的脂質聚集體在將陰離子大分子（例如核酸）傳遞到細胞 中時極其有效。一種常用陽離子脂質是氯化N-[l_(2,3-二油醯基氧基）丙基]-N，N，N_三 甲銨（DOTMA)。包含單獨DOTMA或與二油醯磷脂醯乙醇胺（DOPE)的1:1混合物的脂質體 已被用於將核酸引入到細胞中。D0TMA:D0PE的1:1混合物可以商標名LIP0FECTIN?購自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術公司。已用於將核酸引入到細胞中的另一種陽離子 脂質是1，2_雙（油醯基氧基）-3-3-(三甲銨基）丙烷（DOTAP)。DOTAP與DOTMA的不同之 處在於油醯基部分在DOTAP中經由醚鍵鍵聯到丙胺主鏈，而其在DOTMA中是經由酯鍵鍵聯 的。DOTAP被認為更易於被目標細胞降解。其中三甲銨部分的一個甲基經羥乙基替代的結 構上相關的化合物組在結構上與磷脂酶A的羅森塔爾抑制劑（RI)類似（參見羅森塔爾等 人，（1960)生物化學雜誌233:2202-2206)。RI具有鍵聯到丙胺核心的硬脂醯基酯。RI的 二油醯基類似物通常簡稱為DORl-醚和DORl-酯，取決於脂質部分與丙胺核心的鍵聯。羥 乙基部分的羥基可進一步例如通過酯化成羧基精胺來衍生。
[0189] 已用於將大分子引入到細胞中的另一類化合物包含與脂質連接的羧基精胺部分 (參見貝爾等人，（1989)美國國家科學院院刊86:6982-6986和EPO 0 394 111)。這類化 合物的實例包括二軟脂醯基磷脂醯乙醇胺5-羧基精胺基醯胺（DPPES)和5-羧基精胺基甘 氨酸雙十八烷基醯胺（DOGS)。DOGS可以商標名TRANSFECTAM?購自威斯康星州麥迪遜的普 洛麥格公司。
[0190] 膽固醇的陽離子衍生物（3β-[Ν-(Ν'，Ν'_二甲氨基乙烷）_氨基甲醯基]膽 固醇，DC-Chol)已經合成且與DOPE-起調配到脂質體中（參見高等人，（1991)BBRC 179 (1) : 280-285)且用於將DNA引入到細胞中。由此調配的脂質體據報導有效地將DNA以 低細胞毒性水平引入到細胞中。通過將聚賴氨酸結合於DOPE所形成的脂聚賴氨酸（參見 周等人，（1991)BBA 1065:8-14)據報導在將核酸在血清存在下引入到細胞中時有效。
[0191] 已用於將核酸引入到細胞中的其它類型的陽離子脂質包括高度填充聚陽離子銨、 鋶和鱗脂質，如美國專利第5, 674, 908號和第5, 834, 439號和國際申請第PCT/US99/26825 號（作為WO 00/27795公開）中所述的那些。根據本發明一種尤其優選但非限制性的用 於傳遞大分子的轉染試劑是購自生命技術公司的LIP0FECTAMINE 2000?。參見美國國際申 請第PCT/US99/26825號，作為WO 00/27795公開。適於將大分子傳遞到細胞中的另一種 優選但非限制性轉染試劑是EXPIFECTAMINE?。其它適合的轉染試劑包括LI0FECTAMINE? RNAiMAX、LIPOFECTAMINE? LTX、0LIG0FECTAMINE?、Cellfectin?、INVIV0FECTAMINE?、 INVIVOFECTAMINE? 2. 0以及楊等人的美國專利申請公開第2012/0136073號中所公開的任 何脂質試劑或調配物（所述公開以引用的方式併入本文中）。多種其它轉染試劑是熟練的 業內人士已知的且可針對其對於本文中所述的瞬時轉染系統和方法的適合性進行評估。
[0192] 本發明在某種程度上是針對一種高產量瞬時轉染系統，其支持（a)將至少一種大 分子（優選地是可表達的核酸分子）引入到培養物中的真核細胞中，（b)培育其中已引入至 少一種大分子的細胞，以及任選地（c)在其中已引入至少一種大分子的細胞中產生重組蛋 白產物或表達核酸，其中含有大分子的培養基並不需要在將至少一種大分子引入到細胞中 之後以及在培育並產生蛋白質產物或表達核酸之前從培養物中移出並用新鮮培養基更換。
[0193] 本發明的瞬時轉染系統、其根據本文中所描述方法的使用引起所關注蛋白質在細 胞培養系統中快速且可重現的高水平表達。通常，本發明瞬時轉染系統和方法能夠以在約 200 μ g蛋白質/L培養物到約2g蛋白質/L培養物範圍內的水平產生重組表達的蛋白質， 取決於所需重組蛋白的個別表達特徵和所用細胞類型。使用為本文提供的瞬時轉染系統和 方法，使用者可獲得超過目前使用標準可商購的瞬時轉染系統可獲得水平約2倍到高達約 20倍的所表達的蛋白質水平。使用為本文提供的瞬時轉染系統和方法，使用者可獲得與用 當代瞬時表達系統可見水平相比約2. 5倍、約3倍、約3. 5倍、約4倍、約4. 5倍、約5倍、約 5. 5倍、約6倍、約6. 5倍、約7倍、約7. 5倍、約8倍、約8. 5倍、約9倍、約9. 5倍或高達約 10倍或更大的所表達的蛋白質水平。舉例來說，使用本發明瞬時轉染系統來產生重組蛋白， 使用者可獲得比使用為在懸浮細胞中產生重組蛋白而優化的可商購的瞬時轉染系統（如 FREESTYLE?表達系統）獲得的蛋白質產量高在約2倍到約10倍之間的蛋白質產量。
[0194] 【方法】
[0195] 本發明進一步涉及表達高水平的所關注蛋白質的方法。本發明的方法可包括懸 浮培育哺乳動物細胞（尤其是上述那些且最尤其是293細胞、293F細胞、PER-C6細胞、CHO 細胞、CapT細胞、C0S-7L細胞和Sp2/0細胞或其任何衍生物），包含（a)獲得以懸浮形式培 育的哺乳動物細胞；和（b)使細胞與本發明的培養基在足以支持細胞懸浮培育的條件下接 觸，用編碼所關注蛋白質的可表達的核酸轉染所培養的細胞，使經轉染的細胞與一或多種 表達增強劑接觸，在允許所關注蛋白質表達所界定時間段的條件下培養經轉染的細胞，以 及收穫細胞。
