一種複合電極及檢測河豚毒素含量的方法與流程
2023-12-08 20:22:11
本發明涉及食品快速檢測
技術領域：
，特別涉及一種複合電極及檢測河豚毒素含量的方法。
背景技術：
：河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一種低分子量的海洋生物神經性毒素，存在於多種生物體內。河豚毒素是一種典型的鈉離子通道抑制劑並且是小分子蛋白的穩定性麻痺毒素，是自然界中非蛋白質的最毒性物質之一，河豚毒素因其高毒性和在海鮮中的累積對人類健康是致命的。動物實驗中，靜脈注射和皮下注河豚毒素的半數致死劑量分別為2～10μgkg-1和10～14μgkg-1。因此，很有必要來開發一種分析方法來檢測河豚毒素，從而支持海鮮市場的監控。現有技術中已有很多河豚毒素的檢測方法，包括小鼠生物法、高效液相色譜法和液相色譜-質譜連用法。其中，小鼠生物法主要根據小鼠死亡時間來推斷河豚毒素的含量，即通過給小鼠投餵不同濃度的河豚毒素，觀察其死亡時間，從而推斷河豚毒素的含量。現有的河豚毒素檢測方法雖然能夠基本準確的檢測出河豚毒素的含量，但是檢測時間太長。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種複合電極及檢測河豚毒素含量的方法。本發明提供的檢測方法能夠在20分鐘以內檢出樣品中河豚毒素的含量，實現快速檢測。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種複合電極，包含電活性物質盛放容器、置於所述容器內的離子液體和單壁碳納米管的混合物以及部分伸入所述混合物內部的導線。優選的，所述離子液體和單壁碳納米管的質量比為(93～97):(3～7)。本發明提供了一種所述複合電極的製備方法，包括以下步驟：將包含離子液體和單壁碳納米管的混合物填滿所述容器內部，然後進行加熱處理；將導線的一端插入所述混合物中，得到所述複合電極。優選的，所述加熱處理的溫度為85～95℃；所述加熱處理的時間為1～5分鐘。本發明還提供了一種所述複合電極檢測河豚毒素含量的方法，包括以下步驟：提供待檢測樣品；以所述複合電極為工作電極，採用電化學間接酶聯免疫的方法對待檢測樣品進行檢測，得到電流差值；根據所述電流差值計算得到待檢測樣品中河豚毒素的含量。優選的，所述檢測採用三電極體系，具體為工作電極、參比電極和對電極。優選的，所述參比電極為氯化銀參比電極。優選的，所述對電極為鉑絲。優選的，所述電化學方法為安培時間法。優選的，所述安培時間法的電位為+0.7～+0.8V，掃描速率為0.01～0.02V/s。本發明提供了一種複合電極及檢測河豚毒素含量的方法。本發明複合電極，包含電活性物質盛放容器、置於所述容器內的離子液體和單壁碳納米管的混合物以及部分伸入所述混合物內部的導線。本發明以所述複合電極為工作電極，採用電化學間接酶聯免疫的方法對待檢測樣品進行檢測，得到待檢測樣品中河豚毒素的含量。根據實施例的實驗結果可知，本發明提供的檢測方法將電化學和免疫學相結合，能夠在20分鐘以內測定待測樣品中的河豚毒素的實際含量。此外，本申請提供的電化學方法與光學法的檢測結果基本一致，證明本申請提供的檢測方法具有較高的準確度。具體實施方式本發明提供了一種複合電極，包含電活性物質盛放容器、置於所述容器內的離子液體和單壁碳納米管的混合物以及部分伸入所述混合物內部的導線。本發明提供的複合電極包括盛放電活性物質的容器。本發明對所述容器的材質、尺寸沒有特殊的限制，採用本領域技術人員熟知的能夠用於電化學檢測的電極容器即可。在本發明中，所述容器具體的為玻璃圓管，所述玻璃圓管的直徑優選為0.15～0.2cm，更優選為0.15～0.19cm，最優選為0.17～0.18cm；所述玻璃圓管的長度優選為3.5～4.5cm，更優選為3.8～4.2cm，最優選為4cm。在本發明中，所述電活性物質為離子液體和單壁碳納米管的混合物。本發明對所述離子液體和單壁碳納米管的來源沒有特殊要求，採用本領域技術人員所述熟知的離子液體和單壁碳納米管即可，具體的可以為離子液體和單壁碳納米管的市售產品。在本發明中，所述離子液體可以為任意種類的離子液體，在本發明實施例中所述離子液體具體的為N-十六烷基吡啶六氟磷酸鹽，購於上海成捷化學有限公司。在本發明中，所述單壁碳納米管的長度優選5～30μm，更優選為10～25μm，最優選為15～20μm；所述單壁碳納米管的純度優選>95％；所述所述單壁碳納米管購於南京先豐納米材料科技有限公司。