發育相關疾病的治療的製作方法

2023-12-08 23:33:26

專利名稱：：發育相關疾病的治療的製作方法發育相關疾病的治療相關申請本申請要求2006年2月22日提交的美國臨時申請No.60/775,645的優先權。所述在先申請的全部內容通過參考併入本文中。
背景技術：
：發育生物學家面對的一個基本問題是多細胞生物是如何從受精卵(一種全能幹細胞，其具有簡單的對稱結構)發育為成體(其具有三維的機體結構)的。該過程的調節異常會導致早期發育期間胚胎發生的中止，並常導致成年時形成腫瘤。因此，有必要開發用於調節發育過程以及治療多種與發育調節異常有關的疾病(如癌症、退行性疾病和免疫疾病)的藥劑和方法。Wnt信號途徑參與多種幹細胞的增殖或分化。例如，它在胚胎組織或骨髓來源的造血幹細胞分化中起關鍵作用。骨形態發生蛋白(bonemorphogenicprotein,BMP)屬於TGF-j3超家族，並且其在從繩類到哺乳動物的物種中均有發現。BMP信號途徑對於胚胎發生期間的細胞^^運決定和模式形成以及維持成體中的組織穩態是非常重要的。BMP途徑還參與形態發生的調節以及胃腸(GI)發育的出生後再生。參見，例如美國專利6824971、6159462、6465249和6165748。
發明內容本發明涉及治療癌症、退行性疾病和免疫疾病，並涉及使用Wnt/|3-聯蛋白(Wnt/p-catenin)或BMP4/Xom信號途徑來鑑定用於治療這些疾病的化合物。以下所示為Xom及其人同源物Hom的多肽序列和核普^f列。Xom多肽(SEQIDNO:7)mtkafssvewlaqssrrshreqpskvdqryspypspslpswnscivspsswnsglspdpdsaqvspcpasaqvspyssdseislysheeeasfygmdlntssspgdngllhsemvsvpdnipi:assdedaaksayststcl蘭gye蘭etscssstapegdaislspndtsdeegk呵rrl;rtaftsdqistlektfqkhrylgaserqklaaklqlsevqiktwfqnrrmkykreiqdgrpdsyhpaqffgvygyaqqptpvfqhavqhpypgynplmetlpgtmpytmhppamdsratpfnsqpfqmlylpqqhlgqpltyqeerpfvry(下劃線部分Serl40和Serl44殘基，以及胺基酸176-233/同源J^/SEQIDNO.:3)XomcDNA核普醋列(SEQIDNO:10):gaatggcttgctca^3gc$ggacaagstgactaaagctttctcctctgttccgc3gstctag七ggatcag3g3t3ttC3Ccgtaccccaggccatccctgccttcctggsscsgtgstgtgtccccttcttcatggaacagccssctstctccsgstccsgscagtgcccsagtctcaccatgccctgtgagtgcacasgtatctccstattcctcsgaccactgtattcgssgcctcttggactttaat3C3tC3tC3tcccctggsgscaatggattgctscscsgggatactccagaccatgtcggc.cagcactccagC5L3C3tC3Cctgtgaaaggggcscsacctgttgsttccgcctacsgcsctagcactgactcaggctstgg的tcgatcc'33ctcta^c叫cccctg33ggsgstgcctccgtatctctgagtccc33tg3tscctcsgstga叫agggcaagatgggccgasggttgsggscggctttc3ccagtgatcagatctcc3ctcttttcsg33cttggggcgtctgaaagacgg33sctcgc3gccaaactccsgctttctgsagtccagatt3333Cttggttccagssccgtacaaacgggtggcagacc.agactca±scc3cccsgccc3gttctttggtgtqtscqgctatgcacagcagcccactcctgtsttccsgcatgcagtccaacstccctacccaqgttataSCCC3Ct33tggsssccctgcctggtaccstgccctateiccgLtgcattccsicctgccatggaLCtctctgsctcccttcasctctcssccttttcsgstgctctscctgcccttgggcaacctctggcctstggccstttgttctsgssctttatactasaggctggacttttccatggacttctgtcctcccgcaggacaagttsttgaca3gatgtttsc-tgastggatggctaatattgggccstgtgttgscstgsttttattcacattgaatagtggcgtgt3tstttsccatttatatgactaatsastgtssgtt(下劃線部分編碼序列(核普酸27至1013)/SEQIDNO:8)Horn多肽(SEQIDNO:5):mrlssspprgpqqlssfgsvdwlsqsscsgpthtprpadfslgslpgpgqtsgareppqavsikeaagssnlpapertmaglskepntlraprvrtaftmeqvrtlegvfqhhqylsplerkrlaremqlsevqiktwfqnrrmkhkrqm2dpglhspfsgslhappafystssglanglqllcpwaplsgpqalmlppgsfwglcqvaqealasagasccgqplashpptpgrpslgpalstgprglcampqtgdaf(下劃線部分胺基酸93-151/同源域/SEQIDNO:1)Hom核苷財列(SEQIDNO:9)acctggccgccstgcgcctctcctcctccccscctcgtggcccgcagcagctctccsgctttggctccgtggsctgqctcgctgctcsgggccgscccacscccccsggcctgccgacttctccctggggagcctccctggcccsggccsgacatccggcgcccgggsgccccctca.ggccgtcsgcstcssggsggccgccgggtcctc3satctgcctgcgccggagsggaccatggccggg;ttgagtsaggagccaaataccttgcgggccccccgtgtccgc3C3gccttcsccatggsgcaggtccgcsccttggagggcgtcttccsgcsccsccsgtacctgagccctctggaigcggaagaqgctggccagggsgstgcsgctctcsgsggtccctggtttc3gaatcgccgcgca'ggscccccsgctgc3C3gccccttctcggggtctctccstgcgcccccagctttctactca3cgtcttctggccttgccsstggcctgcsgctgctgtgcccttgggcscccctgtccgggccccsggctctgatgctgccccctggctccttctggggtctctqccaagtggcacaagaggccctggcatctgcgggsgcttcctgctgcgggcsgcctctggcgtCCC3CCCCCCtaccccaggccggccttcgctgggsccagccctgtccscggggccccggggcctgtgtgcgactcccscs3ctC3gttgtcaeiaggttcttatstatgtstgtgtgtstaagtgttgctcCtgC33CCtCgagtsgctggatttttagt3tcctgaccctaggcstgagctcttcactgscsgtg33ca^gggcgtscgstgttttccagtacasgaactcgcgaggatgcsctgt3cccagggcagccggcccsccctcccccsgsstgg.tggaccgttcctcgcggtcttCtgttt3C3ggagattact33tacac3tstgtcacccagcgcctcctgggattacagacgaaatggggtgtgatccgcccsctgcscccasgttaccg3sgtcasatgctggasacsgttgcaggtgtgcasagctggatggggccctgcagcttgctggacctgcggcascacgtgcttgsctcssggttggtgcsg3cttcca/tgtcacgggggstgcsttttgaggtgctgatcgctcctggtggcggaLgstataitaLtacgtatst3ttttttttttgctggsgtgcgttca^sgcga3cccgccsccttcsccatgtcgcctcggccggccctgsga33g3gtcggt3gssgtgggctttgttttttS33ggttgta_tttatagcgtaagcaggaggcsgtgcgctcagggctgctctgtgcctggacacctgtcccacagcacttcagcccctcccctcctgactgscctggctcc3CCtC七C3CCtaita5LatgLtattttttttttaatgacgcaattctccsgccacgcccggcttagccaggcttcccaaagtg3t3t3ttt3tttaggaaggattgtc3tggga5aaggggttsgctttgtgttgtggttcs3taggctgtgcttcttgggccctgssgctgtcctcctcgcatcgc3g33ggggggaggactcgtgcstgaagccc6LggaggaggcacctcttacctggaggCtg3CCC3C3t3t3Ltgta^cgtatacatatgtttgagacggtctcggctcstcsgcctcccssttttttctggtctcs33cctgggstt3ctaaagccaccaacgaagggttagggctttcggataaiaactggtacaaaagagtccctcttsg3acstg3sggtgagccgggagggsaagcscccgcaggtcgcagcctcggtctggaagtgcccgcgttgs3cctg3gsc3csggcagtgcggggtgcccaggcagacgggttcagcctgcsgsactggaggcgacctgtgaaacccacccgggcaccccaacaggaacagaagcgtggtcctgcggctgcgtccccagcgagtttcactttccccttgctcgtttctcccttgttgtsagtg七ttacaactggcatgtgcttttaaacgtcaggtaagaggggaacagctgctgtacatcgtcctggcgagtgacaatgtgacagaagcctgggcgaggccctcggagggcagcsgctggacaggggctactgggtttggcctggacsgcactg3tttgtggstgtggstgggggcscgttgtccgtgstssssgtscasgtgcccctc5caaaaaaasaaaaa3s3a(下劃線部分編碼序列(核苷酸12至788)/SEQIDNO:6)一方面，本發明涉及用於治療對象中細胞增殖性疾病的方法。細胞增殖性疾病是指以不受控制的自主性細胞生長(包括惡性生長和非惡性生長)為特徵的疾病。所述方法包括向有此需要的對象施用有效量的含有SEQIDNO:1或3的多肽或其功能等效物。"功能等效物"是指一種共同多肽的多肽衍生物(例如，包含一個或多個點突變、插入、缺失、截短的蛋白質，融合蛋白質，或其組合)，並且其基本上保留了該共同蛋白質的能力(例如與LEF1/TCF結合)。在一個實例中，所述多肽缺少LEF1/TCF反式激活域。細胞增殖性疾病可以是以LEF1/TCF所介導轉錄的異常活化為特徵的病症。LEF1/TCF所介導轉錄的異常活化是指LEF1/TCF所介導的轉錄處於異常高水平，如通過以下實施例1中所述的TOPflash測定或其它類似的測定所確定的細胞狀態。本發明還涉及用於治療對象中炎症相關疾病的方法。炎症相關疾病的特徵在於局部或全身的、急性或慢性的炎症。所述方法包括向有此需要的對象施用有效量的含有SEQIDNO:1或3的多肽(例如Xom或Horn)或其功能等效物的抑制劑。炎症相關疾病是自身免疫病或炎性疾病。含有SEQIDNO:1或3的多肽的抑制劑是指以統計學顯著的方式降低細胞中該蛋白質水平的化合物。所述抑制劑的實例包括針對Hom/Xom的抗體、反義核酸和RNAi試劑以及小分子化合物和天然存在的化合物。本發明還涉及用於治療對象中退行性疾病的方法。退行性疾病的特徵在於局部或全身的、急性或慢性的退化、細胞體積減小或細胞功能喪失。所述方法包括向有此需要的對象施用有效量的含有SEQIDNO:1或3的多肽(例如Xom或Hom)或其功能等效物的抑制劑。本發明還涉及用於治療骨齓良育不良症候群的方法。該方法包括向有此需要的對象施用有效量的含有SEQIDNO:1或3的多肽或其功能等效物的抑制劑。另一方面，本發明涉及鑑定用於治療細胞增殖性疾病的化合物的篩選方法。該方法包括將測試化合物與含有SEQIDNO:3中包含Serl40或Serl44之片段的多肽接觸；並確定Serl40或Serl44的磷酸化情況(例如，利用Serl40和Serl44的磷酸化特異性抗體)。如果所述化合物存在時的磷酸化水平低於該化合物不存在時的磷酸化水平，則表明該化合物是治療所述疾病的候選藥物。所述篩選方法還可通過如下步驟進行將測試化合物與具有含SEQIDNO:3中包含Serl40或Serl44之片段的多肽的細胞接觸；並確定Serl40或Serl44的磷酸化情況。如果所述化合物存在時的磷酸化水平低於該化合物不存在時的磷酸化水平，則表明該化合物是治療所述疾病的候選藥物。所述片段的長度至少為14(例如，15、18、20、30、50、100、150、200、250和300)個#^酸殘基。上述方法還可用於鑑定增強Serl40或Serl44磷酸化的化合物。這樣鑑定出的化合物代表用於治療細胞退行性疾病或炎症相關疾病的候選藥物。特別地，如果該磷酸化水平高於對照，則表明該化合物是用於治療細胞退行性疾病的候選藥物。在另一方面，本發明涉及包含具有SEQIDNO:1或3序列之多肽或其功能等效物或者所述多肽之激活劑的組合物。所述多肽的激活劑另_提高該多肽的蛋白質水平的化合物，其通過誘導多Jl^達或抑制其蛋白酶解來實現。所述激活劑的實例包括視黃酸、白藜,醇、鞣花酸、乙醯7W酸及其衍生物。所述組合物還可包含7jC楊酸、大黃素、黃酮類化合物或其衍生物。在一個實施方案中，所述組合物是局部應用的組合物，其可用於護膚。特別地，可以向有此需要的對象施用安全且有效量的所述組合物。在另一實施方案中，所述組合物^1食用組合物，例如茶、軟飲料、果汁、奶、咖啡、果凍、冰洪淋、酸奶、餅乾、穀類食物、巧克力、士力架(snackbar)、糖果、口香糖、糖漿或食物膠嚢。該食用組合物可用於治療或延緩細胞增殖性疾病的發作。