[0196] 本發明進一步涉及產生多肽的方法，以及通過這些方法產生的多肽，所述方法包 含（a)獲得細胞，優選地是上述哺乳動物細胞，且最優選地是293細胞、293F細胞、PER-C6 細胞、CHO細胞、CapT細胞、C0S-7L細胞和Sp2/0細胞或其任何衍生物；(b)使細胞與包含 編碼多肽的核酸的溶液在引起核酸引入到細胞中的條件下接觸；以及（c)在本發明的培養 基中在有利於所需多肽通過細胞表達的條件下培育細胞。
[0197] 在一個方面，根據本發明的表達重組蛋白的方法可包括在高密度培養基中獲得細 胞的培養物。細胞優選地是以下各者的懸浮培養物：293細胞、293F細胞、PER-C6細胞、CHO 細胞、CapT細胞、C0S-7L細胞或Sp2/0細胞或其任何衍生物，所述細胞已適宜於在高密度培 養基中生長。雖然熟練的業內人士將容易了解在本發明的實踐中可使用任何體積的細胞培 養物，但培養物通常將為約200 μ 1到100升，更優選地，細胞培養物體積是約2ml到約50 升，最優選地是約5ml到約5升。在一些方面，細胞培養物體積可以是約IOOml到約50升。 更優選地，細胞培養物體積是約500ml到約50升。更優選地，細胞培養物體積是約500ml到 約25升。更優選地，細胞培養物體積是約500ml到約10升。更優選地，細胞培養物體積是 約500ml到約5升。更優選地，細胞培養物體積是約500ml到約1升。在一些實施例中，細 胞培養物體積可以高達約100升、高達約95升、高達約90升、高達約85升、高達約80升、 高達約75升、高達約70升、高達約65升、高達約60升、高達約55升、高達約50升、高達約 45升、高達約40升、高達約35升、高達約30升、高達約35升、高達約20升、高達約15升、 高達約10升、高達約9升、高達約8升、高達約7升、高達約6升、高達約5升、高達約4升、 高達約2升或高達約1升。
[0198] 在一個方面，細胞培養物可以在約I. 5 X IO6個細胞/毫升到約20 X IO6個細胞/ 毫升之間的細胞密度、或其中涵蓋的任何濃度、濃度範圍或子範圍維持。
[0199] 為了根據目前描述的本發明在細胞中表達蛋白質，細胞將通常稀釋到新鮮體積培 養基中。最佳稀釋度可以改變，但為了說明性目的，稀釋到新鮮體積培養基中的細胞密度可 以在0. 5 X IO6個細胞/毫升到約10 X IO6個細胞/毫升之間，更優選地在I X IO6個細胞/ 毫升到約5 X IO6個細胞/毫升之間，更優選地在I. 5 X IO6個細胞/毫升到約3 X IO6個細 胞/暈升之間。
[0200] 在一個方面，在將細胞稀釋到新鮮體積培養基中之後，細胞可以所述體積培養一 段時間，隨後用可表達的核酸轉染。任選地，細胞可以培養高達2天，更優選地高達約一天 半，最優選地高達約一天。任選地，細胞可以培養在新鮮體積培養基中直到其中培養的細胞 密度已增加高達約100 %、更優選地高達約95 %、高達約90 %、高達約85 %、高達約80 %、高 達約75 %、高達約70 %、高達約65 %、高達約60 %、高達約55 %、高達約50 %、高達約45 %、 高達約40%、高達約35%、高達約30%、高達約25%、高達約20%或高達約15%。
[0201] 在一個方面，在細胞已在高密度生長培養基中培養如上文所述的一段時間之後， 細胞可經可表達的核酸或表達載體轉染。使用者進行以實現將表達載體引入到細胞中的 步驟的精確順序可變化，取決於所選擇的特定轉染試劑、細胞系、培養基和各種其它實驗參 數，如在所屬領域中具有普通技能水平的從業者將易於認識到般。僅舉例來說，在選擇基於 脂質的轉染系統（具體來說，具有至少一種陽離子脂質的轉染系統）的情況下，轉染試劑將 首先與核酸在水溶液中接觸以在如上所定義且併入本文中的過程（非正式地稱為"複合" 或"複合反應"）中形成脂質-DNA複合物。所述反應通常將在與培養細胞的容器分開的反 應容器中實現。
[0202] 在一個方面，在上述複合步驟中形成脂質-DNA複合物之後，轉染複合物可與所培 養的細胞接觸。在細胞與轉染複合物接觸之後，細胞可在轉染複合物存在下培養第一時間 段。第一時間段的持續時間將根據細胞的性質、所用轉染試劑和所屬領域的技術人員已知 的多種其它因素變化。短語"第一時間段"當用於根據本文中所述的本發明方法瞬時轉染細 胞的方法的情形時通常是指在細胞群體經可表達的核酸轉染與一或多種表達增強劑加入 到經轉染的細胞中之間的時間間隔。第一時間段通常將在約2小時到約4天範圍內，或其 中涵蓋的任何範圍或子範圍。在某些優選但非限制性的實施例中，第一時間段可能在以下 範圍內：約3到約90小時、約4到約85小時、約5到約80小時、約6到約75小時、約7到 約70小時、約8到約65小時、約9到約60小時、約10到約55小時、約11到約50小時、約 12到約45小時、約13到約40小時、約14到約35小時、約15到30小時、約16到約24小 時、約17到約24小時、約18到約24小時、約19到約24小時、約20到約24小時、約21到 約24小時、約22到約24小時或約23到約24小時。在其它優選非限制性實施例中，第一 時間段可能高達約15小時、高達約16小時、高達約17小時、高達約18小時、高達約19小 時、高達約20小時、高達約21小時、高達約22小時、高達約23小時、高達約24小時、高達 約25小時、高達約26小時、高達約27小時、高達約28小時、高達約29小時或高達約30小 時。
[0203] 在一個高度優選但非限制性實施例中，培養基在轉染複合物引入到細胞中且維持 第一時間段的持續時間之後不經更換、補充或補給。