在本發明中，所述離子液體和單壁碳納米管的質量比優選為(93～97):(3～7)，更優選為95:5。本發明提供的複合電極還包括部分插入所述混合物中的導線。本發明對所述導線的材質沒有特殊的限制，能夠導電即可。在本發明中，所述導線優選為銅導線，所述銅導線的直徑優選為0.05～0.13cm，更優選為0.08～0.11cm，最優選為0.1cm。在本發明中，所述導線伸入混合物內部的長度優選為0.5～1cm，更優選為0.6～0.9cm，最優選為0.7～0.8cm。本發明提供了一種所述複合電極的製備方法，包括以下步驟：將包含離子液體和單壁碳納米管的混合物填滿所述容器內部，然後進行加熱處理；將導線的一端插入所述混合物中，得到所述複合電極。本發明將包含離子液體和單壁碳納米管的混合物填滿所述容器內部，然後進行加熱處理。本發明優選對包含離子液體和單壁碳納米管的混合物進行研磨，再將研磨後的混合物包含離子液體和單壁碳納米管的混合物。本發明對所述研磨的速率沒有特殊要求，能夠使得離子液體和單壁碳納米管混合均勻即可。本發明對所述研磨所用裝置沒有特殊要求，採用本領域技術人員所熟知的研磨裝置即可，具體的如研缽。在本發明中，所述研磨的時間優選為15～25分鐘，更優選為18～23分鐘，最優選為20分鐘。經過所述研磨之後，離子液體和單壁碳納米管的混合物呈灰色粉末狀。在本發明中，所述加熱處理的溫度優選為85～95℃，更優選為88～93℃，最優選為90℃；所述加熱處理的時間優選為1～5分鐘，具體的可以為1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘或5分鐘。所述加熱處理後，本發明將導線的一端插入所述混合物中，得到所述複合電極。在本發明中，所述導線以及插入的長度與上述技術方案所述一致，在此不再贅述。本發明還提供了一種利用上述技術方案所述複合電極檢測河豚毒素含量的方法，包括以下步驟：提供待檢測樣品；以所述複合電極為工作電極，採用電化學間接酶聯免疫的方法對待檢測樣品進行檢測，得到電流差值；根據所述電流差值計算得到待檢測樣品中河豚毒素的含量。本發明提取待檢魚中的河豚毒素，製備待檢測樣品。在本發明中，所述提取的過程優選包含如下步驟：對待檢魚進行宰殺，分離魚皮、魚肉和內臟，所述內臟包括魚肝和卵巢；對所述分離出的魚皮、魚肝和卵巢部位進行勻質和勻漿，得到漿液；將所述漿液與聚苯乙烯混合後進行分層處理，得到上清液；調節所述上清液的pH值至6.5～7.4，得到待檢測樣品。本發明對所述宰殺和分離的方法特殊的限制，採用本領域技術人員熟知的魚類的宰殺和分離方法即可。分離出魚皮、魚肝和卵巢部位後，本發明將所述魚皮、魚肝和卵巢部位進行勻質和勻漿。在本發明中，所述勻質優選具體為將魚皮、魚肝和卵巢部位混合均勻，所述勻漿優選為將魚皮、魚肝和卵巢部位的混合物進行打爛處理。本發明對所述打爛處理的方法沒有特殊要求，採用本領域技術人員所熟知的打爛方法得到漿液即可。得到漿液後，本發明將所述漿液與聚苯乙烯混合後進行分層處理，得到上清液。在本發明中，所述漿液的質量與聚苯乙烯的體積之比優選為(3～7)g:(45～55)mL，更優選為(4～6)g:(48～53)mL，最優選為5g:50mL。在本發明中，所述分層處理優選為離心處理；所述離心處理的轉速優選為3500～4500轉/分，更優選為3800～4300轉/分，最優選為4000轉/分；所述離心處理的時間優選為3～7分鐘，具體的可以為3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘或7分鐘。得到上清液後，本發明調節所述上清液的pH值至6.5～7.4，得到待檢測樣品。本發明優選通過添加氫氧化鈉來調節上清液的pH值，具體以氫氧化鈉溶液的形式添加，所述氫氧化鈉溶液的摩爾濃度優選為0.5～1.5mol/L，更優選為0.8～1.3M，最優選為1M。在本發明中，所述上清液的pH值為6.5～7.4，具體的可以為6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3或7.4。得到待檢測樣品後，本發明以所述複合電極為工作電極，採用電化學間接酶聯免疫的方法對待檢測樣品進行檢測。