免疫組化檢測試劑盒及其製備工藝的製作方法
2023-12-09 04:17:11 2
專利名稱：免疫組化檢測試劑盒及其製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種NDPK免疫組化檢測試劑盒及其製備工藝。
用nm23基因產物製成的試劑盒在國外已被用於臨床腫瘤轉移的檢測之中。這對於精確預測腫瘤轉移趨勢、制訂合理的治療方案及預後判斷均很有意義。研究表明，如果轉移灶中nm23基因表達高於平均水平，則這種病人在轉移灶切除後總體存活率顯著提高。已知nm23基因低表達是乳腺癌存在轉移的一個可靠標誌，故檢測乳腺癌組織中nm23基因表達水平有助於篩選對化療敏感的患者，並對其進行治療。
nm23基因是Steeg等用消減雜交技術從高轉移和低轉移鼠K-1735黑色素瘤細胞系cDNA文庫中分離出來的。人類nm23基因有兩個亞型，即nm23-H1和nm23-H2。兩者均定位於17號染色體靠近著絲點的位置，即17q21.3。nm23-H1全部編碼區由533個核苷酸組成，其蛋白質含152個胺基酸。nm23-H2基因編碼的蛋白質胺基酸順序與nm23-H1基因產物有88％的同源性。nm23-H2蛋白與二磷酸核苷激酶(NDPK)的胺基酸順序有90％左右的同源性。人類紅細胞NDPK由兩條多肽鏈組成，其中A鏈與nm23-H1編碼的胺基酸順序一致，B鏈與nm23-H2編碼的胺基酸順序一致。故證實nm23蛋白就是NDPK。NDPK是一組分子量為17KD的泛醌類酶，主要存在於胞漿和質膜上。NDPK功能呈多樣性，它能把結合於蛋白質上的二磷酸核苷(NDP)磷酸化成三磷酸核苷(NTP)，是細胞內NTP的主要製造者。NDPK通過兩種途徑參與細胞調節，一是影響微管聚合，在微管聚合過程中，需要將GDP轉換成GTP，微管相關的NDPK通過催化這一反應而參與由微管聚合而成的紡綞體的形成，並調節細胞運動；二是通過影響G蛋白(包括P21及延長因子)的信號傳遞而發揮負調節作用。G蛋白是一類信號結合蛋白，其與GTP結合後便可發揮催化活性，將GTP水解為GDP，從而引發一系列細胞內信號傳遞過程。NDPK可介異GDP轉化成GTP。故nm23基因的正常表達是維持信號傳導系統正常運作的前提。GTP供給不足，微管聚合異常，紡錘體減數分裂障礙，導致細胞異倍體率增高，促進腫瘤發展；微管聚合異常，細胞不能維持正常形態結構而引起運動，參與腫瘤浸潤轉移和發生發展過程。
本發明的目的在於提供一種NDPK免疫組化檢測試劑盒及其試劑盒中nm23單克隆抗體、多克隆抗體和其它緩衝劑的製備工藝，能夠快速的普查腫瘤組織nm23的表達，評估腫瘤的轉移能力及趨勢。
本試劑盒每盒是由以下物質組成PBS(20倍濃度)1瓶過氧化氫液(30％) 1瓶阻斷試劑(濃硫酸95-98％) 1瓶nm23單克隆抗體 1瓶多克隆抗體 1瓶辣根過氧化物酶標記物 1瓶鄰苯二胺 1瓶其中PBS PBS(20倍濃度)、過氧化氫液(30％)、阻斷試劑(濃硫酸95-98％)、辣根過氧化物酶標記物、鄰苯二胺為現有物質；nm23單克隆抗體、多克隆抗體是由本發明的工藝製備而成。
本發明的製備工藝是通過以下步驟實現的1.多克隆抗體的製備1.1 NDPK-A抗原瑞森基因項目工程藥物研究所製備1.2動物成年純種大耳白兔
1.3方法A.免疫準備於每隻家兔兩後肢腳掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5-6mg。
B.第一次免疫注射弗氏完全佐劑(FCA)抗原的製備，取不完全佐劑5ml，緩慢滴加BCG，邊滴邊研磨。再逐滴加入等量NDPK-A抗原液(邊滴邊研磨)直至形成油包水乳劑，滴1滴於冷水上久置不散為合格，滴加BCG及抗原時不可太快，加1滴充分研勻再滴下1滴，最後所制弗氏完全佐劑中，應含BCG5-6mg/ml，抗原5mg/ml。
免疫準備後10天左右，於每隻兔兩後支窩已腫大的淋巴結構內或其近旁各注入弗氏完全佐劑抗原(NDPK-A)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg。
C.第二次免疫注射間隔2-3周後，於每隻兔脊柱兩側，兩肩部，兩臀部及兩腹股溝皮下作多點注射，每點0.2ml弗氏完全佐劑抗原，共8-10點。
D.第三次免疫注射間隔2-3周後，再於每隻家兔脊柱兩側、肩部、兩臀部選不同點上，作皮下多點注射，共8點，每點注射弗氏不完全佐劑抗原(不含BCG)0.2ml。
E.試血測抗體效價間隔7-10天，無菌採兔耳靜脈血0.5-1ml，分離血清，以雙向瓊脂擴散試驗測抗體效價。效價＞1∶32時，可以放血。
否則，以不加佐劑的抗原作靜脈注射免疫，一周內注射3次，
