一種用於預防和治療腫瘤的疫苗的製作方法

2023-12-08 20:14:26 2

專利名稱：一種用於預防和治療腫瘤的疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於疫苗及其製備，特別是指一種用於預防和治療腫瘤的疫苗及其製備。
背景技術：
腫瘤是嚴重威脅人類健康的頭號殺手，根據WHO報告，目前全球每年新發癌症病 人約1000萬，死亡660萬，預計未來25年內將有3億新病例，1億死於該病。我國每年新發 病例160萬至200萬，現有癌症病人300多萬人，並以3%的速度遞增且呈年輕化趨勢。手 術、放療和化療是治療惡性腫瘤的三大傳統方法，由於惡性腫瘤的生物學特性，使上述治療 方法都存在一定的局限性，隨著免疫學、分子生物學與基因工程技術的發展，以免疫治療為 代表的生物治療己成為繼手術、化療和放療後的第四種腫瘤治療模式。腫瘤抗原被宿主免 疫系統的效應細胞和效應分子識別，是進行免疫治療的基礎，伴隨人類腫瘤抗原的不斷揭 示，治療性腫瘤疫苗成為生物治療的熱點課題之一。體液免疫的作用是中和胞外抗原，而腫瘤抗原多是胞內蛋白，因此腫瘤疫苗的設 計應以誘導細胞免疫為主。腫瘤細胞一般不表達MHC-II類分子，所以腫瘤免疫中T細胞作 用的研究主要集中在CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)上，許多研究表明CTL在識別和清除 腫瘤細胞中發揮著重要的作用，過繼轉移腫瘤特異性CTL或用MHC-I限制的肽疫苗免疫小 鼠，均可有效抑制腫瘤；抗原刺激的DC(樹突狀細胞)疫苗在腫瘤治療中也具有巨大潛力； 然而當這些治療措施進行臨床試驗時，儘管也產生了 CTL，但療效極不明顯。造成腫瘤疫苗 臨床試驗失敗的原因是多方面的。在缺乏⑶4+T細胞的情況下，CTL抗腫瘤效應微弱而且短暫，這一現象使人們逐漸 認識到CD4+T細胞對於CD8+CTL細胞反應的重要性。越來越多的證據表明，CD4+T細胞不僅 可直接抑制腫瘤，而且在激活CTL以及產生和維持長期記憶性CD8+T細胞方面發揮著中心 作用。⑶4+T細胞對於⑶8+T細胞的激活以及記憶細胞的產生和維持是必需的。給黑色素 瘤患者過繼轉移包括⑶8+和⑶4+T細胞的同源腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，可以觀察到顯著 的臨床應答，並且轉移的T細胞保持長期活性(2年)。相反，僅過繼轉移腫瘤反應性CD8+T 細胞克隆，則觀察不到臨床應答，而且兩周後在外周血中就已經檢測不到這些細胞了。這種 輔助作用的機制為(1)抗原提呈細胞(APC)表面的主要組織相容性抗原MHC-II提呈適當抗原給 ⑶4+T細胞，並激活⑶4+T細胞，導致⑶40L的表達，與APC表面的⑶40結合，從而被激活的 APC表達共刺激分子(如B7)，這些被激活的APC進一步通過B7-⑶28共刺激而激活⑶8+T 細胞。(2)⑶4+T細胞通過TRAIL依賴的機制控制記憶性⑶8+T細胞的產生。在缺乏 CD4+T細胞輔助下激活的CD8+T細胞會上調TRAIL，並且在再次遇到抗原時激活誘導細胞死 亡(Al⑶)，而那些在⑶4+T細胞輔助下激活的⑶8+T細胞不會上調TRAIL，當再次遇到抗原 時就會產生大量的克隆擴增。既然已經證明⑶4+T細胞在臨床上的確是有用的，那麼非特異性輔助(如B肝核心抗原是最有效的CTL應答促進劑)還是蛋白特異性T細胞輔助(來自於同一個蛋白的 CD4+T細胞表位)更有效呢？研究表明後者是最有效的。幾個研究證實最有效的CTL產 生需要⑶4+T細胞和⑶8+T細胞識別同一個APC上的抗原。綜上所述一個抗原中同時含有可以激活⑶4+T和⑶8+T細胞的表位是腫瘤疫苗 的理想策略(即⑶4+T細胞表位和⑶8+T細胞表位串聯連接在一起)。腫瘤是由不同病理表現及生物學行為的細胞亞群構成的，不同個體的同一類腫瘤 及同一腫瘤在不同器官或不同分化階段往往表達不同的相關抗原；含單一抗原的腫瘤疫苗 所誘導的免疫應答是高度特異性的，而它針對的靶標是高度異質性和變化性的，這是單一 肽疫苗僅能在個別腫瘤患者中產生臨床效果的主要原因之一，解決這一問題方法主要有兩 個，一是使用含多個抗原肽的疫苗，二是使用通用腫瘤抗原(或廣譜腫瘤抗原)，即無論哪 類腫瘤、無論在什麼器官、也無論是什麼分化階段的腫瘤均表達這種腫瘤抗原，而正常細胞 幾乎不表達。無疑後者是最理想的，目前絕對符合該條件的腫瘤抗原還未找到，但已經發現 幾個可以在絕大部分腫瘤中表達的抗原，如(人端粒酶逆轉錄酶)hTERT、Survivin等等。hTERT是端粒酶的催化亞單位，在90%以上的腫瘤中過表達，且與腫瘤的惡性程 度密切相關，而正常的人類細胞，除造血幹細胞、激活的B細胞等分裂旺盛的細胞表達端粒 酶外，絕大多數無端粒酶活性，也不表達hTERT，這使得hTERT成為一種廣譜的腫瘤相關抗 原，是一個腫瘤免疫治療的重要靶點。

發明內容
本發明的目的在於提供一種含多個抗原肽的用於預防和治療腫瘤的疫苗及其制 備方法。當用肽meTERT和/或真核表達重組質粒免疫機體後，肽meTERT會被抗原提呈細 胞攝取，並被切割成上述的7個表位肽片段，然後分別提呈給7種T細胞克隆，特異性地激 活表位特異性的CD4+T細胞和CD8+T細胞；而真核表達重組質粒被細胞攝取後，首先在細胞 中表達成肽meTERT，然後再被切割成上述的7個表位肽片段，分別提呈給7種T細胞克隆， 特異性地激活表位特異性的⑶4+T細胞和⑶8+T細胞；在⑶4+T細胞分泌的細胞因子的輔 助下，CD8+CTL可以特異性殺死表達hTERT的腫瘤細胞，從而起到預防和治療作用。即在體 內最終真正發揮免疫激活作用的實質上是每一個獨立的表位肽，將它們串聯起來的目的是 為了使hTERT特異性(因為這些表位肽來源於抗原蛋白hTERT)的⑶4+T細胞和⑶8+T細 胞能夠同時被有效激活，通過這兩種細胞的相互作用，從而發揮更好的殺傷作用。因此，理 論上這7個肽無論以何種順序串聯連接不會影響其在體內對T細胞的激活作用。表位的選擇查閱大量英文文獻，選擇目前已經鑑定的並且有研究表明具有確切 的免疫原性的表位，另外，由於表位肽只有通過與抗原提呈細胞的MHC I或MHC II類分子 結合成複合物才能激活T細胞，所以表位的選擇同時考慮了兼顧大多數人群的MHC I或II 類分子的限制性。表位核苷酸序列的確定在Genbank中查到hTERT的全長胺基酸和核苷酸序列，通 過表位的胺基酸殘基序列和位置，在全長核苷酸序列中找到對應的核苷酸序列以及表位序 列兩側各兩個胺基酸殘基對應的核苷酸。表位序列的連接是共價連接，可以通過基因重組的方法實現。根據表位的核苷酸
10序列設計引物，使用重疊延伸PCR方法將各表位基因串聯連接成片段，經一定的內切酶切 害!]，與原核表達質粒連接，轉化原核宿主細胞，表達複合表位肽；也可以與真核載體相連，直 接引入被免疫的機體，在體內的細胞中表達複合表位肽。本發明的整體技術構思是用於預防和治療腫瘤的疫苗，連接後的多表位端粒酶逆轉錄酶核苷酸序列如下gaggagatcctggccaagttcctgcactggctgatgagtaccttgacagacctccagccgtacatgcga cagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaagca cttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggctga agtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc0用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，製備方法包括如下工藝步驟A、表位序列的選擇；B、多表位端粒酶逆轉錄酶的核苷酸的串聯連接；C、多表位端粒酶逆轉錄酶DNA疫苗的製備；D、多表位端粒酶逆轉錄酶多表位肽疫苗的製備。本發明的具體的技術解決方案還有所述的步驟A表位的選擇中包括如下特異性表位1540ILAKFLHWL ；
R865RLVDDFLLV ；
K973KLFGVLRLK ；
V324VYAETKHFL ；
V461VYGFVRACL ；
R672RPGLLGASVLGLDDI
L766LTDLQPYMRQFVAHL。步驟B是設計8條首尾互補的引物，經過4輪PCR反應，得到編碼多表位肽的DNA 片段，即多表位端粒酶逆轉錄酶基因。步驟B包括如下工藝步驟Bi、第一步擴增體系為10XPCR緩衝液2微升，2. 5毫摩爾的dNTP2微升，10微摩 爾合成引物RT1、FTl各1微升，5單位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去離子水至20微 升；PCR反應條件為94°C預變性1分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒、72°C延伸30秒， 擴增5個循環；72°C繼續延伸1分鐘；B2、隨後三步擴增均以上一步PCR產物稀釋50倍作為模板進行；擴增體系同步驟 A，只是引物第二步PCR選用RT2和FT2，第三步選用RT3和FT3 ；PCR反應條件為94°C預變 性1分鐘；94°C變性30秒，55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒，擴增30個循環；72 °C繼續延伸 5分鐘；第四次PCR擴增後所得目的基因即為多表位端粒酶逆轉錄酶meTERT ；1. 2%瓊脂糖 凝膠電泳分析聚合酶鏈式反應產物；合成的首尾重疊的引物如下5，一3』FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG ；FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC ；FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA ；