在本發明中，所述電化學酶聯免疫方法的具體過程優選為：將包含待檢測樣品與牛血清白蛋白偶聯河豚毒素包被磁性微球的混合物與河豚毒素抗體混合，進行第一孵育；將所述第一孵育得到的產品進行洗滌；將所述洗滌後的產品與鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G混合進行第二孵育；將所述第二孵育得到的產品進行洗滌後磁分離，去除上清液；將所述去除上清液後的產品與緩衝溶液和四硝基苯磷酸二鈉混合後進行電化學測定。將包含待檢測樣品與牛血清白蛋白偶聯河豚毒素包被磁性微球的混合物與河豚毒素抗體混合，進行第一孵育。在本發明中，所述磁性微球可以為市售產品，也可以為自製產品。在本發明中，所述磁性微球的製備方法，優選包含如下步驟：將六水合氯化鐵的乙二醇溶液與乙酸鈉和聚乙二醇混合，得到混合體系；對混合體系進行加熱處理，得到磁性微球。在本發明中，所述六水合氯化鐵的乙二醇溶液的濃度優選為30～35g/mL，更優選為32～34g/mL，最優選為33.75g/mL。在本發明中，所述六水合氯化鐵、乙酸鈉和聚乙二醇的質量比優選為(1～3):(3～5):(0.5～2)，更優選為(1.2～2):(3.2～4):(0.8～1.5)，最優選為1.35:3.6:1。得到混合體系後，本發明將所述混合體系進行加熱處理，得到磁性微球。在本發明中，所述加熱處理的溫度優選為180～220℃，更優選為190～210℃，最優選為200℃；時間優選為5～10小時，具體的可以為5小時、6小時、7小時、8小時、9小時或10小時。本發明優選對高溫處理得到的產品進行洗滌。在本發明中，所述洗滌優選為用無水乙醇進行洗滌；所述洗滌的次數優選為3～5次，具體的可以為3次、4次或5次。本發明優選將得到的磁性微球溶於無水乙醇中得到磁性微球的無水乙醇溶液，待用；所述無水乙醇和乙二醇的體積比優選為1:(0.5～1.5)，更優選為1:1。在本發明中，所述牛血清白蛋白偶聯河豚毒素包被磁性微球的製備方法優選包括以下步驟：使用一水嗎啉乙磺酸(MES)對所述磁性微球的無水乙醇溶液進行稀釋，得到稀釋液；將所述稀釋液與N-羥基丁二醯亞胺(NHS)溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液混合，進行第三次孵育；將第三次孵育得到的磁性微球與牛血清白蛋白偶聯河豚毒素(BSA-TTX)和MES混合，進行第四次孵育；對第四次孵育得到的包被微球進行屏蔽。本發明優選使用一水嗎啉乙磺酸(MES)對所述磁性微球的無水乙醇溶液進行稀釋，得到稀釋液。在本發明中，所述一水嗎啉乙磺酸的濃度優選為20～30mM，更優選為22～28mM，最優選為25mM。在本發明中，所述稀釋液的濃度優選為45～55mg/mL，更優選為48～53mg/mL，最優選為50mg/mL。本發明優選將所述稀釋液與N-羥基丁二醯亞胺(NHS)溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶液混合，進行第三次孵育。在本發明中，所述N-羥基丁二醯亞胺溶液的濃度優選為45～55mg/mL，更優選為48～53mg/mL，最優選為50mg/mL；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽溶液的濃度優選為45～55mg/mL，更優選為48～53mg/mL，最優選為50mg/mL。在本發明中，所述N-羥基丁二醯亞胺溶液和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺鹽酸鹽溶液的體積比優選為1:(0.5～1.5)，更優選為1:1；所述N-羥基丁二醯亞胺溶液和乙二醇的體積比優選為1:(500～1000)，更優選為1:800。在本發明中，所述第三次孵育的時間優選為20～40分鐘，更優選為25～35分鐘，最優選為30分鐘。本發明優選對第三次孵育得到的微球進行洗滌。在本發明中，所述洗滌優選為使用MES進行洗滌。本發明優選將磁性微球與牛血清白蛋白偶聯河豚毒素(BSA-TTX)和MES混合，進行第四次孵育。在本發明中，所述牛血清白蛋白偶聯河豚毒素(BSA-TTX)的濃度優選為50～150ng/mL，更優選為80～130ng/mL，最優選為100ng/mL。在本發明中，所述BSA-TTX和MES的體積比優選為(2～4):2，更優選為3:2；所述BSA-TTX和BHS的體積比優選為(2～4):1，更優選為3:1。