在另一方面，本發明涉及評估對象中癌症預後的方法。所述方法包括從該對象獲得生物樣品；確定該樣品中是否存在編碼含有SEQIDNO:1的多肽的基因。如果所述基因存在於兩條染色體上，則表明該對象具有良好的預後；反之，如果所述基因從一條或兩條染色體丟失，則表明該對象具有差的預後。也可以通過以下步驟評估對象中癌症預後情況從該對象獲得生物樣品；確定該樣品中編碼含有SEQIDNO:l的多肽之基因的表達水平。如果所W達水平高於對照水平，則表明該對象具有良好的預後；反之，如果所^達7jc平低於對照水平，則表明該對象具有差的預後。所述對照水平可以從正常對象獲得。該方法還可以包括在確定該樣品中編碼含有SEQIDNO:1的多肽之基因的表達水平之前，將所述樣品與化療試劑接觸。所述生物樣品可以是腫瘤活檢樣品或血樣。還涉及診斷骨亂良育不良症候群的方法。該方法包括從該對象獲得生物樣品；確定該樣品中編碼含有SEQIDNO:1的多肽(例如Horn)之基因的表達水平。異常升高的表達水平表明該對象患有或者易於發生骨髓發育不良症候群。本發明還包括用於確定對象是否患有或者易於發生系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法。該方法包括從該對象獲得生物樣品；確定該樣品中編碼含有SEQIDNO:1的多肽^L基因的表達水平。如果所5^達水平高於對照水平，則表明該對象患有或者易於發生系統性紅斑狼瘙。本發明還包括用於維持多潛能細胞的方法，該方法包括將所述細胞與含有SEQIDNO:1的多肽的激活劑接觸。所述多潛能細胞可以是幹細胞，例如造血幹細胞、胃腸幹細胞、神經幹細胞(neuronalstemcell)和皮趺幹細胞。本發明還包括Xom或Hom的分離的突變多肽，所述Xom或Hom包含SEQIDNO:l或3序列。這樣的突變多肽的實例包括XomND55、XomND175、XomCD145和XomCD85,其分別對應於SEQIDNO:7的56-326位胺基酸、176-326位胺基酸、1-181位M酸和1-241位胺基酸(分別為SEQIDNO:11-14)。另外的實例包括SEQIDNO:7的1-130位胺基酸和241-326位^J^酸的融合蛋白(SEQIDNO:15)以及Xom的1-175位胺基酸和Horn的93-258位胺基酸的融合蛋白(SEQIDNO:16)。另外的實例包括含有SEQIDNO:7片段(其包含Serl40或Serl44)的多肽，如TDgGYEgETSC(SEQIDNO:17),以及其中Serl40或Serl44替換為其它氨基i殘基(如丙氨酸)的突變體。這些多肽的長度至少為11(例ii如，11、13、15、20、50、100、150、200、250和300)個^J^酸殘基。它們可以用於篩選Serl40或Serl44磷酸化的抑制劑或者作為抑制內源Xom的Serl40或Serl44磷酸化的治療試劑。本發明包括包含一個或多個上述突變序列和異源序列的融合蛋白。異源的多肽、核酸或基因是源於外源物種的多肽、核酸或基因；或者，如果源自同一物種，則從其最初形式經顯著改變而來。如果兩個融合的結構域或序列在天然存在的蛋白質或核酸中彼此不相鄰，則它們彼此是異源的。分離的多肽是指不含與其天然相關之分子的多肽，即，其純度至少為75%(乾重)(即，包括75%與100%之間的任何數值)。可以使用任何適當的標準方法來測量純度，如柱層析、聚丙烯醯胺皿電泳或HPLC分析。本發明的分離的多肽可以從天然來源進行純化，或者通過重組DNA技術進行製備。本發明還涉及分離的核酸，其包含編碼上述突變多肽或融合多肽的序列或者該序列的互補序列。核酸是指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)或者DNA或RNA類似物。DNA或RNA類似物可以由核苷酸類似物合成而來。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優選雙鏈DNA。"分離的核酸"是結構上不同於任何天然存在的核酸或者不同於天然存在的基因組核酸之任何片段的核酸。因此，該術語涵蓋了例如(a)DNA，其具有天然存在的基因組DNA分子的一部分序列，但是其兩側均不是天然存在該分子的生物基因組中位於該分子部分兩側的編碼序列；(b)核酸，其被摻入到載體或者原核生物或真核生物的基因組DNA中，從而所得的分子不同於任何天然存在的載體或基因組DNA;(c)單獨的分子，如cDNA、基因組片段、聚合,式反應(PCR)產生的片段或者限制性酶切片段；以及(d)重組核苷^f列，其為雜合基因(hybridgene)(即編碼融合蛋白的基因)的一部分。上述核酸可用於表達本發明的多肽。為此目的，可以將所述核酸與合適的調節序列有效連接以得到表達栽體。載體是指能夠將與其連接的另一核酸進行轉運的核酸分子。載體能夠自主複製或者整合到宿主DNA當中。載體的實例包括質粒、粘粒或病毒載體。本發明的載體包括採用適於在宿主細胞中表達核酸的形式的核酸。優選地，所述載體包括與待表達的核酸序列有效連接的一個或多個調節序列。"調節序列"包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如，多聚腺普酸化信號)。調節序列包括指導核普酸序列的組成型表達的序列，以及組織特異性的調節和/或可誘導序列。表達載體的設計可取決於多種因素，如待轉化宿主細胞的選擇、期望蛋白質的表達水平等。可以將表達載體引入宿主細胞以產生本發明的多肽。本發明還包括含有上述核酸的宿主細胞。實例包括大腸桿菌(五."//)細胞、昆蟲細胞(例如，使用杆狀病毒表達栽體)、酵母細胞或哺乳動物細胞。參見，例如Goeddel，(19卯)GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA。為了得到本發明的突變多肽或融合多肽，可以在允許本發明核酸所編碼多肽表達的條件下在培養基中培養宿主細胞，並從培養的細胞或細胞培養基中純化所述多肽。或者，本發明的核酸可以在體外進行轉錄和翻譯，其例如使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶來實現。以下是對本發明的一個或多個實施方案的詳述。本發明的其它特徵、目的和優點在說明書和權利要求書中顯而易見。發明詳述本發明至少部分地基於信號轉導組分的意外發現，該信號轉導組分作為介導Wnt/p-聯蛋白和BMP4/Xom途徑的共同信號傳導的匯合點而起作用。Xom(也稱為Vent2、Vox和Xbr-1)是屬於同源異型框基因中Vent家族的細胞命運決定因子。它既是轉錄阻遏蛋白也是轉錄激活蛋白(Ladher等，1996，Development122，2385-2394;Qnichtchouk等，1996，Development122,3045-3053;Schmidt等，1996，Development122,1711-1721;以及Papalopulu等，1996,DevBiol174,104-114)。在胚胎發生早期，Xom參與腹側中胚層(ventralmesoderm)的形成以及背^JC育圖式形成的決定(Onichtchouk等，1998，Development125，1447-1456以及Koide等，2005，ProcNatlAcadSciUSA102,4943-4948)。合子的Xom轉錄在中嚢胚期轉換(midblastulatransition,MBT)後開始，並且隨著原腸胚形成的JLH，其分布從原腸胚期早期較廣泛的表i^式變為腹-側區域(ventral-lateralregion)(Ladher等，1996，Development122,2385-2394以及Schmidt等，1996，Development122,1711-1721)。