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FTl TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC ；RTl CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC ；RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG ；RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT ；RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。步驟C是將PCR產物分別用BamH I.Not I雙酶切，連接到雙酶切的pcDNA3. 1⑴ V5His表達載體中，得重組質粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT ；對構建的載體分別進行PCR、酶 切和DNA測序鑑定；以構建的pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT質粒為模板進行PCR，經瓊脂糖凝 膠電泳，在200-500bp之間出現目的條帶，結果與預期一致；pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT經 內切酶BamH I和Not I雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳，出現大小兩個片段，分別為質粒和插入 的目的片段；經測序鑑定，結果均表明該質粒的插入序列正確。步驟C包括如下工藝步驟
Cl、PCR回收產物及PCDNA3. 1 (+)V5His質粒的酶切
取pcDNA3. l(+)V5His質粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成
pcDNA3. l(+)V5His 質粒10 μ 1
BamHI1 μ 1
Not I1 μ 1
IOXK Buffer2μ 1
無菌水6 μ 1
將PCR回收產物15μ 1，用BamHI和Not I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成
PCR產物15μ 1
BamHI1 μ 1
Not I1 μ 1
IOXK Buffer 2μ 1
無菌水 1 μ 1
C2、DNA片段的純化回收
將酶切後的PCR片斷及pcDNA3. 1 (+)V5His載體電泳後切膠加入600微升的溶膠
液，50°C -60°C放置2分鐘；將融化後的溶液放入離心純化柱中，以13000轉/分鐘轉速離 心30秒，倒掉收集管中的廢液，加入500微升80%乙醇，以13000轉/分鐘轉速離心30秒， 倒掉收集管中的廢液；將純化柱套入乾淨的1. 5毫升離心管中，加入30微升緩衝液，放置2 分鐘，離心30秒，-20°C保存；C3、DNA 的連接PCR產物及pcDNA3. 1⑴V5His酶切後經瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段後連 接，連接體系由如下體積的組份組成PCR回收產物7μ1pcDNA3. l(+)V5His 1 μ 1T4DNA 連接酶1 μ 1
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IOXBuffer1 μ 1反應條件為16°C水浴16h。C4、細菌的轉化加入10 μ 1連接產物至感受態細胞，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，再冰浴2分 鍾，加850 μ 1不含氨苄青黴素的LB培養基振搖45-50分鐘後，以4000轉/分鐘轉速離心10 分鐘，加100 μ 1新鮮的LB培養基將菌液懸起，塗於LB瓊脂平板上，瓊脂平板中含100 μ g/ ml氨苄青黴素，置於37°C培養過夜；C5、質粒的小量提取挑取3個菌落用LB培養基進行增菌，然後提取質粒；質粒DNA的提取採用鹼裂解 方法進行；按試劑盒說明取過夜培養的菌液3ml，以12000轉/分鐘轉速離心1分鐘，收集 菌體，重懸於250 μ 1溶液Pl，振蕩至徹底懸浮；加入250 μ 1溶液Ρ2，溫和顛倒數次，使菌體充分裂解；加入350 μ 1溶液Ρ3，溫和顛倒數次，以1200轉/分鐘轉速離心10分鐘，小心將上 清加入吸附柱CB3，室溫放置1-2分鐘，以1200轉/分鐘轉速離心1分鐘，取出吸附柱，倒掉 流出的液體，將吸附柱重新放回收集管中；加入700ul洗液，以1200轉/分鐘轉速離心1分鐘，再重複洗一次，棄廢液後，以 1200轉/分鐘轉速空轉2分鐘，取出吸附柱，放入1. 5ml的Eppendorf管中，加入30 μ 1 ρΗ =8. 0的TE緩衝液洗脫，室溫放置2分鐘，以12000轉/分鐘轉速離心1分鐘，收集洗脫液 即為提取的質粒，於-20°C貯存；C6、酶切鑑定質粒取5 μ 1提取的質粒，BamH I和Not I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組 成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 10 μ 1BamH I1 μ 1Not I1 μ 1IOXM Buffer2μ 1無菌水6 μ 1反應條件為37°C、3小時，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳；C7、PCR擴增鑑定重組體PCR反應體系由如下體積的組份組成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 5μ 12. 5mmol/L 4 XdNTP1 μ 1FT2 μ 1RT2 μ 1IOXM Buffer4μ 1TaqDNA 聚合酶1 μ 1無菌水25 μ 1PCR反應條件為94°C預變性1分鐘，94°C變性30秒，58°C復性30秒，72°C延伸30 秒，最後72°C延伸5分鐘；擴增30個循環，抽取擴增產物5μ 1，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，用DNA Marker來判斷擴增片段的大小；C8、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質粒瞬時轉染 C0S-7 細胞C8 (1)、C0S-7 細胞培養於含10%滅活胎牛血清、青黴素100U/ml、鏈黴素100U/ml的RPMI-1640培養液 中，置於含5% C02、飽和溼度、37°C恆溫培養箱中進行培養，每2-3天傳代一次。C8 (2)、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質粒轉染 C0S-7 細胞脂質體法轉染(1)處理細胞轉染前一天將每孔IO5個細胞放入Iml無抗生素的RPMI1640培養液中，待細胞長 至70%時開始轉染；(2)準備DNA-脂質體混合液b液將2 μ 1脂質體用無血清無雙抗培養基稀釋成100 μ 1，輕輕混勻，室溫放置5 分鐘；a液將5 μ g質粒加入到100 μ 1無血清無雙抗培養基中，輕輕混勻；室溫放置5 分鐘後，與A液輕輕混勻，室溫放置20分鐘；(3)棄去孔內培養基，每孔加入Iml無雙抗無血清1640培養基，將200 μ IDNA-脂 質體溶液加入到含有細胞和培養基的培養孔中，輕輕混勻；(4)將細胞培養於37°C含5% C02培養箱中培養48小時。C8 (3)、轉染後鑑定jestern-blot法鑑定meTERT多肽的表達C8 (3-1)、SDS-PAGE 培養48小時後分別收取轉染pcDNA3. l(+)V5His-meTERT質粒的C0S-7細胞，轉染 pcDNA3. 1 (+)V5His空質粒的C0S-7細胞以及未轉染的C0S-7細胞，用細胞裂解液將細胞裂 解，離心後取上清，分別加入等量2倍十二烷基磺酸鈉_聚丙烯醯胺凝膠電泳緩衝液，煮沸 5分鐘。各取20微升進行轉移電泳；聚丙烯醯胺凝膠的配製方法如下分離膠12%積層膠5%水2.6ml2.1ml30% 丙稀醯胺3.2ml0.5mlTrispH = 8. 82. 0mlpH = 6. 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110% 過硫酸銨80μ130 μ 1TEMED4 μ 13 μ 1C8(3_2)、電轉膜電泳結束後，取一塊與凝膠等大的醋酸纖維素膜貼在凝膠上，夾於六片等大的濾 紙中間，各層之間避免產生氣泡；凝膠一側置於陰極，電流160毫安轉膜3小時；取出膠在 染液中染色，觀察效果；C8 (3-3)、轉膜結束後將膜取出用水洗淨，加封閉液於4°C封閉12小時，將封閉後 的膜用洗液以10分鐘/次的速度洗4次後，與1 500稀釋的抗鼠的HisB單克隆抗體共 同孵育1小時；用洗液洗2次，用磷酸鹽緩衝液洗兩次，每次10分鐘；然後與1 1000稀釋