在本發明中，所述第四次孵育的時間優選為20～40分鐘，更優選為25～35分鐘，最優選為30分鐘。本發明優選對第四次孵育得到的包被微球進行屏蔽。在本發明中，所述屏蔽優選為使用磷酸緩衝鹽溶液(PBS緩衝液)對包被微球的剩餘位點進行屏蔽。在本發明中，所述PBS緩衝液的濃度優選為5～15mmol/L，更優選為8～13mM，最優選為10mM；所述PBS緩衝液中優選還包含2wt％的BSA。在本發明中，所述屏蔽的時間優選為1～3小時，具體的可以為1小時、2小時或3小時。本發明以所述複合電極為工作電極，採用電化學方法對待檢測樣品進行檢測，得到電流差值，根據所述電流差值計算得到待檢測樣品中河豚毒素的含量。本發明所述檢測是基於間接酶聯免疫(ELISA)進行的。本發明將待檢測樣品與負載了牛血清白蛋白偶聯河豚毒素的磁性微球混合，然後再與河豚毒素抗體(Anti-TTX)混合，進行孵育。在本發明中，所述待檢測樣品與負載了牛血清白蛋白偶聯河豚毒素的磁性微球的體積比優選為100:(20～40)，更優選為100:30；所述待檢測樣品和Anti-TTX的體積比優選為1:(0.5～1.5)，更優選為1:1。在本發明中，所述Anti-TTX的濃度優選為50～150ng/mL，更優選為80～130ng/mL，最優選為100ng/mL。在本發明中，所述第一次孵育的溫度優選為35～40℃，更優選為36～39℃，最優選為37～38℃；時間優選為25～35分鐘，更優選為28～33分鐘，最優選為30分鐘。本發明用PBST對得到的孵育體系進行洗滌後，與鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G混合，進行第二次孵育。在本發明中，所述鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G購於上海浩曄生物技術有限公司。在本發明中，所述鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠免疫球蛋白G與待檢測樣品的體積比優選為1:(0.5～1.5)，更優選為1:1。在本發明中，所述第二次孵育的溫度優選為35～40℃，更優選為36～39℃，最優選為37～38℃；時間優選為25～35分鐘，更優選為28～33分鐘，最優選為30分鐘。所述第二孵育後，本發明將所述第二孵育得到的產品進行洗滌後磁分離。述磁分離後去除得到的上清液，再與緩衝溶液和四硝基苯磷酸二鈉混合進行電化學測定。在本發明中，所述四硝基苯磷酸二鈉(PNPP)為底物；所述底物和待檢測樣品的體積比優選為1:(0.5～1.5)，更優選為1:1；所述底物的濃度優選為0.1～0.3mol/L，更優選為0.2M。在本發明中，所述檢測以上述技術方案所述的複合電極作為工作電極，具體的採用三電極體系，分別為工作電極、參比電極和對電極。在本發明中，所述參比電極優選為氯化銀參比電極，對電極優選為鉑絲。在本發明中，所述電化學方法優選為安培時間法；所述安培時間法的檢測電位優選為+0.7～+0.8V，更優選為+0.75V；掃描速率優選為0.01～0.02V/s。所述電化學檢測後得到電流差值，本發明根據所述電流差值計算得到待檢測樣品中河豚毒素的含量。本發明提供了一種複合電極及檢測河豚毒素含量的方法。本發明複合電極，包含電活性物質盛放容器、置於所述容器內的離子液體和單壁碳納米管的混合物以及部分伸入所述混合物內部的導線。本發明提供的檢測河豚毒素含量的方法，包括以下步驟：提供待檢測樣品；以所述複合電極為工作電極，採用電化學方法對待檢測樣品進行檢測，得到電流差值；根據所述電流差值計算得到待檢測樣品中河豚毒素的含量。根據實施例的實驗結果可知，本發明提供的檢測方法將電化學和免疫學相結合，能夠在20分鐘以內測定待測樣品中的河豚毒素的實際含量。此外，本申請提供的電化學方法與光學法的檢測結果基本一致，證明本申請提供的檢測方法具有較高的準確度。下面結合實施例對本發明提供的複合電極及檢測河豚毒素含量的方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。實施例1製備複合電極：按質量比95:5稱取離子液體和單壁碳納米管，並在研缽中研磨混合20min後，用藥匙將混合物塞進直徑為1.8mm、長度為4cm的玻璃管中，並將玻璃棒中混合物塞緊。