依次為0.1、0.3、0.5m.l(含人NDPK-A分為1mg，3mg，5mg)。
一周後再試血測效價，達到要求，立即放血。
F.放血採用頸動脈採血法。
G.分離血清將放出或抽出的血液傾斜放入37℃孵箱15-30分鐘，再移至4℃數小時，待血塊收縮，血清析出時，吸出血清，放入試管中，2000轉/分鐘離心30分鐘。
H.IgG的分離純化IgG的提取分兩步進行，第一步採用鹽析法粗提人γ球蛋白；第二步將提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱層析提純IgG。具體方法如下取血清60ml+生理鹽水60ml，於攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨120ml，4℃，30分鐘，離心3000轉X20分鐘，棄上清，加生理鹽水60ml溶液，於攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨1/2 30ml，4℃，3小時，離心3000轉/分X20分鐘，棄上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉澱物至Xml。在PH7.2-7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成為穿過峰，獲得較純的IgG。
2.單克隆抗體的製備2.1小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug NDPK-A加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周後，用同樣劑量NDPK-A腹腔加強免疫2-3次，末次免疫後第3-4天取脾細胞融合。
2.2抗原NDPK-A，由陝西瑞森基因工程藥物研究所提供。
2.3細胞融合，免疫小鼠脾細胞和Sp2/0細胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進行細胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽性克隆，再用中和抑制試驗證實為陽性克隆後，經有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽性的單個克隆，穩定傳代3個月，製備腹水和液氮凍存。
2.4單克隆抗體的鑑定2.4.1雜交瘤細胞系染色體分析取對數生長期的雜交瘤細胞用秋水仙素處理，經Giemsa染色，鏡檢計數。
2.4.2 Ig類及IgG類測定用美國Sigma公司的抗鼠Ig亞類抗血清與濃縮至原容積1/20的雜交瘤細胞培養上清液作瓊脂雙向免疫擴散。
2.4.3單克隆抗體特異性的測定將NDPK-A進行電轉移，而後用各株單抗分別進行ELISA染色。
2.4.4單克隆抗體比活性測定將各株單抗的蛋白進行定量，然後按不同稀釋度測定各株的滴度。
3.多克隆抗體或單克隆抗體測定腫瘤組織中的NDPK-A3.1試劑盒組成PBS(20倍濃度)1瓶過氧化氫液(30％) 1瓶阻斷試劑(濃硫酸95-98％) 1瓶nm23單克隆抗體 1瓶多克隆抗體 1瓶辣根過氧化物酶標記物 1瓶鄰苯二胺 1瓶3.2標本收集切片及保存A.收集腫瘤手術新鮮組織1小塊。
B.組織快浸入冰凍組織介質中。
C.浸入液氮直至全組織硬化。
D.放入乾冰中。
E.移至-70℃冰箱中，直至切片(不能貯存組織在無霜冰箱中)。
F.切片厚度5微米。
G.切片在-20℃丙酮中固定5分鐘。
H.切片完全乾後，-70℃保存。3.3石臘切片A.石臘組織塊切片室溫下乾燥過夜(或60℃烤乾1小時)室溫下備用。
B.二甲苯脫臘2次，每次10分鐘。
C.100％乙醇2次，每次2分鐘。
D.將切片置於3％過氧化氫甲醇溶液中10分鐘(阻斷內源過氧化物酶活性)。
E.水衝洗切片後置PBS中。
F.PBS洗2次後，擦乾多餘液體，加1抗100ul，溼盒(有蓋飯盒內平鋪幾層溼紗布)4℃過夜。3.4試劑貯存A.4C保存有效期6個月，-20℃可長期保存。
B.加二抗及酶酸物不宜冰凍，置4℃保存。3.5檢測步驟A.冰凍切片從冰箱取出置室溫，PBS冼3次。石臘切片見石臘切片部分。
B.切片在PBS溶解的0.3％的過氧化氫中10分鐘。
C.擦乾樣品周圍液體，用封閉阻斷劑室溫浸潤5分鐘(不能超過10分鐘)擦乾。
D.加一抗使用液100ul，置溼盒，室溫1小時。
E.PBS洗3次，每次2分鐘。
F.擦去多餘液體，加100ul二抗使用液，溼盒內室溫30分鐘。
G.同4步H.擦去多餘液體，加酶酸物100ul，溼盒內室溫30分鐘。