[0204] 在本發明的一個方面，培養的經轉染的細胞可在第一時間段之後與一或多種表達 增強劑接觸。表達增強劑可為含有一或多種會在瞬時表達系統中增加重組蛋白表達的化合 物的水溶液。多種表達增強劑在所屬領域中是已知的，且任一或多種可非限制性地用於本 發明的實踐。
[0205] -般來說，一或多種轉染增強劑與表達蛋白質的細胞群體在所述細胞已經可表達 的核酸或表達載體轉染期間或之後接觸。當使用兩種或更多種表達增強劑時，每一表達增 強劑可在實質上同一時間與細胞接觸，或可替代地表達增強劑可依序與表達蛋白質的細胞 接觸，任選地在使細胞與第一表達增強劑接觸與使細胞與第二表達增強劑接觸之間過了一 段時間之後。
[0206] 雖然熟練的業內人士將容易了解到任何數目的表達增強劑都可非限制性地用於 本發明的實踐，且對構成適用於本發明實施例的表達增強劑的要素的鑑別充分在所述個人 的範圍內，下文將描述多種示例性但非限制性表達增強劑，但應了解其敘述並不限制可預 期用於本發明實踐的適合表述的範圍。
[0207] 在一些方面，一或多種表達增強劑可包括用於補充根據目前所述實施例的培養基 調配物的液體（優選地水性）添加劑，所述添加劑經選擇以改進在根據目前所述實施例的 瞬時蛋白質表達系統中產生的所表達蛋白質的產量。一或多種表達增強劑可包括會影響細 胞周期進程、抑制細胞凋亡、減緩細胞生長和/或促進蛋白質產生的數種化合物中的一或 多者。在本發明的情形下，術語"表達增強劑"一般是指加入到瞬時轉染系統中的任一或多 種化合物，所述一或多種化合物的存在增強或促進目標蛋白的表達高於在不存在所述表達 增強劑下可見的表達水平至少2倍到約10倍。適合與目前所述實施例一起使用的示例性 表達增強劑包括（但不限於）添加劑，如丙戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞 碸（DMSO)、包括半乳糖的糖、胺基酸混合物、或丁酸或上述的任何組合。每一特定表達增強 劑的最佳濃度可根據表達系統的個別特徵和使用者的需求變化，且對在給定實驗情境中構 成任一或多種表達增強劑的最佳濃度的要素的測定充分處於在所屬領域中具有普通技能 水平的從業者的範圍內。
[0208] 在一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有丙戊酸的調配物。本發明的實踐 中所用的丙戊酸（VPA)的最佳最終濃度範圍可改變，但將優選地在約0. 20mM到約25mM範 圍內，或由此範圍涵蓋的任何子範圍或濃度值。更優選地，VPA的最終濃度可能在以下範圍 內：約 0· 25mM 到約 24mM、約 0· 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0. 30mM 到約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、 約 0. 40mM 到約 14mM、約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 I ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 到約 5mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 55mM 到約 3mM、 0. 6mM到約2mM或0. 75到約I. 5mM。在一些優選但非限制性的實施例中，本發明的實踐中所 用的VPA的最終濃度可能在約0. 15mM到約I. 5mM之間、在約0. 16mM到約I. 5mM之間、在約 0. 17mM到約I. 5mM之間、在約0. 18mM到約I. 5mM之間、在約0. 19mM到約I. 5mM之間、在約 0. 20mM到約I. 5mM之間、在約0. 25mM到約I. 5mM之間、在約0. 30mM到約I. 5mM之間、在約 0. 40mM到約I. 5mM之間、在約0. 50mM到約I. 5mM之間、在約0. 60mM到約I. 5mM之間、在約 0. 70mM到約I. 5mM之間、在約0. 80mM到約I. 5mM之間、在約0. 90mM到約I. 5mM之間或在約 0. IOmM到約I. 5mM之間。在一些優選但非限制性的實施例中，本發明的實踐中所用的VPA 的最終濃度可能在約約〇. 20到約I. 5mM之間、在約0. 21到約I. 4mM之間、在約0. 22到約 1. 4mM之間、在約0. 23到約I. 4mM之間、在約0. 24到約I. 4mM之間、在約0. 25到約I. 3mM 之間、在約0. 25到約I. 2mM之間、在約0. 25到約I. ImM之間或在約0. 25到約I. OmM之間。
[0209] 在另一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有丙酸鈉（NaPP)的調配物。任選 地，NaPP可單獨或與如上丙戊酸組合提供。本發明的實踐中所用的NaPP的最佳最終濃度 範圍可能改變，但將優選地在約範圍內在其它實施例中，本發明的實踐中所用的NaPP的最 佳最終濃度可能在約0. 2mM到約IOOmM範圍內，或此範圍內涵蓋的任何子範圍或個別濃度。 在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約0. 5到約 80mM、約 0. 4mM 到約 70mM、約 0. 5mM 到約 60mM、約 0. 6mM 到約 50mM、約 0. 7mM 到約 40mM、約 0. 8mM 到約 30mM、約 0. 