Xom的表達似乎受來自腹側信號中心(ventralsignalcerter)的信號(如BMP4)的正調控，13而受背側特異性基因(如Gooscoid(Gsc)和頭蛋白(noggin))的負調控(Ladher等，1996,Development122，2385-2394;Onichtchouk等，1996，Devel叩ment122，3045-3053)。Xom的表達進一步通過促進腹側基因(如BMP4和Vent基因)的表達以及抑制背側組織者基因(dorsal-organizergene)(如Gsc和脊索發生素(chordin))的表達而有助於背復良育圖式的形成(Onichtchouk等，1996,Development122,3045-3053;以及Schmidt等，1996，Development122,1711-1721)。為了發揮其轉錄阻遏蛋白的功能，Xom直接結合背側特異性基因(如Gsc)啟動子的遠端元件，並抑制它們的轉錄(Trindade等，1999,DevBiol216,442-456)。如本文所述，Xom與LEF1/TCF轉錄因子在功能上相互作用。LEF1/TCF是一個高速泳動族(highmobilitygroup,HMG)轉錄因子家族，其本身不具有轉錄活性。而是，LEF1/TCF介導的轉錄活性受到它們的相關聯因子的嚴格控制(Hurlstone等，2002,EmboJ21,2303-2311)。在非謙導狀態下，LEF1/TCF與轉錄阻遏蛋白(如Grouch和CtBP)結合，這將LEF1/TCF介導的轉錄維持在受阻遏的狀態(Roose等，1998，Nature395，608-612;Brantjes等，2001,NucleicAcidsRes29，1410-1419;Cavallo等，1998，Nature395，604-608;Waltzer等，1998，Nature395，521畫525;以及Brannon等，1999，Development126，3159-3170)。在胚胎發生早期，(3-聯蛋白在胚胎將要發育成背側的區域局部富集，這使其與LEF1/TCF相互作用並謙導背側特異性基因(如Siamois、Twin和Xnr)的表達(Harland等，1997，AnnuRevCellDevBiol13，611-667;Brannon等，1997,GenesDev11，2359-2370;Laurent等，1997，Development124,4卯5-4916;以及McKendry等，1997,DevBiol192，420-431)。除了在胚胎發生早期決定細胞^外，由P-聯蛋白所致的LEF1/TCF介導轉錄的過度活化也被認為是多種癌症惡性轉化的第一步(Barker等，2000,AdvCancerRes77，1-24)。由於LEF1/TCF因子是Wnt/p-聯蛋白的轉錄介導物(transcriptionalmediator),因此LEF1/TCF啟動子國安光素酶報告基因的活性通常被認為是Wnt/p-聯蛋白活性的指示物。儘管一些報導稱LEF1/TCF可能參與腹側細胞命運決定，但其在腹側細胞命運決定中的作用並不清楚。例如，表達鐠分析表明LEF1/TCF家族成員廣泛分布在腹-後區域(ventral-posteriorregion)(Molenaar等，1998，MechDev75,151-154以及Oosterwegel等，1993,Development118，439-448)。誘變研究表明，1^卩1-/-1^^1-/-小鼠由於神經擴增(neuralexpansion)而引^C部缺陷(Galceran等，1999，GenesDev13,709-717)，並且LEF1功能喪失導致爪蟾(A:e"o/7"s)腹側而非背側的缺陷(Roel等，2002,CurrBiol12,1941-1945)。與LEF1/TCF可能參與腹側細胞命運決定相一致的是，啟動子分析表明許多腹側基因(如Xom和Bambi)包含LEF1/TCF結合位點。突變這些腹側基因的LEF1/TCF結合位點導致它們對BMP4信號傳導應答的顯著抑制(Karaulanov等，2004，EmboJ23，844-856)。如上所述，已發現Xom與LEF1/TCF因子在功能上彼此相互作用。這種相互作用對於胚胎發生早期的幹細胞池(stemcellpool)維持和細胞命運決定起著關鍵的作用，並作為胚胎發生早期的介導BMP/Xom和Wnt/13-聯蛋白途徑的共同信號傳導作用的匯合點。已克隆了Xom的人同源物Hom。發現Hom以與爪蟾中的Xom相似的方式行使功能。特別地，發現在癌細胞或終末分化細胞中it^達Xom/Hom會導致細胞生長停滯或細胞死亡。另夕卜，同時表達LEF1/TCF因子和Xom或者強制性表達Hom可誘導結腸癌細胞死亡(效力接近100%)。在宮頸癌細胞和前列腺癌細胞中也發現類似的效果。另外，已發現多種癌症化療藥物或治療(例如5-FU、DOX(阿黴素)和輻射)可誘導Xom或Hom的表達。這些結果提示，Xom/Hom充當腫瘤抑制因子，並可用於癌症的診斷、預後和治療。編碼Hom的基因定位於在腫瘤發生和癌轉移期間易於丟失的10q26的事實也支持了Hom/Xom在癌症的診斷、預後和治療中的作用。Hom/Xom的穩定性對幹細胞池維持和細胞命運決定起著關鍵的作用。Xom的蛋白水平受蛋白酶解控制，而蛋白酶解又受Serl40/144磷酸化的控制。在發育期間，內源的Xom在原腸胚形成開始時迅速降解。在原腸形成前期(pre-gastrulation)期間，Xom的Ser140/144未被磷酸化，但是在原腸胚形成開始時i^il被磷酸化，該模式與Xom的穩定性呈互補的關係。還發現，磷酸化部分在介導Xom和P-TRCP(介導Xom蛋白降解的E3連接酶)結合中起關鍵作用，而不能發生磷酸化的Xom突變體則不被蛋白酶解。此外，單獨表達野生型Xom導致30。/。的結腸癌細胞發生生長抑制，而表達穩定的Xom突變體卻導致60%的結腸癌細胞發生生長抑制。這種磷酸化與蛋白酶解解過程代表了用於鑑定治療癌症及其它疾病的新藥物的新治療靶點。除了穩定性以外，Hom/Xom的表達還在多種發育過程起關鍵作用。例如，已發現在CD14+血液祖細胞中GM-CSF和IL4可以誘導Hom的產生。該誘導使得CD14+細胞(其為單核細胞祖細胞)終末分化為樹突細胞以呈遞抗原，並隨後發生凋亡。樹突細胞是免疫細胞，並構成哺乳動物免疫系統的一部分。它們的主要功能是加工抗原物質並將抗原物質在它們的表面呈遞給免疫系統的其它細胞。樹突細胞以少量存在於與外界環境接觸的組織中，主要有皮膚(此處的樹突細胞常被稱為朗格漢斯細胞)以及鼻、肺、胃和腸的內層(innerlining)。也可以在血液中發現未成熟狀態的樹突細胞。一旦被活化，它們就遷移至淋巴組織，在那裡它們與T細胞和B細船目互作用從而啟動並確定(shape)免疫應答。樹突細胞功能的改變在變態>11應和自身免疫病(如紅斑狼瘉)中起主要或關鍵的作用。變態反應是針對外界變應原的病理性過^^應；自身免疫病是針對生物體自身抗原的不當免疫反應。參見，例如Santiago國Schwarz等，JImmunol.2001Aug1;167(3):1758-68。鑑於樹突細胞的作用，調控樹突細胞中Xom/Hom的表達提示了一種治療自身免疫病和炎症的方法。