14的鹼性磷酸酶標記兔抗鼠IgG反應1小時；再用磷酸鹽緩衝液_吐溫20洗液洗4次，加底 物顯色後，放入水中終止顯色；與染色的凝膠對比觀察實驗結果，看有無特異性條帶出現。步驟D 是設計了引物 T-R(EcoR I) :5，ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGA3，， 以FT4引物為上遊引物，以T-R(EcoR I)為下遊引物，以PCR產物序列為模板，進行PCR反 應，將上述PCR產物分別用BamH I.EcoR I雙酶切，連入原核表達質粒pGEX_4T中，得重組 表達質粒pGEX-meTERT，分別經PCR、酶切及測序鑑定，表明meTERT的DNA片段正確插入了 質粒中。將鑑定正確的質粒轉化大腸桿菌E. coli 81^21，371培養至00600為0.4-0.6，1 丁6 誘導表達，收集菌體，SDS-PAGE分析；Western-blot檢測蛋白GST_meTERT的表達；親和層 析純化 GST-meTERT。步驟D包括如下工藝步驟Dl、PCR回收產物及pGEX-4T質粒的酶切取pGEX-4T質粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成pGEX-4T 質粒10 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水6μ1將PCR回收產物15 μ 1，用BamHI和EcoR I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成PCR 產物15 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水1 μ 1D2、採用步驟Dl的方法將DNA片段純化回收；D3、DNA 的連接將步驟D2中的PCR產物及pGEX_4T酶切後經瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收目的片段 後連接，連接體系由如下體積的組分組成
0139]PCR回收產物5μ1
0140]pGEX-4T Vector2μ 1
0141]T4DNA 連接酶Ιμ
0142]IOXBuffer1 μ 1反應的條件為16°C水浴16小時；D4、酶切鑑定陽性克隆將步驟D3中的產物轉化感受態細胞，提取質粒，取提取的質粒10 μ 1，行雙酶切鑑 定，酶切體系由如下體積的組分組成重組質粒7μ1BamHI1 μ 1
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EcoRI1 μ 1IOXK Buffer 2μ 1無菌水9μ1反應的條件為37°C、3小時，酶切產物行瓊脂糖電泳分析；D5、採用步驟D4的方法進行PCR鑑定；D6、採用步驟D4的方法將鑑定陽性的質粒和pGEX-4T空質粒分別轉化至表達宿主 菌E.coli BL21；D7、小量誘導蛋白GST-meTERT和GST表達挑取單個菌落接種於含有氨苄青黴素ΙΟΟμ g/ml的LB培養基中，37°C培養過夜； 次日按1 50擴大培養，37°C培養至菌密度為A600 = 0. 6-0. 9時，加入終濃度為lmmol/L 的IPTG，繼續培養4小時，取1. 5ml離心菌，100 μ 1水懸浮沉澱，加100 μ 1 2xSDS凝膠加樣 緩衝液，煮沸10分鐘，離心後取10 μ 1進行SDS-PAGE分析；
聚丙烯醯胺凝膠的配製過程如下 分離膠12%
水
2. 6ml 30% 丙稀醯胺 3.2ml
積層膠5% 2. Iml 0. 5ml Tris(lmol/L) pH = 8. 82. Oml pH6. 80. 38ml
10% SDS 10%過硫酸銨 TEMED
80 μ 130 μ 1
80 μ 1 30 μ 1 4μ 1 3μ 1 D8、Western-blot 檢測蛋白 GST-meTERT 和 GST 的表達
取誘導後的BL21表達菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE電泳，電泳完畢，切膠浸泡 於去離子水中，並剪取與膠大小相似的PVDF膜及濾紙六張，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分鐘 後，將膠、PVDF膜及濾紙置電轉移液中平衡5分鐘。排列順序從負極到正極依次為三層濾 紙、膠、PVDF膜、三層濾紙，各層之間排空氣泡，兩端夾好，4°C、160毫安電轉移3小時，用IX 麗春紅染色觀察蛋白轉移效果。然後將其用水洗淨，加封閉液於4°C封閉12小時，TBST洗 液按照10分鐘/次洗4次後，與1 800稀釋的GST單抗37°C共同孵育1小時；採用上述 方法用TBST洗滌，然後與1 1000稀釋的AP標記馬抗鼠IgG 37。C反應1小時；TBST洗滌 2次，去離子水漂洗1次，BCIP/NBT顯色觀察結果；D9、大量誘導表達蛋白GST-meTERT和GST接種單菌落於IOOml含羧苄青黴素100 μ g/ml的LB培養基，37 °C培養過夜，按 1 4將過夜菌接種於新鮮的含羧苄青黴素100 μ g/ml的LB培養基，37°C、250轉/分鐘培 養3小時，至菌液0D600 = 0. 6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續培養5小時，離心菌，將菌 體反覆3次，用超聲裂解液懸浮菌體，反應條件為10ml/g溼菌體；超聲波破碎後，反應條件 為350瓦X 30分鐘，4°C、8000g離心15分鐘，沉澱主要為包涵體，將上清、包涵體與Marker 進行SDS-PAGE電泳鑑定；DlO、純化目的蛋白 GST-meTERT 和 GST將步驟D9中的沉澱重懸於9倍體積包涵體洗液中，室溫放置5分鐘，4°C、8000g 離心5分鐘；沉澱重懸於15mlTriton/lL菌液，充分混勻，4°C、12000g離心10分鐘，重
16復4次；再將沉澱重懸於去15mlTriton/lL菌液，4°C、12000g離心10分鐘；用尿素洗液 15mlTriton/lL菌液洗滌菌體，4°C、12000g離心10分鐘，重複4次；溶解純化的包涵體在15ml變性緩衝液/升菌液中，充分混勻，4°C過夜，使其充分 溶解；4°C、12000g離心20分鐘，吸上清置於一乾淨的新管中，加入15μ 1 β-巰基乙醇， 40CU小時，將其裝入處理好的透析袋中，放在加入8Μ尿素的復性緩衝液中，4°C透析，濃度 梯度為1摩爾濃度/2小時。透析完成後，將GST-meTERT和GST分別分裝入Ep管，瞬時離心取上清，冷凍幹 燥，-80°C保存。本發明所取得的實質性特點和顯著的技術進步在於該疫苗免疫機體後可激活表位特異性的⑶4+T細胞和⑶8+T細胞，在⑶4+T細胞 分泌的Thl型細胞因子的輔助下，⑶8+CTL可以特異性殺死表達hTERT的腫瘤細胞，從而對 腫瘤起到預防和治療作用。


圖1是meTERT的⑶4+和⑶8+T細胞表位的串聯連接片段電泳圖。圖2是真核重組表達質粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT的構建示意圖。圖3是重組質粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT的PCR(A)和酶切⑶鑑定電泳圖。圖4是真核表達質粒pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT轉化真核細胞C0S-7的Western blot鑑定圖譜。圖5是原核重組表達質粒pGEX-meTERT的構建示意圖。圖6是重組質粒pGEX-meTERT的PCR (A)和酶切(B)鑑定電泳圖。圖7是重組蛋白GST-meTERT的表達(A) ,Western-blot鑑定(B)和純化(C)的電 泳圖。圖8是用流式細胞儀檢測的脾細胞中⑶4+T和⑶8+T細胞的比例。圖9是用LDH法檢測的特異性的CTL殺傷活性的示意圖。附圖中各個視圖中的標記說明如下圖1中泳道1. DNA標準分子量Marker ；2.第一次重疊延伸PCR後的結果片段 (Tl) ；3.第二次重疊延伸PCR後的結果片段(T2) ；4.第三次重疊延伸PCR後的結果片段 (T3) ；5.第四次重疊延伸PCR後的結果片段(meTERT)。圖3中A，泳道1. DNA標準分子量Marker ；2. meTERT核苷酸片段對照；3. PCR擴增 的片段；B，泳道1. DNA標準分子量Marker ；2. BamH I/Not I 雙酶切重組質粒pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT ；3. meTERT 核苷酸片段對照。圖 4 中 1. pcDNA3. 1 (+) V5His_meTRET 轉染的 C0S-7 細胞；2.空質粒 pcDNA3. 1 (+) V5His轉染的C0S-7細胞；3.未轉染的C0S-7細胞。圖6中A，泳道1.DNA標準分子量Marker ；2. PCR擴增的片段；3. meTERT核苷酸片 段對照；B，泳道1. DNA標準分子量Marker ；2. meTERT核苷酸片段對照；3. BamHI/Not I雙 酶切重組質粒 pcDNA3. 1 (+)V5His-meTERT。