I.同4步J.加底物I 20-50ul到1ml底物II混勻，在20分鐘內加到切片上，溫育切片5-20分鐘。
K.除去底物殘液，蒸餾水洗3次。
L.蘇木素復染。
M.逐級脫水、透明、封片。
N.顯微鏡下觀察。3.6判斷結果A鏡檢下癌轉移者應無染色。
B染色程度與癌轉移呈負相關。
權利要求
1.NDPK免疫組化檢測試劑盒，包括20倍濃度的PBS、30％的過氧化氫液、95-98％的濃硫酸、辣根過氧化物酶標記物、鄰苯二胺，其特徵在於，還包括nm23單克隆抗體和nm23多克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的試劑盒的製備工藝，其特徵在於，按以下A、B、C、D、E、F、G、H八種步驟製備nm23多克隆抗體A.免疫準備於每隻家兔兩後肢腳掌皮下注入活BCG各0.5ml，共1ml含蛋白5-6mg；B.第一次免疫注射弗氏完全佐劑(FCA)抗原的製備，取不完全佐劑5ml，緩慢滴加BCG，邊滴邊研磨，再逐滴加入等量NDPK-A抗原液(邊滴邊研磨)直至形成油包水乳劑，滴1滴於冷水上久置不散為合格，滴加BCG及抗原時不可太快，加1滴充分研勻再滴下1滴，最後所制弗氏完全佐劑中，應含BCG5-6mg/ml，抗原5mg/ml；免疫準備後10天左右，於每隻兔兩後支窩已腫大的淋巴結構內或其近旁各注入弗氏完全佐劑抗原(NDPK-A)0.5ml，共1ml，含蛋白5mg；C.第二次免疫注射間隔2-3周後，於每隻兔脊柱兩側，兩肩部，兩臀部及兩腹股溝皮下作多點注射，每點0.2ml弗氏完全佐劑抗原，共8-10點；D.第三次免疫注射間隔2-3周後，再於每隻家兔脊柱兩側、肩部、兩臀部選不同點上，作皮下多點注射，共8點，每點注射弗氏不完全佐劑抗原(不含BCG)0.2ml；E.試血測抗體效價間隔7-10天，無菌採兔耳靜脈血0.5-1ml，分離血清，以雙向瓊脂擴散試驗測抗體效價。效價＞1∶32時，可以放血，否則，以不加佐劑的抗原作靜脈注射免疫，一周內注射3次，依次為0.1、0.3、0.5m.l(含人NDPK-A分為1mg，3mg，5mg)，一周後再試血測效價，達到要求，立即放血；F.放血採用頸動脈採血法；G.分離血清將放出或抽出的血液傾斜放入37℃孵箱15-30分鐘，再移至4℃數小時，待血塊收縮，血清析出時，吸出血清，放入試管中，2000轉/分鐘離心30分鐘；H.IgG的分離純化IgG的提取分兩步進行，第一步採用鹽析法粗提人γ球蛋白；第二步將提取的γ球蛋白再以DEAE-Sephadex A50柱層析提純IgG。具體方法如下取血清60ml+生理鹽水60ml，於攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨120ml，4℃，30分鐘，離心3000轉X20分鐘，棄上清，加生理鹽水60ml溶液，於攪拌下逐滴加入飽合硫酸銨1/2 30ml，4℃，3小時，離心3000轉/分X20分鐘，棄上清，以0.02M PH7.4 PBS溶解沉澱物至Xml，在PH7.2-7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A50吸附，只有IgG不被吸附，而成為穿過峰，獲得較純的IgG。
3.根據權利要求1所述的試劑盒的製備工藝，其特徵在於，按以下步驟製備nm23單克隆抗體(1)小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug NDPK-A加福氏完全佐劑腹腔注射，間隔2-3周後，用同樣劑量NDPK-A腹腔加強免疫2-3次，末次免疫後第3-4天取脾細胞融合；(2)細胞融合，免疫小鼠脾細胞和Sp2/0細胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，進行細胞融合，用ELISA間接法初步篩選出陽性克隆，再用中和抑制試驗證實為陽性克隆後，經有限稀釋法克隆2-3次，篩選出分泌抗體陽性的單個克隆，穩定傳代3個月，製備腹水和液氮凍存。
全文摘要
本發明提供一種NDPK免疫組化檢測試劑盒,包括20倍濃度的PBS、30%的過氧化氫液、95—98%的濃硫酸、辣根過氧化物、酶標記物、鄰苯二胺、nm23單克隆抗體和nm23多克隆抗體,同時,本發明還提供了nm23單克隆抗體、nm23多克隆抗體的製備工藝,能夠快速地普查腫瘤組織nm23的表達,評估腫瘤的轉移能力及趨勢。
文檔編號G01N33/531GK1260491SQ99115900
公開日2000年7月19日 申請日期1999年11月9日 優先權日1999年11月9日
發明者趙永同, 祁淼 申請人:趙永同, 祁淼