例如，Xom/Hom至少在以下兩個階段調控樹突細胞的分化(i)早期階段，即CD14+血液祖細胞在對GM-CSF和IL4產生應答而終末分化為樹突細胞時；以及(ii)末期階段，即終末分化的樹突細胞已形成例如皮膚中的朗格漢斯細胞時。在早期階段中，Xom/Hom的表達或活性是CD14+血液祖細胞分化為樹突細胞祖細胞所需的。因此，阻斷Xom/Hom的表達或活性可以導致樹突細胞減少，從而減少了不需要的免疫反應。另一方面，在末期階段中，高水平的Xom/Hom表達或活性促使終末分化的樹突細胞發生凋亡。隨後，在這個階段，通過誘導凋亡，Xom/Hom的高水平表達或活性*了終末分化的樹突細胞，從而也減少了不希望的免疫反應(尤其是皮膚的免^應)。診斷和預後測定可以基於來自對象的測試樣品中不存在Horn多肽(例如抗體)或編碼該多肽的核酸(例如基因組DNA或mRNA)來檢測對象中的癌細胞或易於形成腫瘤的細胞。換句話說，所述多肽和核酸可以用作指示癌細胞存在與否的標誌物。本發明的診斷和預後測定包括用於評估Hom多肽或核酸的表達水平的方法，以及用於鑑定Hom多肽或核酸序列中變異和突變的方法。16測試樣品中Horn多肽或核酸的存在、水平或不存在可通過如下進Wf估從對象獲得測試樣品，並將該測試樣品與能夠檢測Horn多肽或核酸的化合物或試劑(例如，mRNA或基因組DNA探針)接觸。所述"測試樣品，，包括從對象分離的組織、細胞和生物體液(biologicalfluid)以及存在於對象中的組織、細胞和體液(fluid)。可以通過以下方法來測量Hom基因的表達水平，包括測量Hom基因編碼的mRNA;測量Hom基因編碼的多肽的量；或者測量Hom基因編碼的多肽的活性。通過原位方式和體外方式均可以檢測細胞中對應於Horn基因的mRNA水平。從測試樣品分離的信使RNA可用於雜交或擴增測定，其包括Sou仇ern或Northern分析、PCR分析和探針陣列。一種用於檢測mRNA7JC平的優選診斷方法包括將分離的mRNA與能夠與Hom基因編碼的mRNA雜交的核酸探針接觸。所述探針可以是全長的Hom核酸，如SEQIDNO:6的核酸或其一部分(如長度為至少10個核苷酸的寡核苷酸片段，其在嚴;^件下足以與Hom的mRNA或基因組DNA進行特異性雜交)。在一種形式中，將mRNA(或由其製備的cDNA)固定於表面上並與探針接觸，例如，將分離的mRNA進行瓊脂糖凝膠電泳並將mRNA從凝膠轉移至膜(如硝酸纖維素膜)。在另一形式中，將探針固定在表面上並將mRNA(或cDNA)與探針接觸，例如，在基因晶片測定中。本領域技術人員可以將已知的mRNA檢測方法用於檢測Hom基因編碼的mRNA水平。樣品中由Hom基因編碼的mRNA(或由其製備的cDNA)水平可以通過核酸擴增來評估，例如通過標準PCR(美國專利No.4,683,202)、RT-PCR(BustinS.JMolEndocrinol.25:169-93,2000)、定量PCR(OngY.等，Hematology,7:59-67，2002)、實時PCR(GinzingerD.ExpHematol.30:503-12，2002)和原位PCR(ThakerV.MethodsMolBiol.115:379-402,1999)，或者任何其它的核酸擴增方法，然後使用本領域已知的技術^測經擴增的分子。如本文所使用的，擴增引物定義為可以與基因的5，或3，區域(分別為正鏈和負鏈，或者反之亦然)退火併且其間包含短區域的一對核酸分子。在適當的4Hf下以及合適的試劑中，所述引物允許擴增出包含兩側為所述引物之核苷^f列的核酸分子。對於原位方法來說，可以將細胞或組織樣品製備並固定在支持物(如玻璃載玻片)上，然後與可以與染色體上的基因組DNA或編碼Hom多肽的mRNA進行雜交的探針接觸。在另一實施方案中，本發明的方法還包括將對照樣品與能夠檢測Horn的mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，並將對照樣品中Horn的mRNA或基因組DNA的存在與測試樣品中Horn的mRNA或基因組DNA的存在進行比較。上述基於核酸的診斷方法可以提供定性的和定量的信息以確定對象是否患有或易於患與Hom基因表達異常有關的疾病(例如癌症)。可以使用多種方法來確定Hom多肽的7jC平。一般地，這些方法包括接觸選擇性結合該多肽的試劑(如抗體)從而評估樣品中多肽的水平。抗體可以是多克隆抗體，或者更優選地是單克隆抗體。也可以使用完整的抗體或其片段(例如，Fab或F(ab，)2)。在一個優選的實施方案中，所述抗體包含可檢測的標籤。與探針或抗體有關的術語"標籤"意在包括通過將可檢測物質物理連接至探針或抗體從而直接標記探針或抗體，以及通過與可檢測物質反應而間接標記探針或抗體。例如，可以使用直接針對兔Fc區域的第二抗體對包含兔Fc區域的抗體進行間接標記，其中所述第二抗體偶聯有可檢測物質。本文提供了可檢測物質的實例。合適的可檢測物質或標籤包括放射性同位素(例如，125I、mI、35S、3H或32P)、酶(例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或P-半乳糖苷酶)、發螢光的基團或蛋白質(例如，螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、綠色螢光蛋白(GFP)或藍色螢光蛋白(BFP))或者發光基團(例如，QdotTM納米顆粒，其由QuantumDotCorporation,PaloAlto，CA提供)。所述檢測方法可以用於體外以及體內檢測生物樣品中的Horn多肽。體外檢測Horn多肽的技術包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉澱、免疫螢光、酶免疫測定(EIA)、放射免疫測定(RIA)和Western印跡分析。體內檢測Hom多肽的技術包括將經標記的抗Hom抗體引入對象。例如，所述抗體可以用如上所述的可檢測物質進行標記。可以通過標準成<象技術**測對象中可檢測物質的存在和定位。Xom的Serl40/144磷酸化水平也可以用作腫瘤發生的指示物。更具體地，比對照的Serl40/144磷酸化水平(或激酶活性)高則表明發生腫瘤/癌症的可能性較高。可以使用Xom相關序列以及Ser140/144磷酸化特異性抗體或質鐠來測量Serl40/144的磷酸化情況(Liu等，Cell108，837-47頁，以及Gerber等，PNAS100，6940-5頁)。本文所述的診斷方法可以鑑定患有與Horn表達或活性異常相關疾病的對象，或者具有發生上述疾病風險的對象。本文所述的預後測定可用於確定對象是否適合施用藥劑(例如，激動劑、拮抗劑、擬肽類(peptidomimetic)、蛋白質、肽、核酸、小分子或其它藥物候選物)來治療癌症。例如，所述測定可用於確定對象是否可以施用細胞毒性藥物來治療細胞增殖性疾病。本發明還涉及監測對象中癌症治療的方法。為此目的，可以在治療前、治療期間或治療後測定來自對象的測試樣品中Hom的基因表達水平。治療後Hom表達水平的提高表明該對象可以繼續接受同樣的治療。內源Xom肽的Serl40/144磷酸化也可以用於監測癌症、退行性疾病和炎性疾病/自身免疫病的活動。例如，可以使用Xom蛋白或其包含Serl40/144磷酸化位點的片段作為底物，從對象取出細胞，並製備細胞提取物。然後，將Xom多肽與所述提取物一起孵育，並使用Serl40/144磷酸化特異性抗體來監測Serl40/144的磷酸化。或者，可以在取自對象的細胞中表達Xom多肽或其包含Ser140/144的片段，並確定Serl40/144的磷酸化水平。