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圖7中A，1.蛋白標準分子量Marker ；2.未誘導的coli-pGEX-meTERT ；3、4.誘導的 coli-pGEX-meTERT ；5.誘導的 coli-pGEX-meTERT 的上清；6.誘導的 E. coli-pGEX-meTERT 的沉澱；7.誘導的E. coli-pGEX-4T的沉澱；B，1.融合蛋白 GST-meTERT 的 Western-blot 結果；2.載體蛋白 GST 的 Western-blot 結果；C，1.蛋白標準分子量Marker ；2.未誘導的coli-pGEX-meTERT ；3.誘導的 E. coli-pGEX-meTERT ；4.純化的融合蛋白GST-meTERT ;5.純化的載體蛋白GST。圖9中A，靶細胞為GST-meTERT蛋白刺激的SP/^20時的特異性CTL殺傷活性；B,靶細胞為GST蛋白刺激的SP/20時的特異性CTL殺傷活性。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的實施例做進一步描述，但不應理解為對本發明的限定。 本發明的保護範圍以權利要求記載的內容為準。用於預防和治療腫瘤的疫苗，連接後的多表位端粒酶逆轉錄酶核苷酸序列如下gaggagatcctggccaagt tcctgcactggctgatgagtacct tgacagacctccagccgtacatgc gacagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaag cacttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggct gaagtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc0用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，製備方法包括如下工藝步驟A、表位序列的選擇；B、多表位端粒酶逆轉錄酶的核苷酸的串聯連接；C、多表位端粒酶逆轉錄酶DNA疫苗的製備；D、多表位端粒酶逆轉錄酶多表位肽疫苗的製備。本發明的具體的技術解決方案還有所述的步驟A表位的選擇中包括如下特異性表位1540ILAKFLHWL ；
R865RLVDDFLLV ；
K973KLFGVLRLK ；
V324VYAETKHFL ；
V461VYGFVRACL ；
R672RPGLLGASVLGLDDI
L766LTDLQPYMRQFVAHL。所述的步驟B是設計8條首尾互補的引物，經過4輪PCR反應，得到編碼多表位肽 的 DNA 片段 meTERT。步驟B包括如下工藝步驟Bi、第一步擴增體系為10XPCR緩衝液2微升，2. 5毫摩爾的dNTP2微升，10微摩 爾合成引物RT1、FTl各1微升，5單位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去離子水至20微 升；PCR反應條件為94°C預變性1分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒、72°C延伸30秒， 擴增5個循環；72°C繼續延伸1分鐘；
B2、隨後三步擴增均以上一步PCR產物稀釋50倍作為模板進行；擴增體系同步驟 A，只是引物第二步PCR選用RT2和FT2，第三步選用RT 3和FT3 ；PCR反應條件為94°C預 變性1分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒、72°C延伸30秒，擴增30個循環；72°C繼續延 伸5分鐘；第四次PCR擴增後所得目的基因即為多表位端粒酶逆轉錄酶meTERT ；1. 2%瓊脂 糖凝膠電泳分析聚合酶鏈式反應產物；合成的首尾重疊的引物如下5，一3』FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG ；FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC ；FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA ；FTl TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC ；RTl CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC ；RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG ；RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT ；RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。PCR合成後的序列如下GCGGGATCC | GCC ACC ATG A丨 GCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACCAAGCACTTCCTCTACTCCTGGCAGGTGTACGGCTTCGTGCGGGCCTGCCTGCGCCGGAAACTCTTTGGGGTCTTGCGGCTGAAGTGTCACCGCCCCGGCCTCCTGGGCGCCTCTGTGCTGGGC
CTGGACGATATCGCGGCCGCTAT。該序列5』端含BamH I酶切位點，3』端含Not I酶切位點，這兩個酶切位點用於將 串聯序列插入到真核表達質粒pcDNA3. l(+)V5His中。電泳結果可見清晰的4條DNA片段，分別為4輪PCR的結果，第5泳道為目的片段 meTERT，片段大小與理論值相符，初步表明⑶4+和⑶8+T細胞表位正確連接(圖1)。所述的步驟C是將PCR產物分別用BamH I、Not I雙酶切，連接到雙酶切的 pcDNA3. 1 (+) V5Hi s表達載體中，得重組質粒pcDNA3. 1 (+) V5Hi s-meTERT ；對構建的載體 分別進行PCR、酶切和DNA測序鑑定；以構建的pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT質粒為模板進 行PCR，經瓊脂糖凝膠電泳，在200-500bp之間出現目的條帶，結果與預期一致(圖3A)； pcDNA3. l(+)V5His-meTERT經內切酶BamH I和Not I雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳，出現大小 兩個片段，分別為質粒和插入的目的片段(圖3B)；經測序鑑定，結果均表明該質粒的插入 序列正確。所述的步驟C包括如下工藝步驟Cl、PCR回收產物及pcDNA3. 1 (+) V5His質粒的酶切pcDNA3. l(+)V5His質粒10 μ 1，用BamHI和EcoRI進行雙酶切，酶切體系由如下體 積的組份組成pcDNA3. 1 (+) V5His 質粒 10 μ 1BamHI1 μ 1Not I1 μ 1
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IOXK Buffer2μ 1
無菌水6 μ 1
將PCR回收產物15μ 1，用BamHI和Not I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成
PCR產物15μ 1
BamHI1 μ 1
Not I1 μ 1
IOXK Buffer2μ 1
無菌水1 μ 1
C2、DNA片段的純化回收
將酶切後的PCR片斷及pcDNA3. 1 (+)V5His載體電泳後切膠加入600微升的溶膠