9mM 到約 20mM、約 ImM 到約 15mM、約 2mM 到約 10mM、約 3mM 到約 9mM、 約4mM到約8mM或約5mM到約7mM。在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終 濃度可能在以下範圍內：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約2mM到約3mM、約3mM到約 4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM到約8mM、約8mM到約9mM或 約9mM到約10mM。在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終濃度可能是約ImM、 約 I. 5mM、約 2mM、約 2. 5mM、約 3mM、約 3. 5mM、約 4mM、約 4. 5mM、約 5mM、約 5. 5mM、約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 10mM。
[0210] 在另一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有乙酸鋰（LiAc)的調配物。任選 地，LiAc可能單獨或與如上NaPP或丙戊酸組合提供。在其它實施例中，本發明的實踐中所 用的乙酸鋰（LiAc)的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約0. 25到約25mM、約0. 26mM到約 20mM、約 0· 27mM 到約 15mM、約 0· 28mM 到約 10mM、約 0· 29mM 到約 5mM、約 0· 3mM 到約 4. 5mM、 約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到 約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0211] 在另一個示例性實施例中，表達增強劑可以是含有丁酸的調配物。本發明的實踐 中所用的丁酸的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約〇. 25到約25mM、約0. 26mM到約20mM、 約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到約 2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0212] 根據本發明使用的表達增強劑可在即將轉染之前或在轉染期間、或在轉染之後但 在收穫細胞和所表達的蛋白質之前加入到培養基中。在下文描述的一些特定但非限制性實 施例中，"增強劑1"一般是指〇. 25mM-lmM丙戊酸，且"增強劑2"一般是指丙酸鈉。 然而，如果另外指示，那麼術語增強劑1和增強劑2可涵蓋不同增強劑化合物。表達增強劑 可依序或以混合物形式加入到培養基中。
[0213] 在一個方面，當使用兩種或更多種表達增強劑時，所述兩種或更多種表達增強劑 可與所轉染的經培養細胞實質上同時接觸，或可替代地所轉染的經培養細胞可首先與第一 表達增強劑接觸，且在第二時間段之後，所轉染的經培養細胞可與第二表達增強劑接觸。在 一個方面，"第二時間段"當用於根據本文中所述的本發明方法瞬時轉染細胞的方法的情形 時通常是指在加入一或多種表達增強劑與或者加入一或多種其它增強劑或者收穫經轉染 的細胞並對其中表達的蛋白質進行純化或分離之間的時間間隔。第二時間段通常將在約10 小時到約10天範圍內，但其它時間間隔在確定對於所表達蛋白質最佳時可以使用。在一 些優選但非限制性的實施例中，第二時間段可能在以下範圍內：2小時到5天、2. 5小時到4 天、約3到約90小時、約4到約85小時、約5到約80小時、約6到約75小時、約7到約70 小時、約8到約65小時、約9到約60小時、約10到約55小時、約11到約50小時、約12到 約45小時、約13到約40小時、約14到約35小時、約15到30小時、約16到約24小時、約 17到約24小時、約18到約24小時、約19到約24小時、約20到約24小時、約21到約24 小時、約22到約24小時或約23到約24小時。在其它優選非限制性實施例中，第一時間段 可能高達約15小時、高達約16小時、高達約17小時、高達約18小時、高達約19小時、高達 約20小時、高達約21小時、高達約22小時、高達約23小時、高達約24小時、高達約25小 時、高達約26小時、高達約27小時、高達約28小時、高達約29小時或高達約30小時。
[0214] 在經過適當量時間之後，使用者可以收穫細胞並任選地純化所表達的重組蛋白。
[0215] 本發明的方法允許使用者根據上述實施例瞬時表達重組蛋白而不必在所述方法 期間更換、補充或另外補給培養基。本文中所描述的方法允許使用者每升培養的細胞表 達高達約2克。在一些實施例中，使用者可以對每升培養的細胞表達高達約I. 9g、高達約 I. 8g、高達約I. 7g、高達約I. 6g、高達約I. 5g、高達約I. 4g、高達約I. 3g、高達約I. 2g、高達 約I. Ig或高達約Ig重組蛋白。