基於本文所提供的教導以及本領域已知的教導，該水平反映了疾病的階段。從實施上述診斷測定所獲得的信息可用於對疾病及其它影響個體健康狀況的有害病症進行預測、確定其進程以及臨床管理。在優選的實施方案中，上述診斷測定所提供的信息可用於惡性腫瘤(癌)的預測、確定其進程和管理，其中所述惡性腫瘤的特徵在於缺少Hom表達或者Hom表達水平異常偏低。更特別地，這些信息輔助臨床醫生制定從患病哺乳動物(通常為人)的機體根除所述惡性肺瘤的化療或其它治療方案。藥物篩選本發明涉及用於鑑定增強Hom/Xom活性的化合物的方法，其通過例如抑制Serl40/144的磷酸化而誘導其表達或促進其穩定性來實現。如此鑑定出的化合物可以用於治療癌症、退行性疾病或免疫疾病。根據下述方法，可以鑑定以統計學顯著性方式降低Xom/Hom蛋白磷酸化水平的化合物(即Xom/Hom激酶抑制劑)。可以使用本領域已知的多種組合文庫方法中的任意方法來獲得待篩選的候選化合物(例如，蛋白質、肽、擬肽類、類肽(peptoid)、抗體、小分子或其它藥物)。所述文庫包括肽文庫、類肽文庫(具有肽的功能、但包含新型非肽骨架的分子的文庫，其中非肽骨架對除&降解具有抗性)；空間可尋址的並行固相或液相文庫(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries);通過重疊合、法(deconvolution)或親和層析篩選獲得的合成文庫；以及"一珠一化合物(one-beadonecompound)，，文庫。參見，例如，Zuckermann等1994,J.Med.Chem.37:2678-2685;以及Lam,1997,AnticancerDrugDes.12:145。合成分子文庫的方法的實例可見於，例如DeWitt等，1993,PNASUSA卯:6909;Erb等，1994，PNASUSA91:11422;Zuckermann等，1994,J.Med.Chem.37:2678;Cho等，1993，Science261:1303;Carrell等，1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell等，1994,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;以及Gall叩等，1994J.Med.Chem,37:1233。化合物文庫可以提供於溶液中(例如，Houghten，1992,Biotechniques13:412-421)，或珠子上(Lam,1991，Nature354:82-84)、晶片上(Fodor,1993，Nature364:555-556)、細菌中(美國專利No.5,223,409)、孢子中(美國專利No.5,223,409)、質粒中(Cull等,1992，PNASUSA89:1865-1869)或噬菌體中(Scott和Smith19卯，Science249:386畫3卯；Devlin,1990,Science249:404-406;Cwirla等，19卯，PNASUSA87:6378-6382;Felici1991,J.Mol.Biol.222:301-310;以及美國專利No.5,223,409)。為了鑑定Xom/Hom激活劑或Xom/Hom激酶抑制劑，可以將候選化合物與包含Xom/Hom基因或多肽的系統接觸。所述系統可以是無細胞系統或包含細胞的系統，例如，體外細胞系模型或體內動物模型。在包含細胞的系統中，細胞可以天然地表達Xom/Hom基因，或者可以經改造表達重組核酸。所述重組核酸可以包含與異源啟動子融合的Xom/Hom基因編碼區，或者與報告基因融合的Xom/Hom基因啟動子序列。然後測量Xom/Hom多肽的表達水平或磷酸化水平(例如，在Serl40或Serl44位)。上述Xom/Hom多肽可以是全長的Xom/Hom多肽或者其包含所述磷酸化位點的片段。可以在mRNA水平或者在蛋白質水平檢測表達水平。測量細胞、組織樣品或體液中mRNA水平的方法是本領域熟知的。為了測量mRNA水平，可以將細胞裂解，並可以通過例如雜交測定(使用經可檢測標記的基因特異性DNA或RNA探針)以及定量或半定量RT-PCR(使用適當的基因特異性引物)來檢測裂解物中或者經純化或半純化自裂解物的RNA中的mRNA水平。或者，可以使用組織切片或未經裂解的細胞懸浮物以及經可檢測(例如，螢光或酶)標記的DNA或RNA探針來進行定量或半定量的原位雜交測定。另外的mRNA定量方法包括RNA酶保護實驗(RNAprotectionassay,RPA)和SAGE(基因表達系列分才斤)。測量細胞或組織樣品中蛋白質水平的方法也是本領域已知的。測量多肽磷酸化水平的方法也是本領域已知的。所述方法的實例包括使用特異性磷酸化抗體或質鐠法(Liu等，Cell108，837-47頁，以及Gerber等，PNAS100,6940-5頁)。為了確定候選化合物提高Xom/Hom表達水平或降低其磷酸化水平的能力，將以上述方式獲得的水平與候選化合物不存在時獲得的對照水平或活性進行比較。如果磷酸化水平低於對照，或者如果表達水平高於對照，則鑑定該化合物對於治療上述疾病是有效的。可以使用爪蟾卵母細胞模型或動物模型來進一步驗證如上鑑定的化合物的效力。可以根據下述實施例部分中的方法或其它標準技術向爪蟾卵母細胞模型或動物模型施用化合物以及進行實驗。細胞死亡的任何統計學顯著性提高指示了該化合物是治療上述疾病的候選藥物。也可以使用上述方法來鑑定Xom/Hom的抑制劑，不同的是如果候選化合物抑制Xom/Hom的表達或者增加其磷酸化水平，則鑑定該化合物為候選藥物。治療方法
技術領域：
：本發明還涉及用於治療對象的細胞增殖性疾病(例如癌症)、細胞退行性疾病、炎症相關疾病(如溼滲和炎性腸病)或血液疾病(例如骨MiL育不良症候群)的方法。細胞增殖性疾病是指以不受控制的自主性細胞生長(包括惡性生長和非惡性生長)為特徵的疾病。該疾病的實例包括結腸癌、乳癌、前列腺癌、肝細胞癌、黑素瘤、肺癌、成膠質細胞瘤、腦腫瘤、惡性血液病(hematopoeiticmalignancy)、成視網膜細胞瘤、腎細胞癌、頭頸癌、宮頸癌、胰i^癌、食道癌和鱗狀細胞癌(squamacellcarcmoiim」炎症相關疾病的特徵在於局部或全身的、急性或慢性的炎症。實例包括炎性皮膚病(inflammatorydermatosis)(例如，皮炎、溼滲、特應性皮炎、變應性接觸性皮炎、蕁麻滲、壞死性血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、嗜伊紅細胞性肌炎、多肌炎、皮肌炎和嗜伊紅細胞性筋膜炎(eosinophilicfasciitis))、炎性腸病(例如，克羅恩病和潰瘍性結腸炎)、急性呼吸窘迫綜^^徵、暴發性肝炎、過敏性肺病(hypersensitivitylungdisease)(例如，過敏性肺炎、嗜伊紅細胞性肺炎、遲髮型超敏反應、間質性肺病(或ILD)、特發性肺纖維化和類風溼性關節炎相關的ILD)、哞喘以及變應性鼻炎。實例還包括自身免疫病(例如，類風溼性關節炎、4艮屑病關節炎、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、幼年型糖尿病、腎小球腎炎、自身免疫性曱狀腺炎(autoimmunethroiditis)、強直性脊柱炎、系統性硬化和多發性硬化)、急性和慢性炎性疾病(例如，全身性過M應或^^L反應、藥物變態反應、昆蟲螫傷變態>^應(insectstingallergy)、異體移植物排斥>^應和移植物抗宿主病)、舍伶倫症候群、人免疫缺陷病毒感染、癌症(例如，腦癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、腎癌、卵巢癌、甲狀腺癌、肺癌和血癌(hematopoieticcancer))以及肺瘤轉移。"