液，50°C -60°C放置2分鐘；將融化後的溶液放入離心純化柱中，以13000轉/分鐘轉速離 心30秒，倒掉收集管中的廢液，加入500微升80%乙醇，以13000轉/分鐘轉速離心30秒， 倒掉收集管中的廢液；將純化柱套入乾淨的1. 5毫升離心管中，加入30微升緩衝液，放置2 分鐘，離心30秒，-20°C保存；C3、DNA 的連接PCR產物及pcDNA3. 1⑴V5His酶切後經瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段後連 接，連接體系由如下體積的組份組成PCR回收產物7μ1pcDNA3. l(+)V5His1 μ 1T4DNA 連接酶1 μ 1IOXBuffer1 μ 1反應條件為16°C水浴16h。C4、細菌的轉化加入10 μ 1連接產物至感受態細胞，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，再冰浴2分 鍾，加850 μ 1不含氨苄青黴素的LB培養基振搖45-50分鐘後，以4000轉/分鐘轉速離心10 分鐘，加100 μ 1新鮮的LB培養基將菌液懸起，塗於LB瓊脂平板上，瓊脂平板中含100 μ g/ ml氨苄青黴素，置於37°C培養過夜；C5、質粒的小量提取挑取3個菌落用LB培養基進行增菌，然後提取質粒；質粒DNA的提取採用鹼裂解 方法進行；按試劑盒說明取過夜培養的菌液3ml，以12000轉/分鐘轉速離心1分鐘，收集 菌體，重懸於250 μ 1溶液Pl，振蕩至徹底懸浮；加入250 μ 1溶液Ρ2，溫和顛倒數次，使菌體充分裂解；加入350 μ 1溶液Ρ3，溫和顛倒數次，以1200轉/分鐘轉速離心10分鐘，小心將上 清加入吸附柱CB3，室溫放置1-2分鐘，以1200轉/分鐘轉速離心1分鐘，取出吸附柱，倒掉 流出的液體，將吸附柱重新放回收集管中；加入700ul洗液，以1200轉/分鐘轉速離心1分鐘，再重複洗一次，棄廢液後，以 1200轉/分鐘轉速空轉2分鐘，取出吸附柱，放入1. 5毫升的Eppendorf管中，加入30 μ 1 PH = 8. 0的TE緩衝液洗脫，室溫放置2分鐘，以12000轉/分鐘轉速離心1分鐘，收集洗脫液即為提取的質粒，於-20°C貯存；C6、酶切鑑定質粒取5 μ 1提取的質粒，BamH I和Not I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組 成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 10 μ 1BamH I1 μ 1Not I1 μ 1IOXM Buffer2μ 1無菌水6μ1反應條件為37°C 3h，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳；C7、PCR擴增鑑定重組體PCR反應體系由如下體積的組份組成pcDNA3. l(+)V5His_meTERT 5μ 12. 5mmol/L 4 XdNTP1 μ 1FT2 μ 1RT2 μ 1IOXM Buffer4μ 1TaqDNA 聚合酶1 μ 1無菌水25 μ 1PCR反應條件為94°C預變性1分鐘，94°C變性30秒，58°C復性30秒，72°C延伸30 秒，最後72°C延伸5分鐘；擴增30個循環，抽取擴增產物5μ 1，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增 結果，用DNA Marker來判斷擴增片段的大小；C8、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質粒瞬時轉染 C0S-7 細胞C8 (1)、C0S-7 細胞培養於含10%滅活胎牛血清、青黴素100U/ml、鏈黴素100U/ml的RPMI-1640培養液 中，置於含5% C02、飽和溼度、37°C恆溫培養箱中進行培養，每2-3天傳代一次。C8 (2)、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質粒轉染 C0S-7 細胞脂質體法轉染(1)處理細胞轉染前一天將每孔IO5個細胞放入Iml無抗生素的RPMI1640培養液中，待細胞長 至70%時開始轉染；(2)準備DNA-脂質體混合液 b液將2 μ 1脂質體用無血清無雙抗培養基稀釋成100 μ 1，輕輕混勻，室溫放置5 分鐘；a液將5 μ g質粒加入到100 μ 1無血清無雙抗培養基中，輕輕混勻；室溫放置5 分鐘後，與A液輕輕混勻，室溫放置20分鐘；(3)棄去孔內培養基，每孔加入Iml無雙抗無血清1640培養基，將200 μ IDNA-脂 質體溶液加入到含有細胞和培養基的培養孔中，輕輕混勻；(4)將細胞培養於37°C含5% C02培養箱中培養48小時。
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C8 (3)、轉染後鑑定jestern-blot法鑑定meTERT多肽的表達C8 (3-1)、SDS-PAGE 培養48小時後分別收取轉染pcDNA3. l(+)V5His_meTERT質粒的C0S-7細胞，轉染 pcDNA3. 1 (+)V5His空質粒的C0S-7細胞以及未轉染的C0S-7細胞，用細胞裂解液將細胞裂 解，離心後取上清，分別加入等量2倍十二烷基磺酸鈉_聚丙烯醯胺凝膠電泳緩衝液，煮沸 5分鐘。各取20微升進行轉移電泳；聚丙烯醯胺凝膠的配製方法如下分離膠12% 積層膠5%水2. 6ml2. Iml30% 丙稀醯胺 3.2ml0.5mlTrispH = 8. 82. Oml pH = 6. 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110% 過硫酸銨80 μ 130 μ 1TEMED4 μ 13 μ 1C8 (3-2)、電轉膜電泳結束後，取一塊與凝膠等大的醋酸纖維素膜貼在凝膠上，夾於六片等大的濾 紙中間，各層之間避免產生氣泡；凝膠一側置於陰極，電流160毫安轉膜3小時；取出膠在 染液中染色，觀察效果；C8 (3-3)、轉膜結束後將膜取出用水洗淨，加封閉液於4°C封閉12小時，將封閉後 的膜用洗液以10分鐘/次的速度洗4次後，與1 500稀釋的抗鼠的HisB單克隆抗體共 同孵育1小時；用洗液洗2次，用磷酸鹽緩衝液洗兩次，每次10分鐘；然後與1 1000稀 釋的鹼性磷酸酶標記兔抗鼠IgG反應1小時；再用磷酸鹽緩衝液_吐溫20洗液洗4次，加 底物顯色後，放入水中終止顯色；與染色的凝膠對比觀察實驗結果，看有無特異性條帶出現 (圖 4)。所述的步驟D是設計了引物 T-R(EcoR I))) 5，ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCA CAGA3』，以FT4引物為上遊引物，以T-R(EC0R I)為下遊引物，以PCR產物序列為模板，進行 PCR反應，將上述PCR產物分別用BamH I、EcoR I雙酶切，連入原核表達質粒pGEX_4T中， 得重組表達質粒pGEX-meTERT，分別經PCR(圖5A)、酶切(圖5B)及測序鑑定，表明meTERT 的DNA片段正確插入了質粒中。將鑑定正確的質粒轉化大腸桿菌E. coli BL21，37°C培養 至0D600為0. 4-0. 6，IPTG誘導表達，收集菌體，SDS-PAGE分析；Western-blot檢測蛋白 GST-meTERT的表達；親和層析純化蛋白GST-meTERT。將鑑定為陽性的重組質粒轉化至Ε. coli BL21，誘導表達後，經SDS-PAGE電泳，結 果顯示誘導產物在35KD分子量附近出現高表達的蛋白條帶，與目的蛋白的分子量(37KD) 一致，而未誘導的菌沒有表達目的產物(圖6A) ；Western-blot結果表明經IPTG誘導的菌 體蛋白與GST單抗可產生特異性結合反應，在相應的目的條帶處有明顯雜交信號，而未轉 染的coli BL21菌體蛋白不與GST單抗反應，表明融合蛋白在coli BL21中成功表達(圖 6B)；經親和層析純化，SDS-PAGE電泳結果表明獲得了純化蛋白GST-meTERT(圖6C)。具體 操作步驟如下Dl、PCR回收產物及pGEX-4T質粒的酶切
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取pGEX-4T質粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成pGEX-4T 質粒 10 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer 2μ 1無菌水6 μ 1將PCR回收產物15 μ 1，用BamHI和EcoR I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組 分組成PCR 產物15 μ 1BamHI1 μ 1EcoRI1 μ 1IOXK Buffer 2μ 1無菌水1 μ 1D2、採用步驟Dl的方法將DNA片段純化回收；D3、DNA 的連接將步驟D2中的PCR產物及pGEX_4T酶切後經瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段 後連接，連接體系由如下體積的組分組成PCR回收產物5μ1pGEX-4T Vector2 μ 1T4DNA 連接酶1 μ 1IOXBuffer1 μ 1反應的條件為16°C水浴16小時；D4、酶切鑑定陽性克隆將步驟D3中的產物轉化感受態細胞，提取質粒，取提取的質粒10μ 1，行雙酶切鑑 定，酶切體系由如下體積的組分組成重組質粒7 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水9 μ 1反應的條件為37°C、3小時，酶切產物行瓊脂糖電泳分析；D5、採用步驟D4的方法進行PCR鑑定；。D6、採用步驟D4的方法將鑑定陽性的質粒和pGEX-4T空質粒分別轉化至表達宿主 菌 E.coli BL21 ；。D7、小量誘導蛋白GST-meTERT和GST表達挑取單個菌落接種於含有氨苄青黴素100μ g/ml的LB培養基中，37°C培養過夜； 次日按1 50擴大培養，37°C培養至菌密度為A600 = 0. 6-0. 9時，加入終濃度為lmmol/L 的IPTG，繼續培養4小時，取1. 5ml離心菌，100 μ 1水懸浮沉澱，加100 μ 1 2xSDS凝膠加樣