[0216] 本發明還針對組合物，尤其是如上所定義的高密度細胞培養基，其任選地包含一 或多種替代化合物。本發明還針對使用所述組合物的方法，包括例如體外培育真核細胞 (尤其是動物細胞）的方法。本發明還涉及包含所述培養基和一或多種細胞（尤其是本文 中特定提及的那些細胞）的組合物，和包含上述組合物中的一或多者的試劑盒。本發明還 涉及表達載體，其包含一或多種可表達的核酸序列與一或多種啟動子、增強子和在如上所 定義且併入本文中的所培養的細胞中表達所述可表達的核酸所需的其它元件的組合。本發 明還涉及組合物，其包含一或多種表達增強劑組合物，尤其是經選擇以使所述可表達的核 酸在所培養的細胞中的表達增強至少2到2. 5倍的那些。任選地，表達增強劑可為共同調 配或分別提供的兩種或表達增強劑的組合。本發明還涉及轉染試劑，尤其是經優化以有助 於一或多種核酸分子傳遞到所培養的細胞內部的那些。本發明還涉及包含上述組合物、載 體、表達增強劑、轉染試劑等中的一或多者的試劑盒，和包含上述組合物（尤其是本文中特 定提及的那些細胞）中的一或多者的試劑盒。
[0217] 在另一個方面，本發明涉及一種用於體外培育細胞的試劑盒。試劑盒包含一或多 個容器，其中第一容器含有本發明的培養基。試劑盒可進一步包含一或多個其它容器，每 一容器含有一或多種選自由以下各項組成的群組的補充劑：一或多種細胞因子、肝素、一或 多種動物或動物來源肽、一或多種酵母肽和一或多種植物肽（優選地是來自大米、蘆薈、大 豆、玉米、小麥、豌豆、南瓜、菠菜、胡蘿蔔、馬鈴薯、甘薯、木薯、鱷梨、大麥、椰子和/或綠豆 和/或一或多種其它植物的一或多種肽）。
[0218] 本發明的試劑盒可進一步包含一或多個容器，所述一或多個容器包含核酸和/或 有助於將至少一種大分子（例如核酸）引入到培養在本發明培養基中的細胞中的試劑（即 轉染試劑）。優選的轉染試劑包括（但不限於）陽離子脂質等。
[0219] 根據本發明的一個方面的試劑盒可包含本發明的培養基、一或多種替代化合物 (其可為一或多種結合金屬的化合物）和/或一或多種過渡元素絡合物中的一或多者，且可 任選地包含一或多種核酸和轉染試劑。根據本發明的另一個方面的試劑盒可包含一或多種 細胞培養基（其中的一者可為基礎培養基）且任選地包含一或多種替代化合物。本發明的 試劑盒還可含有關於使用試劑盒來培養細胞和/或將大分子或化合物（例如核酸，如DNA) 引入到細胞中的說明書。
[0220] 相關領域的技術人員將易於清楚的是，對本文中所述的方法和應用的其它適合修 改和改編是顯而易見的且可在不脫離本發明或其任何實施例的範圍的情況下進行。現已詳 細描述本發明，通過參考以下實例將更清楚地理解本發明，所述實例僅出於說明的目的隨 同包括在內且並不打算限制本發明。
[0221] 【實施例】
[0222] 【目的】
[0223] 為了開發將蛋白質產量增到最大（超過用可商購的瞬時表達系統（如Freestyle? 293系統）獲得的產量至少2倍）的細胞培養基和轉染系統。系統應對於多種蛋白質類型 和在多種懸浮細胞中起作用。系統應增加再現性且將變異性減到最少且應是可按比例擴大 的（多孔板到大規模）。本發明的其它實施例包括開發改進的表達載體、被調適用於在高密 度培養條件下在本發明的培養系統中生長的高密度細胞系、使用且併入轉染增強子（如丙 戊酸和丙酸鈉（除其它之外））。本發明的另一個目的是開發一種能夠以高細胞密度轉染的 方案，其並不涉及在轉染期間或之後進行培養基更換，且其簡單並易於使用。
[0224] 應了解，本發明出於清楚的目的描述於分開的實施例的情形中的某些特徵還可以 組合形式提供於單個實施例中。相反地，出於簡潔的目的描述於單個實施例的情形中的本 發明的各種特徵還可以分開地或以任何適合的子組合形式提供。
[0225] 【實施例1 :高密度培養基】
[0226] 評估多種可商購的無血清、無蛋白質培養基維持細胞密度高達約14X IO6個細胞/ 毫升且由此用於本發明的實踐的經調適293F細胞系的存活率的能力。選擇這樣的無血清、 無蛋白質培養基：其中培養物細胞系經超過一周的時間範圍存活率保持較高且甚至接近幾 乎15 X IO6個細胞/毫升的密度，同時還能夠以出人意料高的約3 X IO6個細胞/毫升的細 胞密度（相較於目前可商購的瞬時轉染系統的IX IO6個細胞/毫升）轉染。結果描繪於 圖1中，其展示使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統可實現的所得細胞密度的圖 式。先前被調適用於高密度生長的細胞經3代緩慢調適到各種測試的生長培養基中。細胞 調適的培養基包括根據本發明的一個實施例的高密度培養基（實心圓）、測試培養基1 (實 心三角形）、測試培養基2 (空心三角形）和測試培養基3 (空心菱形）。將細胞在每一培養 基中培養多代，隨後以〇. 2 X IO6個細胞/毫升接種於30ml燒瓶中。在經實驗過程不補給、 更換或另外補充生長培養基的情況下，經8天監測細胞密度和存活率。所選生長培養基之 一（高密度生長培養基；實心圓）經實驗過程能夠維持出人意料高密度的所培養的懸浮細 胞而不實質上損失存活率。因此，所屬領域的技術人員可能易於評估用於作為細胞系變異 體的特定細胞系的多種生長培養基，其中生長培養基可基於有助於經所界定時間段培育高 密度懸浮細胞而不必替換、補充或補給培養基的能力進行選擇。這可由熟練的業內人士在 無過度實驗的情況下實現。
[0227] 【實施例2 :細胞系優化】
[0228] 儘管本發明的實踐中可使用多種懸浮細胞，但優選的是使用已被調適用於本發明 的實施例和所選高密度生長培養基的細胞系。另外，細胞可經特定選擇以實現高密度生長、 高存活率和增加的蛋白質表達。為了實現這一點，親本293F成纖維細胞經歷了廣泛的調適 過程，所述過程涉及經數代逐漸更換培養基。另外，應注意經調適的細胞大小和表達能力伴 隨後代增加。在第72代，將細胞在ATCC庫存且通過基因分析驗證，且將其認證為無支原體 汙染的293F細胞。將細胞解凍且檢驗其存活率。將細胞傳30代以驗證穩定性、表達性能 和其在生長於培養物中時保持高存活率和高達約20 X IO6個細胞/毫升的密度的能力。與 原始細胞系（系1)相比，如上文所述的針對增加的細胞密度、存活率和人IgG表達進行選 擇的細胞群體展示出多到約1. 7倍的hlgG。高產量調適的細胞（系3)還具有增加的生長 速率、存活率和細胞大小。