然後，將這根玻璃管放進90℃的烘箱內烘3min，待離子液體熔化後，將一根直徑為0.1cm導電用的銅絲插入玻璃管內，插入深度為0.5cm待冷卻，即得複合電極，電極表面可以直接用稱量紙磨平。實施例2待檢測樣品的製備：從當地市場採集樣品後進行宰殺，分離魚皮、魚肉與內臟，將魚皮、魚肝和卵巢部位切成小塊並進行均質。將5克勻漿後的樣品加入到含有50mL聚苯乙烯的離心管中，混合振蕩3min。將混合物離心5min(4000轉/分)，上層清液用1M氫氧化鈉調節pH值為7，振蕩30s，得到待檢測樣品，在4℃保存備用。空白樣本取自魚肉部分。本發明共選擇了五條不同的河豚，分別提取得到待檢測樣品1、待檢測樣品2、待檢測樣品3、待檢測樣品4和待檢測樣品5。實施例3磁性微球的製備:將1.35g六水合氯化鐵溶解於40mL乙二醇中，攪拌30min，繼續加入3.6g乙酸鈉和1g聚乙二醇(PEG20000)，充分混勻60min，放入50mL密封罐中，200℃反應8h，隨後用水迅速冷卻至室溫。再用無水乙醇洗滌四次，最後將磁性微球溶於40mL無水乙醇中，待用。BSA-TTX在磁性微球上的固定：合成的磁性微球用25mM的MES稀釋至50mgmL-1，然後加入50μLNHS(50mgml-1)和50μLEDC(50mgml-1)，緩慢旋轉，室溫下孵育30min。用300μLMES洗滌磁性微球兩次，用磁分離去除上清液。隨後在100μLMES(pH6.0)中加入150μLBSA-TTX(100ngmL-1)，混勻後加入磁性微球中，室溫下孵育30min。包被BSA-TTX後的磁性微球用10mMPBS緩衝液，內含2％BSA(pH7.4)來屏蔽磁球上其餘位點，室溫下孵育2h。磁球經過再次磁分離去除上清液後，儲存於10mMPBS緩衝液(pH7.4)，於4℃保存備用。實施例4電化學免疫分析：將100μL待檢測樣品與30μL已固定的BSA-TTX磁球一同加至200μL離心管中，再加入100μLAnti-TTX，37℃反應1h。用15mMPBST洗滌三次，加入100μL鹼性磷酸酶，37℃孵育30min。用15mMPBST洗滌三次，再經過磁分離，去除上清液，加入Tris緩衝液平衡5min，將液體移至電化學工作站。打開軟體CHI440，20分鐘以內獲得實驗結果，再對數據進行計算，最終得到河豚毒素的含量。在本發明中，所得的實驗最初結果是電化學電流變化曲線，進而計算得出電流變化曲線上電流差值，即終止時電流值與初始時電流值之差。本發明首先利用TTX標準品(濃度分別為0ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、15ng/mL和45ng/mL)，以TTX濃度(ng/mL)為橫坐標，以電流變化(μA)為縱坐標，得到一條標準曲線，即y＝-0.1356x+8.6302(R2＝0.9913)。本發明實際測得的電流差如表1所述，本發明將實際樣本檢測時得到的電流差值代入標準曲線方程中，即得到在實際樣本中的TTX濃度。表1待檢測樣品檢測得到的電流差值樣品電流差值(μA)17.75±0.0328.13±0.0237.72±0.0247.50±0.0357.56±0.02本發明還使用光學法對上述待檢測樣品1、待檢測樣品2、待檢測樣品3、待檢測樣品4和待檢測樣品5中的河豚毒素的濃度進行了檢測，本發明提供的電化學方法和光學法的檢測結果具體的如表2所示。表2電化學方法和光學法對待檢測樣品進行檢測的結果比較根據表2的測試結果可知，本申請提供的電化學方法與光學法的檢測結果基本一致，證明本申請提供的檢測方法具有較高的準確度。由以上實施例可知，本發明提供了一種複合電極及檢測河豚毒素含量的方法。本發明複合電極，包含電活性物質盛放容器、置於所述容器內的離子液體和單壁碳納米管的混合物以及部分伸入所述混合物內部的導線。本發明提供的檢測河豚毒素含量的方法，包括以下步驟：提供待檢測樣品；以所述複合電極為工作電極，採用電化學方法對待檢測樣品進行檢測，得到電流差值；根據所述電流差值計算得到待檢測樣品中河豚毒素的含量。根據實施例的實驗結果可知，本發明提供的檢測方法將電化學和免疫學相結合，能夠在20分鐘以內測定待測樣品中的河豚毒素的實際含量。此外，本申請提供的電化學方法與光學法的檢測結果基本一致，證明本申請提供的檢測方法具有較高的準確度。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3