23緩衝液，煮沸10分鐘，離心後取 ο μ 1進行SDS-PAGE分析；聚丙烯醯胺凝膠的配製過程如下分離膠12%積層膠5%水2. 6ml2. Iml30% 丙稀醯胺3.2ml0.5mlTris (lmol/L)pH = 8. 82. OmlρΗ6· 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110%過硫酸銨80 μ 130 μ 1TEMED4μ 13μ 1D8、Western-blot 檢測蛋白 GST-meTERT 和 GST 的表達取誘導後的BL21表達菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE電泳，電泳完畢，切膠浸泡 於去離子水中，並剪取與膠大小相似的PVDF膜及濾紙六張，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分鐘 後，將膠、PVDF膜及濾紙置電轉移液中平衡5分鐘。排列順序從負極到正極依次為三層濾 紙、膠、PVDF膜、三層濾紙，各層之間排空氣泡，兩端夾好，4°C，160毫安電轉移3小時，用IX 麗春紅染色觀察蛋白轉移效果。然後將其用水洗淨，加封閉液於4°C封閉12小時，TBST洗 液按照10分鐘/次洗4次後，與1 800稀釋的GST單抗37°C共同孵育1小時；採用上述 方法用TBST洗滌，然後與1 1000稀釋的AP標記馬抗鼠IgG 37。C反應1小時；TBST洗滌 2次，去離子水漂洗1次，BCIP/NBT顯色觀察結果；D9、大量誘導表達蛋白GST-meTERT和GST接種單菌落於IOOml含羧苄青黴素100 μ g/ml的LB培養基，37 °C培養過夜，按 1 4將過夜菌接種於新鮮的含羧苄青黴素100 μ g/ml的LB培養基，37°C、250轉/分鐘培 養3小時，至菌液0D600 = 0. 6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續培養5小時，離心菌，將菌 體反覆3次，用超聲裂解液懸浮菌體，反應條件為10ml/g溼菌體；超聲波破碎後，反應條件 為350瓦X 30分鐘，4°C、8000g離心15分鐘，沉澱主要為包涵體，將上清、包涵體與Marker 進行SDS-PAGE電泳鑑定；D10、純化目的蛋白 GST-meTERT 和 GST將步驟D9中的沉澱重懸於9倍體積包涵體洗液中，室溫放置5分鐘，4°C、8000g 離心5分鐘；沉澱重懸於15mlTriton/lL菌液，充分混勻，4°C、12000g離心10分鐘，重複 4次；再將沉澱重懸於去15mlTriton/lL菌液，4°C、12000g離心10分鐘；用尿素洗液15ml TriWlL菌液洗滌菌體，4 0C、12000g離心10分鐘，重複4次；溶解純化的包涵體在15ml變性緩衝液/升菌液中，充分混勻，4°C過夜，使其充分 溶解；4°C、12000g離心20分鐘，吸上清置於一乾淨的新管中，加入15μ 1 β-巰基乙醇， 40CU小時，將其裝入處理好的透析袋中，放在加入8Μ尿素的復性緩衝液中，4°C透析，濃度 梯度為1摩爾濃度/2小時。。透析完成後，將GST-meTERT和GST分別分裝入Ep管，瞬時離心取上清，冷凍幹 燥，-80°C保存。小鼠的免疫 6-9周齡的雌性BALB/c小鼠30隻，隨機分為5組，分別為①PBS對照組；②空質粒 (pcDNA3. 1 (+) V5His)組，簡稱 PC ；③ DNA 疫苗(pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT)組，簡稱 PCT ；
24④GST-meTERT肽疫苗組，簡稱PCG ；⑤PCT+PCG聯合免疫組，即第一次用PCT免疫，第二及 第三次用PCG免疫。均以20%的氫氧化鋁為佐劑，PCT(100微克)免疫途徑為大腿肌肉注 射，PCG(50微克)為皮內多點注射免疫。共免疫3次，每次間隔10天，末次免疫後14天經 小鼠內眥靜脈取血，處死小鼠，取脾製備脾單細胞懸液，準備進行細胞免疫指標的檢測。流式細胞儀檢測⑶4+T和⑶8+T細胞(1)用生理鹽水洗滌離心脾細胞2次，調整細胞濃度為IX IO6個/ml ；(2)將細胞懸液分為2管，分別加入⑶4-FITC和⑶8_PE各10 μ 1，混勻後，室溫下 避光孵育30分鐘；(3)加生理鹽水2ml，振蕩，離心，洗滌2次，以除去未結合的螢光抗體；(4)用FACSsort型流式細胞儀進行檢測。結果見圖7，與PBS組比較，PCT、PG、PCT+PG組CD4+T和CD8+T細胞的百分率明顯 升高(P < 0. 01)，PCT+PG組與PCT或PG組比較⑶4+T和⑶8+T細胞的百分率亦明顯升高 (P < 0.01),表明肽疫苗和DNA疫苗單獨免疫和聯合免疫均能有效激活CD4+T和CD8+T細 胞，另外，聯合免疫能夠激活更多的CD4+T和CD8+T細胞。ELISP0T檢測細胞免疫應答的類型ELISP0T檢測具體操作按Cayman公司ELISP0T試劑盒產品說明書進行在96孔濾 膜板中加100微升/孔的70%乙醇，室溫放置10分鐘，倒掉乙醇，用PBS或包被緩衝液洗滌； 加100微升/孔適當稀釋的捕獲抗體，4°C包被過夜；傾空板子，用包被緩衝液洗滌2次，加 200微升/孔RPMI1640完全培養基，室溫封閉1小時；棄液，加入100微升/孔用RPMI1640 稀釋的抗原(GST-meTERT或GST)；每孔加入脾細胞IO6個/100微升，在37°C、5%二氧化碳 CO2培養箱中培養36小時；將培養物倒掉、拍幹，用洗液洗滌3次，加100微升/孔生物素標 記的檢測抗體，室溫放2小時。棄液，用洗液洗滌4次，加100微升/孔親和素標記的辣根 過氧化物酶，室溫放置45分鐘，洗滌，加100微升/孔新配置的底物液，室溫顯色10-60分 鍾，觀察斑點形成。加200微升/孔蒸餾水洗板3次終止反應。自然乾燥，用讀板機讀板。ELISP0T結果顯示GST蛋白刺激孔的各組細胞數無顯著性差異。而GST-meTERT 抗原刺激孔，PCT+PCG聯合免疫誘導的分泌幹擾素IFN-Y的淋巴細胞數量顯著高於其它各 組(P <0.01)；另外，PCT+PCG誘導的分泌幹擾素IFN-Y的淋巴細胞數顯著高於其誘導的 分泌白細胞介素IL-4的淋巴細胞數量。這些結果表明PCT+PCG聯合免疫比PCT或PCG單 獨免疫誘導的meTERT特異性⑶4+Th淋巴細胞免疫應答更強，而且PCT+PCG誘導了淋巴細 胞CD4+Thl型優勢應答，即肽疫苗和DNA疫苗聯合免疫誘導了有利於清除腫瘤細胞的細胞 免疫類型(圖8)。用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活性最後一次免疫後14天處死小鼠，取脾細胞，用0. 5微摩爾GST-meTERT體外刺激脾 細胞5天得效應細胞；取腫瘤細胞SP2/0細胞用10微摩爾GST-meTERT或GST蛋白刺激2 小時得兩種靶細胞，然後在96孔板中按不同的效/靶比100 1、50 1、25 1,12.5 1 加載效應細胞和靶細胞，未刺激的腫瘤細胞SP2/0細胞作為對照細胞，同時設置腫瘤細胞 SP2/0自然釋放乳酸脫氫酶孔和最大釋放乳酸脫氫酶孔，分別設3個復孔，在CO2培養箱 37°C共培養6小時，根據乳酸脫氫酶釋放試劑盒說明書檢測細胞毒性T淋巴細胞活性。特 異性細胞殺傷率(％)=(試驗組吸光度值-自然釋放組吸光度值)/(最大釋放吸光度
25值_自然釋放組吸光度值)。結果當靶細胞為GST刺激的SP/20時，各組均未產生有效的 CTL ；而當靶細胞為GST-meTERT刺激的SP/20時，與PBS組比較，PCT和PCG單獨免疫組在 效靶比為50 1和100 1時meTERT特異性殺傷活性均有一定的升高，但無統計學意義， 而PCT+PCG聯合免疫組所誘導的meTERT特異性CTL水平明顯高於其它各組(P < 0. 01)，表 明PCT+PCG聯合免疫誘導了顯著的特異性細胞毒性T淋巴細胞殺傷活性，即肽疫苗和DNA 疫苗聯合免疫誘導了具有強烈活性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，能夠有效殺死表達人端 粒酶逆轉錄酶(hTERT)的腫瘤細胞(圖9)。 上述描述僅作為本發明一種用於預防和治療腫瘤的疫苗及其製備方法可實施的 技術方案提出，不作為對其本身的單一限制條件。
權利要求
用於預防和治療腫瘤的疫苗，其特徵在於連接後的多表位端粒酶逆轉錄酶核苷酸序列如下gaggagatcctggccaagttcctgcactggctgatgagtaccttgacagacctccagccgtacatgcgacagttcgtggctcacctgctgcgtttggtggatgatttcttgttggtgacacctccggtgtacgccgagaccaagcacttcctctactcctggcaggtgtacggcttcgtgcgggcctgcctgcgccggaaactctttggggtcttgcggctgaagtgtcaccgccccggcctcctgggcgcctctgtgctgggcctggacgatatc。
2.根據權利要求1所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於製備方法包 括如下工藝步驟A、端粒酶逆轉錄酶表位序列的選擇；B、多表位端粒酶逆轉錄酶的核苷酸的串聯連接；C、多表位端粒酶逆轉錄酶DNA疫苗的製備；D、多表位端粒酶逆轉錄酶多表位肽疫苗的製備。