[0229] 圖2展示概述用於根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的細胞系表達優化 的條形圖。將親本293F細胞系分割成多個傳代培養物，隨後將所述多個傳代培養物調適到 高密度培養基中。能夠以高密度生長的各個傳代培養物接著針對其表達重組測試蛋白（人 類IgG)的能力進行選擇和評估。標記為高產量調適的293F細胞的細胞的傳代培養物（右 組條形）與來源於相同親本293F細胞系的細胞的兩種不同傳代培養物相比表達多35%到 45%之間的重組IgG。因此，所屬領域的技術人員可能易於獲得已經特定選擇以用於生長培 養基的細胞系或細胞系衍生物，且可基於有助於經所界定時間段培育高密度懸浮細胞而不 必替換、補充或補給培養基的能力進行選擇。這可由熟練的業內人士在無過度實驗的情況 下實現。
[0230] 【實施例3 :由表達增強劑輔助的瞬時轉染】
[0231] 在組合實驗中測試一組化學添加劑以評估每一組分或一或多種組分的組合對蛋 白質產量的相對貢獻。鑑別出顯著改進蛋白質產生的多種轉染/表達增強劑。組分被調配 成2種穩定增強劑溶液。轉染增強劑1(丙戊酸，如上所定義）使hlgG表達加倍。增強劑 2(丙酸鈉，如上所定義）單獨不具有強作用，但與增強劑1組合，提供了相較於對照（既無 增強劑1也無增強劑2)多到幾乎3倍的hlgG。
[0232] 圖3展示概述根據一些實施例的瞬時轉染系統中所用的各種增強劑1和增強劑2 的作用的條形圖。組分被調配成2種穩定增強劑溶液。表達增強劑1的加入使hlgG表達 加倍（比較前兩個條形）。增強劑2本身的加入僅展示對IgG增強表達的邊際作用，但當與 增強劑1組合加入時，相較於對照提供多到幾乎3倍的hlgG(比較第三和第四）。
[0233] 【實施例4 :蛋白質表達結果】
[0234] 本發明的瞬時表達系統可以產生在lg/L到約2g/L之間的人IgG和Cripto。本 發明系統的瞬時表達系統展示出在與可商購的Freestyle? 293系統相比時在圖4A到4D 中所示的蛋白質的瞬時蛋白質表達方面在3. 5X-11. 8X之間的增加。圖4展示使用根據 一些實施例的高產量瞬時轉染系統和現有技術瞬時轉染系統（Freestyle? 293系統）的4 種不同且獨特蛋白質的表達水平的比較。圖4A展示在與可商購的Freestyle? Max系統相 比時使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的人類IgG表達的大於5倍的增加。圖 4B展示在與可商購的Freestyle? Max系統相比時使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉 染系統的Cripto表達的大於5. 2倍的增加。圖4C展示在與可商購的FreeStyle? Max系 統相比時使用根據本發明的一些實施例的瞬時轉染系統的β 2-腎上腺素受體表達的幾乎 4倍的增加。圖4D展示在與可商購的FreeStyle? Max系統相比時使用根據本發明的一些 實施例的瞬時轉染系統的兔IgG表達的大於11倍的增加。
[0235] 【實施例5 :EP0表達、可按比例擴大性和再現性】
[0236] 接下來，我們試圖探討使用具臨床重要性的廣泛使用的所表達蛋白質的瞬時轉染 系統的可按比例擴大性和再現性。使用本發明的瞬時轉染系統（圖式右側上的條形）和 Freestyle? 293系統（圖式左側上的條形）表達紅血球生成素（EPO)。本發明系統可從 Iml (呈24孔板形式）按比例擴大到1L(3L搖瓶形式）。在來自三個不同實驗室的三個獨 立分析員的結果中可見極好的再現性。
[0237] 【結論】
[0238] 使用高產量瞬時轉染系統實現兩種不同蛋白質的lg/L表達。高密度培養基能夠 實現高密度轉染。經由細胞系選擇獲得對瞬時蛋白質表達的顯著改進。轉染增強子以高細 胞密度改進轉染和表達。結果是非常可按比例擴大且可再現的。本發明的瞬時轉染系統與 FreestyleTM293系統相比在蛋白質表達方面實現3. 5倍-15倍增加。
[0239] 本說明書中所提及的所有公開、專利和專利申請在此以全部引用的方式併入本說 明書中，達到如同每一單獨的公開、專利或專利申請被專門並且單獨地指示以引用的方式 併入本文中的相同程度。倘若有衝突，則將以本文說明書（包括定義）為準。對本申請中 任何參考文獻的引用或確認不應被解釋為承認所述參考文獻可用作本發明的現有技術。
【權利要求】
1. 一種在培養的真核細胞中產生重組蛋白的方法，所述方法包含： 在高密度培養基中獲得包含細胞的懸浮培養物，所述懸浮培養物具有在約2 X 106到約 2X107個細胞/毫升之間的細胞密度； 用包含可表達的核酸的表達載體轉染所述細胞，所述表達載體含有能夠產生所表達的 蛋白質的基因序列； 將所述經轉染的細胞孵育第一時間段； 使所述經轉染的細胞與至少一種表達增強劑組合物接觸； 將所述經轉染的細胞在所述轉染增強劑存在下孵育第二時間段，使得所述載體表達所 述蛋白質；以及 在所述第二時間段之後收穫所述經轉染的細胞。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述培養的真核細胞是適宜於在高密度條件下生 長的懸浮培養物。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養物包含293細胞、293細胞的衍生 物、293F細胞、293F細胞的衍生物、PER-C6細胞、PER-C6細胞的衍生物、CHO細胞、CHO細胞 的衍生物、CapT細胞、CapT細胞的衍生物、COS細胞、COS細胞的衍生物、C0S-7細胞、C0S-7 的衍生物、Sp2/0細胞或Sp2/0細胞的衍生物，其中所述細胞已適宜於在高密度條件下生 長。