對象，，是指人和非人動物。非人動物的實例包括所有脊推動物，例如哺乳動物(如非人靈長類(特別是高等靈長類)、犬、齧齒動物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、貓)和非哺乳動物(如鳥類、兩棲類、爬行類等)。在一個優選的實施方案中，對象是人。在另一實施方案中，對象是實驗動物或者適於用作疾病模型的動物。對象:任選地，可以通過上述方法來^測對象的Xom/Hom;因或多肽的基因表達水平或活性水平。如果來自對象的樣品中的基因表達或活性水平低於來自正常人的樣品中的水平，則該對象是接受有效量的Xom/Hom肽或激活劑進行治療的候選者。可以通過標準診斷技術來鑑定待治療炎症相關疾病的對象。"治療"是指向患有細胞增殖性疾病(例如癌症)、炎症相關疾病或血液疾病的對象施用化合物，其目的是治癒、減輕、緩解、治療、預防或改善所述疾病、該疾病的症狀、該疾病繼發的疾病狀態或者該疾病的誘因。"有效量"是指能夠產生醫學上期望效果(例如，如上所述在接受治療的對象中)的化合物的量。所述治療方法可以在體內或離體進行，可以單獨或與其它藥物或治療一起進行。在一種體內方法中，向對象施用化合物。一般地，將所述化合物懸浮於可藥用載體(例如生理鹽水)中，並通過口服或者通過靜脈輸注或以皮下、肌內、鞘內、JiJ^內、直腸內、陰道內、鼻內，胃內、氣管內或肺內方式注射或;^iMfe用。所需劑量取決於所選擇的施用途徑、劑型、患者的病情、對象的大小、重量、表面積、年齡和性別、同時施用的其它藥物以及主治醫生的判斷。合適的劑量範圍為0.01-100mg/kg。所需劑量的變化要視所施用化合物的不同以及各種施用途徑的不同效率而定。例如，口服施用往往比靜脈內(i.v.)注射需要更高的劑量。可以使用本領域熟知的用於優化的標準經驗慣例來調整這些劑量水平的變化。將所述化合物包裹入合適的遞送載體(例如，聚合#^立(polymericmicroparticle)或可;tt^裝置)可以提高遞送效率，尤其適於口服遞送。可用於治療細胞增殖性疾病或炎症相關疾病的化合物包括含有SEQIDNO:1或3且不含LEF1/TCF反式激活域的多肽。實例還包括SEQIDNO:1或3的功能等效物。如上所述，SEQIDNO:1或3的功能等效物是指源自SEQIDNO:1或3的多肽，例如融合多肽或者包含一個或多個點突變、插入、缺失、截短的多肽，或其組合。所述多肽與SEQIDNO:1或3具有至少60%的一致性(即包括60%到100%之間的任何數值)，並基本保留了Xom或Horn的同源域活性，即通過與內源LEF1/TCF激活劑(如j3-聯蛋白)竟爭從而結合LEF1/TCF並以顯性失活方式抑制LEF1/TCF依賴性轉錄的能力。LEF1/TCF因子是含有高泳動族(HMG)的重要轉錄因子。LEF1/TCF本身幾乎沒有轉錄活性，然而LEF1/TCF被與其結合的因子(如Wnt途徑中的P-聯蛋白和BMP4途徑中的Xom)所活化。已發現，P-聯蛋白或Xom對LEF1/TCF的反式激活對於幹細胞功能和細胞命運決定以及惡性轉化是關鍵的。可以使用本領域已知的方法來合成上述多肽，或者使用重組技術來製備上述多肽。例如，可以將編碼所述多肽的核酸克隆到表達載體中，其中核酸與適於在宿主細胞中表達多肽的調節序列有效連接。然後，可以將載體引入合適的宿主細胞以表達所述多肽。所表達的重組多肽可以通過例如疏酸銨沉澱和柱層析分離的方法從宿主細胞中純化。參見，Goeddel,(1990)GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA。可以才艮據以下實施例中所述的方法^測試如此製備的多肽的活性。可用於治療細胞增殖性疾病的化合物的實例包括提高Horn蛋白水平的化合物，如5-FU、DOX、輻射、視黃酸、GM-CSF-IL4、白藜產醇、鞣大黃素和黃酮類化合物及其誘導Hom表達的衍生物。還可以使用抑制Xom/Hom磷酸化的化合物(即Xom/Hom激酶抑制劑)，如白藜蘆醇、鞣花酸、乙醯7jC楊酸、7jC楊酸、大黃素、黃酮類化合物及其衍生物。抑制Hom/Xom表達或活性的化合物也可用於治療其它疾病，如骨髓發育不良症候群(MDS)。MDS也稱為"白血病前期，，，它是不能有效產生血細胞以及向急性髓細胞源性白血病轉化的各種風險等血液疾病的統稱。儘管MDS不是真正的惡性胂瘤(malignantne叩lasm)，然而它還是被劃歸為血液胂瘤。已發現，Hom基因在MDS患者中it^達，這提示Hom阻礙了分化進程。因此，Hom/Xom的抑制劑可用於治療MDS。所述抑制劑的實例包括特異性靶向Hom/Xom的抗體、反義核酸、RNAi試劑。另外的實例包括抑制Hom表達的化合物。"抗體"包括完整的分子以及其片段(如Fab、F(ab，)2、Fv、scFv(單鏈抗體)和dAb(結構域抗體(domainantibody);Ward等(1989)Nature,341,544)。抗體的衍生物是指包含本發明多肽變體的蛋白質或蛋白質複合物。可以利用本領域已知的方法通過在適當的宿主細胞中共表達含有相應輕鏈和重鏈互補決定區(CDR)的多肽來製備本發明的抗體或衍生物。參見，例如Harlow和Lane，(1988)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork。為了製備本文所述的抗體，可以將Xom或Hom多肽或其抗原性片段與載體蛋白(如KLH)偶聯，與佐劑混合，並注射入宿主動物。然後，可通過肽親和層析對所述動物產生的抗體進行純化。常用的宿主動物包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。可用於增強免疫應答的不同佐劑取決於宿主物種，其包括弗氏佐劑(完全佐劑和不完全佐劑)、礦物皿(如氫氧化鋁)、表面活性物質(如溶血卵磷脂)、多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑(oilemulsion)、匙孔蜮血藍蛋白以及二硝基酚。對人有用的佐劑包括BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)。免疫對象的血清中存在多克隆抗體(抗體分子的異質性群體)。可以使用標準的雜交瘤技術來制M對特定抗原的單克隆抗體(同質性抗體群體)。參見，例如，Kohler等(1975)Nature256，495;Kohler等(1976)Eur.J.Immunol.6,511;Kohler等(1976)Eur.J.Immunol.6,292;以及Hammerling等(1981)MonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier,N.Y.。特別地，可以通過以下用於產生抗體分子的任何技術來獲得單克隆抗體如美國專利No.4,376,110所述的培養傳代細胞系、人B細胞雜交瘤技術(Kosbor等(1983)ImmunolToday4，72;Cole等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80,2026)和EBV雜交瘤技術(Cole等(1983)MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR,Liss,Inc.,77-96頁)。