3.根據權利要求2所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於所述的步驟 A表位的選擇中包括如下特異性表位1540 ILAKFLHWL ； R865 RLVDDFLLV ； K973 KLFGVLRLK ； V324 VYAETKHFL ； V461 VYGFVRACL ； R672 RPGLLGASVLGLDDI ； L766 LTDLQPYMRQFVAHL。
4.根據權利要求2所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於所述的步驟 B是設計8條首尾互補的引物，經過4輪PCR反應，得到編碼多表位肽的DNA片段，即多表位 端粒酶逆轉錄酶基因。
5.根據權利要求4所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於所述的步驟 B包括如下工藝步驟Bi、第一步擴增體系為10XPCR緩衝液2微升，2. 5毫摩爾的dNTP2微升，10微摩爾 合成引物RT1、FT1各1微升，5單位/微升Taq DNA聚合酶1微升，加去離子水至20微升； PCR反應條件為94°C預變性1分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒、72°C延伸30秒，擴增 5個循環；72°C繼續延伸1分鐘；B2、隨後三步擴增均以上一步PCR產物稀釋50倍作為模板進行；擴增體系同步驟A，只 是引物第二步PCR選用RT2和FT2，第三步選用RT3和FT3 ；PCR反應條件為94°C預變性1 分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒、72°C延伸30秒，擴增30個循環；72°C繼續延伸5分 鍾；第四次PCR擴增後所得目的基因即為多表位端粒酶逆轉錄酶meTERT ；1. 2%瓊脂糖凝膠 電泳分析聚合酶鏈式反應產物；合成的首尾重疊的引物如下5』 —3'FT4 GCGGGATCCGCCACCATGAGCGAGGAGATCCTGGCCAAGTTCCTGCACTGG ； FT3 CAAGTTCCTGCACTGGCTGATGAGTACCTTGACAGACCTCCAGCCGTACATGC ； FT2 CTCCAGCCGTACATGCGACAGTTCGTGGCTCACCTGCTGCGTTTGGTGGATGA ；FTl TGCGTTTGGTGGATGATTTCTTGTTGGTGACACCTCCGGTGTACGCCGAGACC ； RTl CGAAGCCGTACACCTGCCAGGAGTAGAGGAAGTGCTTGGTCTCGGCGTACACC ； RT2 AAGACCCCAAAGAGTTTCCGGCGCAGGCAGGCCCGCACGAAGCCGTACACCTG ； RT3 GGCGCCCAGGAGGCCGGGGCGGTGACACTTCAGCCGCAAGACCCCAAAGAGTT ； RT4 ATAGCGGCCGCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGAGGCGCCCAGGAGGCCG。
6.根據權利要求2所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於所述的步驟 C是將PCR產物分別用BamH I、Not I雙酶切，連接到雙酶切的pcDNA3. 1 (+)V5His表達載 體中，得重組質粒pcDNA3. 1 (+) V5His-meTERT ；對構建的載體分別進行PCR、酶切和DNA測 序鑑定；以構建的pcDNA3. 1 (+)V5His-meTERT質粒為模板進行PCR，經瓊脂糖凝膠電泳，在 200-500bp之間出現目的條帶，結果與預期一致；pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT經內切酶BamH I和Not I雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳，出現大小兩個片段，分別為質粒和插入的目的片段； 經測序鑑定，結果均表明該質粒的插入序列正確。
7.根據權利要求6所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於所述的步驟 C包括如下工藝步驟Cl、PCR回收產物及pcDNA3. 1 (+)V5His質粒的酶切取pcDNA3. l(+)V5His質粒10μ 1，用BamHI和EcoRI進行雙酶切，酶切體系由如下體積 的組份組成pcDNA3. 1 (+) V5His 質粒10 μ 1BamHI1 μ 1Not I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水6 μ 1將PCR回收產物15μ 1，用BamHI和Not I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成C2、DNA片段的純化回收將酶切後的PCR片斷及pcDNA3. 1 (+)V5His載體電泳後切膠加入600微升的溶膠液， 500C _60°C放置2分鐘；將融化後的溶液放入離心純化柱中，以13000轉/分鐘轉速離心30 秒，倒掉收集管中的廢液，加500微升80%乙醇，以13000轉/分鐘轉速離心30秒，倒掉收 集管中的廢液；將純化柱套入乾淨的1. 5毫升離心管中，加入30微升緩衝液，放置2分鐘， 離心30秒，_20°C保存； C3、DNA的連接PCR產物及pcDNA3. 1 (+) V5His酶切後經瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段後連接， 連接體系由如下體積的組份組成PCR回收產物7μ1PCR產物 BamHI Not I15μ 1 1 μ 1 1 μ 1 2μ 1 1 μ 110ΧΚ Buffer無菌水pcDNA3. 1(+) V5His T4DNA連接酶 IOXBuffer1 μ 1 1 μ 1 1 μ 1反應條件為16°C水浴16h。 C4、細菌的轉化加入10 μ 1連接產物至感受態細胞，冰浴30分鐘，42°C熱休克90秒，再冰浴2分鐘，加 850 μ 1不含氨苄青黴素的LB培養基振搖45-50分鐘後，以4000轉/分鐘轉速離心10分 鍾，加100 μ 1新鮮的LB培養基將菌液懸起，塗於LB瓊脂平板上，瓊脂平板中含100 μ g/ml 氨苄青黴素，置於37°C培養過夜； C5、質粒的小量提取挑取3個菌落用LB培養基進行增菌，然後提取質粒；質粒DNA的提取採用鹼裂解方法 進行；按試劑盒說明取過夜培養的菌液3ml，以12000轉/分鐘轉速離心1分鐘，收集菌體， 重懸於250 μ 1溶液Pl，振蕩至徹底懸浮；加入250 μ 1溶液Ρ2，溫和顛倒數次，使菌體充分裂解；加入350 μ 1溶液Ρ3，溫和顛倒數次，以1200轉/分鐘轉速離心10分鐘，小心將上清加 入吸附柱CB3，室溫放置1-2分鐘，以1200轉/分鐘轉速離心1分鐘，取出吸附柱，倒掉流出 的液體，將吸附柱重新放回收集管中；加入700ul洗液，以1200轉/分鐘轉速離心1分鐘，再重複洗一次，棄廢液後，以1200 轉/分鐘轉速空轉2分鐘，取出吸附柱，放入1. 5ml的Eppendorf管中，加入30 μ 1 ρΗ = 8. 0的TE緩衝液洗脫，室溫放置2分鐘，以12000轉/分鐘轉速離心1分鐘，收集洗脫液即 為提取的質粒，於_20°C貯存； C6、酶切鑑定質粒取5 μ 1提取的質粒，BamH I和Not I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組份組成pcDNA3. 1(+)V5His-meTERT 10 μ 1BamH I1 μ 1Not I1 μ 1IOXM Buffer2μ 1無菌水6 μ 1反應條件為37°C、3小時，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳；C7、PCR擴增鑑定重組體PCR反應體系由如下體積的組份組成pcDNA3. 1(+)V5His-meTERT 5 μ 2. 5mmol/L4XdNTP1 μ 1FT2μ 1RT2μ 1IOXM Buffer4μ 1TaqDNA聚合酶1 μ 1無菌水25 μ 1PCR反應條件為94°C預變性1分鐘，94°C變性30秒，58°C復性30秒，72°C延伸30秒，最後72°C延伸5分鐘；擴增30個循環，抽取擴增產物5 μ 1，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結 果，用DNA Marker來判斷擴增片段的大小；C8、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質粒瞬時轉染 C0S-7 細胞 C8(l)、C0S-7細胞培養於含10%滅活胎牛血清、青黴素100U/ml、鏈黴素100U/ml的RPMI-1640培養液中，置 於含5% C02、飽和溼度、37°C恆溫培養箱中進行培養，每2-3天傳代一次。 C8 (2)、pcDNA3. 