4. 根據權利要求3所述的方法，其中所述懸浮培養物包含293F細胞的衍生物。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養物的體積在約200 y L到約5L範圍 內。
6. 根據權利要求1所述的方法，其中所述表達組合物包含以下各者中的至少一者：丙 戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞碸（DMS0)、包括半乳糖的糖、胺基酸混合物、 或丁酸、或上述的任何組合。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中所述表達組合物包含丙戊酸。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中丙戊酸（VPA)的濃度在約0. 20mM到約25mM範圍 內。
9. 根據權利要求7所述的方法，其中丙戊酸濃度在以下範圍內：約0.25mM到約24mM、 約 0? 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0? 30mM 至IJ 約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、約 0. 40mM 到約 14mM、 約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 1 ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 至IJ 約 5mM、約 0? 50mM 到約 4mM、約 0? 50mM 到約 4mM、約 0? 55mM 到約 3mM、0. 6mM 到約 2mM 或 0? 75 到約 1. 5mM、約 0? 15mM 到約 1. 5mM、約 0? 16mM 到約 1. 5mM、約 0? 17mM 到約 1. 5mM、約 0? 18mM 到約 1. 5mM、約 0. 19mM 到約 1. 5mM、約 0. 20mM 到約 1. 5mM、約 0. 25mM 到約 1. 5mM、約 0. 30mM 到約 1. 5mM、約 0? 40mM 到約 1. 5mM、約 0? 50mM 到約 1. 5mM、約 0? 60mM 到約 1. 5mM、約 0? 70mM 到約 1. 5mM、約 0. 80mM 到約 1. 5mM、約 0. 90mM 到約 1. 5mM 或約 0. lOmM 到約 1. 5mM。
10. 根據權利要求6所述的方法，其中所述表達組合物包含丙酸鈉。
11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述培養物中丙酸鈉的最終濃度在約〇. 2mM到 約lOOmM範圍內。
12. 根據權利要求10所述的方法，其中所述培養物中丙酸鈉的最終濃度在以下範圍 內：約 0. 5 到約 80mM、約 0. 4mM 到約 70mM、約 0. 5mM 到約 60mM、約 0. 6mM 到約 50mM、約 0. 7mM 到約40mM、約0. 8mM到約30mM、約0. 9mM到約20mM、約ImM到約15mM、約2mM到約10mM、約 3mM到約9mM、約4mM到約8mM或約5mM到約7mM，在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP 的最佳最終濃度可能在以下範圍內：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約2mM到約3mM、約 3mM到約4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM到約8mM、約8mM至lj 約9mM或約9mM到約10mM，在某些優選但非限制性的實施例中，NAPP的最佳最終濃度可能 是約 ImM、約 1. 5mM、約 2mM、約 2. 5mM、約 3mM、約 3. 5mM、約 4mM、約 4. 5mM、約 5mM、約 5. 5mM、 約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 10mM。
13. 根據權利要求6所述的方法，其中所述表達組合物包含乙酸鋰。
14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述培養物中LiAc的最終濃度在約0. 25到約 25mM範圍內。
15. 根據權利要求13所述的方法，其中所述培養物中LiAc的最終濃度在以下範圍內： 約 0. 26mM 到約 20mM、約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0? 3mM 到約 4. 5mM、約 0? 31mM 到約 4mM、約 0? 35mM 到約 3mM、約 0? 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 至IJ 約3mM、約1. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
16. 根據權利要求6所述的方法，其中所述表達組合物包含丁酸。
17. 根據權利要求16所述的方法，其中所述培養物中丁酸的最終濃度在以下範圍內： 約 0? 25 到約 25mM、約 0? 26mM 到約 20mM、約 0? 27mM 到約 15mM、約 0? 28mM 到約 10mM、約 0? 29mM 到約5禮、約0.31111到約4.51111、約0.311111到約41111、約0.351111到約31111、約0.51111到約2.51111、 約ImM到約3mM、約1. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
18. 根據權利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養物的體積在約25mL yl到約50L範 圍內。
19. 根據權利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養物的體積在約100mL yl到約1L範 圍內。
20. 根據權利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養物的體積在約200mLia到約 500mL範圍內。
21. 根據權利要求1所述的方法，其中所述轉染步驟的細胞密度在約IX 106到約 20X 106個細胞/毫升之間。
22. 根據權利要求1所述的方法，其中所述轉染步驟的細胞密度在約2X106到約 6X106範圍內。
23. 根據權利要求1所述的方法，其中所述表達載體是pCDNA3. 3的衍生物。
24. 根據權利要求23所述的方法，其中所述p⑶NA3. 3的衍生物包含WPRE元件。
25. 根據權利要求1所述的方法，其中所述表達載體包含WPRE元件。
26. 根據權利要求1所述的方法，其中所述方法在所述轉染步驟之後並不需要更換、補 給或補充所述高密度培養基。
27. 根據權利要求1所述的方法，其中所述高密度培養基在所述轉染步驟之後並不經 更換、補給或補充。
28. 根據權利要求1所述的方法，其中所述高密度培養基是無血清/無蛋白質的化學成 分確定的培養基，其能夠促進經轉染的細胞以超過2. 5 X 106個細胞/毫升的細胞密度以保 持超過80 %的細胞存活率生長。
29. 根據權利要求28所述的方法，其中所述高密度培養基在所述轉染步驟之後並不需 要所述培養基的所述補充、更換或補給。
30. 根據權利要求1所述的方法，其進一步包含在所述第二時間段之後收穫所述經轉 染的細胞。
31. 根據權利要求30所述的方法，其進一步包含純化所述經表達的蛋白質。
32. 根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞表達一或多種表達增強性蛋白質。
33. 根據權利要求32所述的方法，其中所述表達增強性蛋白質選自由以下組成的清 單41(1'、？18、？21、8(31-父1和？1?&。
34. 根據權利要求32所述的方法，其中所述細胞瞬時表達一或多種表達增強性蛋白 質。
35. 根據權利要求32所述的方法，其中所述細胞穩定表達一或多種表達增強性蛋白 質。
36. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第一時間段在以下範圍內：約2小時到約4 天、約3到約90小時、約4到約85小時、約5到約80小時、約6到約75小時、約7到約70 小時、約8到約65小時、約9到約60小時、約10到約55小時、約11到約50小時、約12到 約45小時、約13到約40小時、約14到約35小時、約15到30小時、約16到約24小時、約 17到約24小時、約18到約24小時、約19到約24小時、約20到約24小時、約21到約24 小時、約22到約24小時或約23到約24小時，在其它優選非限制性實施例中，第一時間段 可能高達約15小時、高達約16小時、高達約17小時、高達約18小時、高達約19小時、高達 約20小時、高達約21小時、高達約22小時、高達約23小時、高達約24小時、高達約25小 時、高達約26小時、高達約27小時、高達約28小時、高達約29小時或高達約30小時。
37. 根據權利要求1所述的方法，其中所述第二時間段在以下範圍內：約10小時到約 10天、約2小時到5天、約2. 5小時到4天、約3到約90小時、約4到約85小時、約5到約 80小時、約6到約75小時、約7到約70小時、約8到約65小時、約9到約60小時、約10到 約55小時、約11到約50小時、約12到約45小時、約13到約40小時、約14到約35小時、 約15到30小時、約16到約24小時、約17到約24小時、約18到約24小時、約19到約24 小時、約20到約24小時、約21到約24小時、約22到約24小時或約23到約24小時，在其 它優選非限制性實施例中，第一時間段可能高達約15小時、高達約16小時、高達約17小 時、高達約18小時、高達約19小時、高達約20小時、高達約21小時、高達約22小時、高達 約23小時、高達約24小時、高達約25小時、高達約26小時、高達約27小時、高達約28小 時、高達約29小時或高達約30小時。
【文檔編號】C12N5/00GK104364369SQ201380031703
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年5月2日 優先權日:2012年5月2日
【發明者】S·K·瓦蘇, H·C·丘, J·羅傑斯, M·西斯內羅斯, J·李, C·Y·劉, M·瓊斯 申請人:生命技術公司