1 (+) V5His_meTERT 質粒轉染 C0S-7 細胞 脂質體法轉染(1)處理細胞轉染前一天將每孔IO5個細胞放入Iml無抗生素的RPMI1640培養液中，待細胞長至 70%時開始轉染；(2)準備DNA-脂質體混合液b液將2 μ 1脂質體用無血清無雙抗培養基稀釋成100 μ 1，輕輕混勻，室溫放置5分鐘；a液將5 μ g質粒加入到100 μ 1無血清無雙抗培養基中，輕輕混勻；室溫放置5分鐘 後，與A液輕輕混勻，室溫放置20分鐘；(3)棄去孔內培養基，每孔加入Iml無雙抗無血清1640培養基，將200μ IDNA-脂質體 溶液加入到含有細胞和培養基的培養孔中，輕輕混勻；(4)將細胞培養於37°C含5%C02培養箱中培養48小時。C8 (3)、轉染後鑑定jestern-blot法鑑定meTERT多肽的表達 C8(3-1)、SDS-PAGE 培養48小時後分別收取轉染pcDNA3. l(+)V5His-meTERT質粒的C0S-7細胞，轉染 pcDNA3. l(+)V5His空質粒的C0S-7細胞以及未轉染的C0S-7細胞，用細胞裂解液將細胞裂 解，離心後取上清，分別加入等量2倍十二烷基磺酸鈉_聚丙烯醯胺凝膠電泳緩衝液，煮沸 5分鐘。各取20微升進行轉移電泳；聚丙烯醯胺凝膠的配製方法如下分離膠12% 水2.6ml30%丙稀醯胺 3.2mlTris 10% SDS 10%過硫酸銨 TEMEDC8 (3-2)、電轉膜pH = 8. 82. Oml 80 μ 1 80 μ 1 4μ 1積層膠5% 2. Iml 0. 5mlpH = 6. 80. 38ml 30 μ 1 30 μ 1 3 μ 1電泳結束後，取一塊與凝膠等大的醋酸纖維素膜貼在凝膠上，夾於六片等大的濾紙中 間，各層之間避免產生氣泡；凝膠一側置於陰極，電流160毫安轉膜3小時；取出膠在染液 中染色，觀察效果；C8(3-3)、轉膜結束後將膜取出用水洗淨，加封閉液於4°C封閉12小時，將封閉後的膜 用洗液以10分鐘/次的速度洗4次後，與1 500稀釋的抗鼠的HisB單克隆抗體共同孵5育1小時；用洗液洗2次，用磷酸鹽緩衝液洗兩次，每次10分鐘；然後與1 1000稀釋的鹼 性磷酸酶標記兔抗鼠IgG反應1小時；再用磷酸鹽緩衝液-吐溫20洗液洗4次，加底物顯 色後，放入水中終止顯色；與染色的凝膠對比觀察實驗結果，看有無特異性條帶出現。
8.根據權利要求2所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於所述的步 驟 D 是設計了引物 T-R(EcoR I) :5，ACAGAATTCGATATCGTCCAGGCCCAGCACAGA3，，以 FT4 引物 為上遊引物，以T-R(EcoR I)為下遊引物，以PCR產物序列為模板，進行PCR反應，將上述 PCR產物分別用BamH I、EcoR I雙酶切，連入原核表達質粒pGEX_4T中，得重組表達質粒 pGEX-meTERT,分別經PCR、酶切及測序鑑定，表明meTERT的DNA片段正確插入了質粒中；將 鑑定正確的質粒轉化大腸桿菌E. coli BL21，37°C培養至0D600為0.4-0.6，IPTG誘導表 達，收集菌體，SDS-PAGE分析；Western-blot檢測蛋白GST-meTERT的表達；親和層析純化 GST-meTERT。
9.根據權利要求2所述的用於預防和治療腫瘤的疫苗的製備，其特徵在於所述的步驟 D包括如下工藝步驟Dl、PCR回收產物及pGEX-4T質粒的酶切取PGEX-4T質粒10 μ 1，用BamHI和EcoRI進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組分組成PGEX-4T 質粒10 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水6 μ 1將PCR收產物15μ 1，用BamHI和EcoR I進行雙酶切，酶切體系由如下體積的組分組成PCR 產物15 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水1 μ 1D2、採用步驟Dl的方法將DNA片段純化回收；D3、DNA的連接將步驟D2中的PCR產物及pGEX-4T酶切後經瓊脂糖凝膠電泳、切膠回收目的片段後連 接，連接體系由如下體積的組分組成PCR回收產物5μ1PGEX-4T Vector2 μ 1T4DNA連接酶1 μ 1'10 X Buffer1 μ 1反應的條件為16°C水浴16小時； D4、酶切鑑定陽性克隆將步驟D3中的產物轉化感受態細胞，提取質粒，取提取的質粒10μ 1，行雙酶切鑑定，酶切體系由如下體積的組分組成重組質粒7 μ 1BamHI1 μ 1EcoR I1 μ 1IOXK Buffer2μ 1無菌水9 μ 1反應的條件為37°C、3小時，酶切產物行瓊脂糖電泳分析；D5、採用步驟D4的方法進行PCR鑑定；D6、採用步驟D4的方法將鑑定陽性的質粒和PGEX-4T空質粒分別轉化至表達宿主菌 E.coli BL21 ；D7、小量誘導蛋白GST-meTERT和GST表達挑取單個菌落接種於含有氨苄青黴素ΙΟΟμ g/ml的LB培養基中，37°C培養過夜；次日 按1 50擴大培養，37°C培養至菌密度為A600 = 0.6-0.9時，加入終濃度為lmmol/L的 IPTG，繼續培養4小時，取1. 5ml離心菌，100 μ 1水懸浮沉澱，加100 μ 1 2xSDS凝膠加樣緩 衝液，煮沸10分鐘，離心後取10 μ 1進行SDS-PAGE分析； 聚丙烯醯胺凝膠的配製過程如下分離膠12%積層膠5%/K2.6ml2. Iml30% 丙稀醯胺3.2ml0.5mlTris(lmol/L)pH = 8. 82. OmlρΗ6· 80. 38ml10% SDS80 μ 130 μ 110%過硫酸銨80 μ 130 μ 1TEMED4 μ 13 μ 1D8、Western-blot 檢測蛋白 GST-meTERT 和 GST 的表達取誘導後的BL21表達菌株和BL21空菌株做SDS-PAGE電泳，電泳完畢，切膠浸泡於去 離子水中，並剪取與膠大小相似的PVDF膜及濾紙六張，PVDF膜在甲醇中浸泡3-5分鐘後， 將膠、PVDF膜及濾紙置電轉移液中平衡5分鐘。排列順序從負極到正極依次為三層濾紙、 膠、PVDF膜、三層濾紙，各層之間排空氣泡，兩端夾好，4°C、160毫安電轉移3小時，用IX麗 春紅染色觀察蛋白轉移效果。然後將其用水洗淨，加封閉液於4°C封閉12小時，TBST洗液 按照10分鐘/次洗4次後，與1 800稀釋的GST單抗37°C共同孵育1小時；採用上述 方法用TBST洗滌，然後與1 1000稀釋的AP標記馬抗鼠IgG 37。C反應1小時；TBST洗滌 2次，去離子水漂洗1次，BCIP/NBT顯色觀察結果；D9、大量誘導表達蛋白GST-meTERT和GST接種單菌落於100ml含羧苄青黴素100 μ g/ml的LB培養基，37°C培養過夜，按1 4 將過夜菌接種於新鮮的含羧苄青黴素100μ g/ml的LB培養基，37°C、250轉/分鐘培養3 小時，至菌液0D600 = 0.6，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續培養5小時，離心菌，將菌體 反覆3次，用超聲裂解液懸浮菌體，反應條件為10ml/g溼菌體；超聲波破碎後，反應條件為 350瓦X 30分鐘，4°C、8000g離心15分鐘，沉澱主要為包涵體，將上清、包涵體與Marker進 行SDS-PAGE電泳鑑定；7D10、純化目的蛋白GST-meTERT和GST將步驟D9中的沉澱重懸於9倍體積包涵體洗液中，室溫放置5分鐘，4°C、8000g離心5 分鐘；沉澱重懸於15mlTriton/lL菌液，充分混勻，4°C、12000g離心10分鐘，重複4次；再將 沉澱重懸於去15ml Triton/IL菌液，4°C、12000g離心10分鐘；用尿素洗液15ml Triton/IL 菌液洗滌菌體，40C、12000g離心10分鐘，重複4次；溶解純化的包涵體在15ml變性緩衝液/升菌液中，充分混勻，4°C過夜，使其充分溶解； 4°C、12000g離心20分鐘，吸上清置於一乾淨的新管中，加入15μ 1β-巰基乙醇，4°C、1小 時，將其裝入處理好的透析袋中，放在加入8M尿素的復性緩衝液中，4°C透析，濃度梯度為1 摩爾濃度/2小時。透析完成後，將GST-meTERT和GST分別分裝入Ep管，瞬時離心取上清，冷凍幹 燥，-80°C保存。
全文摘要
本發明屬於疫苗及其製備，特別是指一種用於預防和治療腫瘤的疫苗及其製備。提供一種用於預防和治療腫瘤的疫苗，採用包括端粒酶逆轉錄酶表位序列的選擇、多表位端粒酶逆轉錄酶的核苷酸的串聯連接、多表位端粒酶逆轉錄酶DNA疫苗的製備、多表位端粒酶逆轉錄酶多表位肽疫苗的製備等工藝步驟製成。本發明解決了單一肽疫苗僅能在個別腫瘤患者中產生臨床效果的不足。具有免疫機體後可激活表位特異性的CD4+T細胞和CD8+T細胞，在CD4+T細胞分泌的Th1型細胞因子的輔助下，CD8+CTL可以特異性殺死表達TERT的腫瘤細胞，對腫瘤起到預防和治療作用等優點。
文檔編號C12N15/12GK101920009SQ201010131658
公開日2010年12月22日 申請日期2010年3月6日 優先權日2010年3月6日
發明者吳麗娜, 曾瑞紅 申請人:河北醫科大學