所述抗體可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD的任何免疫球蛋白類型及其任何亞類。產生本發明單克隆抗體的雜交瘤可以在體外或在體內培養。由於在體內能夠產生高滴度的單克隆抗體，因此體內培養成為特別有用的生產方法。包含編碼Xom或Horn抑制劑的核酸序列的多核普酸可用於治療炎症相關疾病。所述核酸序列可以編碼耙向Xom或Horn並抑制其表達活性的上述多肽、抗Xom或抗Horn的抗體、反義RNA或小幹擾RNA(例如，RNAi試劑)。術語"RNAi"或"RNA幹擾"是指下調靶分子(例如，耙基因、蛋白或RNA)的序列特異性或選擇性的方法。本發明包括應用RNAi介導的RNA分子降解(例如在細胞中)。降解由RNA誘導沉默複合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)進行酶促催化。細胞中天然RNAi用於清除外源RNA(例如病毒RNA)。天然RNAi作用於從游離的雙鏈RNA切割而來的片段，繼而進行降解。或者，可以人工製備RNAi用以例如使耙基因表達沉默。術語"RNAi試劑"是指與耙RNA(即被降解的RNA)具有足夠的序列互補性以指導RNAi的RNA(或其類似物)。包含"與耙RNA具有足夠的序列互補性以指導RNAi的序列"的RNA試劑是指具有通過RNAi機制(例如，RISC複合體)或方法足以引發靶RNA降解的RNA試劑。包含"與靶RNA具有足夠的序列互補性以指導RNAi的序列"的RNA試劑還指具有通過RNAi機制或方法足以引發耙RNA發生翻譯抑制的序列的RNA試劑。RNA試劑還可以包含與靼DNA序列編碼的靶RNA具有足夠序列互補性的序列，從而使靼DNA在染色體7jC平沉默。換句話說，所序列處或其附近的基因表達(例如，通過引起粑DNA序列處或其附近的染色質結構改變來實現)。術語"RNA"或"RNA分子"或"核糖核酸分子"是指核糖核苷酸多聚物。術語"DNA"或"DNA分子"或"脫氧核糖核酸分子，，是指脫氧核糖核苷酸多聚物。DNA和RNA可以天然合成(例如，分別通過DNA複製或DNA轉錄來實現)。RNA可以進行轉錄後修飾。DNA和RNA還可以進行化學合成。DNA和RNA可以是單鏈的(即分別為ssDNA和ssRNA)或多鏈的(例如雙鏈的，即分別為dsRNA和dsDNA)。可以通過使用本領域已知的生物可降解的聚合物微粒或微膠嚢遞送裝置來遞送多核苷酸。另一實現核酸才聶入的方法是4吏用經標準方法製備的脂質體。所述多核普酸可以單獨摻入這些遞送載體或者與組織特異性抗體一起摻入。或者，可以製備分子綴合物，其由通過靜電力或共價力與聚L-賴氨酸連接的質粒或其它載體組成。聚L-賴氨酸與能夠結合耙細胞上受體的配體結合(Cristiano等，1995,J.Mol.Med.73:479)。或者，可以通過使用本領域已知的組織特異性轉錄調節元件來實現組織特異性靶向。將"棵DNA"(即沒有遞送載體)遞送至肌內、皮內或皮下部位是實現體內表達的另一方式。在上述多核苷酸(例如表達載體)中，將編碼Xom或Hom抑制劑的核酸序列與啟動子或增強子-啟動子組合進行有效連接。合適的表達載體包括質粒和病毒載體(如皰滲病毒、逆轉錄病毒、痘苗病毒、減毒痘苗病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。如本領域熟知的，患者用藥劑量取決於上述多種因素。劑量可以變化，但施用多核苷酸的優選劑量約為106至1012個拷貝的多核苷酸分子。根據需要，可以重複施用所述劑量。施用途徑可以是以上列出的任何施用途徑。本發明還包括經包裝的產品，其包含容器、有效量的上述化合物之一以及附在容器上的說明，並且其標明施用該化合物用於治療患有上述疾病或具有發生上述疾病的風險的對象。所述化合物可與可藥用載體混合，所述載體包括溶劑、分歉劑、包衣劑(coating)、抗細菌劑和抗真菌劑以及等滲劑(isotonicagent)和吸收延緩劑(absorption-delayingagent)。可使用常規方法將所述化合物配製成用於不同施用途徑的劑型。例如，可以將其配製成用於口服的膠嚢、凝膠密封物(gelseal)或片劑。膠嚢可以包含任何標準的可藥用物質，如明膠或纖維素。可根據常規方法通過壓縮所述化合物與固體載體和潤滑劑的混合物來配製片劑。固體載體的實例包括澱粉和糖、急土。所述化合物還可以以包含粘合劑(例如，乳糖或甘露醇)、常規填充劑和成片劑(tabletingagent)的石更殼片劑或膠嚢的形式來施用。所述化合物可以經由腸胃外途徑來施用。腸胃外劑型的實例包括活性試劑的7jC溶液、等滲鹽水或5%葡萄糖溶液或者其它熟知的可藥用賦藥物賦形劑。所述化合物的效力可以在體外或體內進行評估。例如，可以測試所述化合物在體外阻滯細胞生長或誘導凋亡的能力。對於體內研究而言，可以將所述化合物注射入動物(例如動物模型)中，繼而評估其對細胞生長或凋亡的影響。根據該結果，可以確定合適的劑量範圍和施用途徑。幹細胞幹細胞是能夠分化成多種終末分化細胞類型的細胞。幹細胞可以是全能的、多潛能的(pluripotent)、多能的(multipotent)以及單能的。全能幹細胞來源於卵細胞和精細胞的融合。受精卵最初幾次分裂形成的細胞也是全能的。這些細胞可以分化成胚胎細胞類型和胚外細胞類型。全能幹細胞通常能夠發育成任何細胞類型。全能幹細胞通常是胚胎來源的。多潛能幹細胞是全能幹細胞的後代並可以分化成源自三胚層的細胞。這些細胞通常是能夠分化成幾種不同的終末分化細胞類型的幹細胞系中的細胞。多能千細胞僅能產生關係密切的細胞家族的細胞(例如，itit幹細胞分化成紅細胞、白細胞、血小板等)。單能細胞僅能產生一種細胞類型，然而它們具有自我更新的性質從而使其區別於非幹細胞。多潛能的、多能的和單能的幹細胞可來自多種組織或器官系統，其包括但不僅限於血液、神經、肌肉、皮膚、腸、骨、腎、肝、胰、胸腺等。如上所述，Wnt和BMP信號途徑參與多種幹細胞的增殖或分化。參見，例如Reya等，Nature,2005Apr14;434(7035):843-50。作為關鍵的組分，Xom/Hom;幹細胞的維持、擴充和分化中起重JHt用。因此，Xom/Hom可用於調節幹細胞的發育和分化，以及用於治療相關的增殖性或退行性疾病。例如，Xom/Hom可用於減緩或阻止幹細胞的分化，從而維持幹細胞池。進而，Xom/Hom的拮抗劑(即抑制劑)可用於促進分化。該分化過程的調節異常將導致多種疾病(如MDS)發生。認為MDS是由多能骨髓幹細胞中的突變引起的。阻礙血液前體細胞的分化，則骨髓細胞中的細胞凋亡水平顯著提高。異常細胞的克隆擴充會產生已喪失分化能力的細胞。由MDSU為白血病是癌症發生多步理論的很好的例子，其中最初的正常細胞發生一系列突變並轉化成癌細胞。如上所述，MDS27患者中Hom/Xomit^達可導致MDS中發生分化過程和凋亡的阻滯。因此，Hom/Xom的抑制劑可用於治療MDS。所述抑制劑的實例包括特異性乾向Hom/Xom的抗體、反義核酸、RNAi試劑和小分子化合物。本發明的治療方法可用於通過促進細胞分化來治療骨齓義育不良症候群。本發明的方法還可以用於治療或延緩另一些增殖性或退行性疾病的進程。所述疾病的實例包括黃斑變性、神經元退變、亨廷頓病、帕金森病、阿爾茨海默病和精神分裂症。術語"增殖，，和"擴充"在本文中涉及細胞時可互換使用，它們是指通過分裂使相同類型的細胞數量增加。術語"分化"是指細胞向特定功能發生特化的發育過程，例如細胞獲得一種或多種與最初細胞類型不同的形態學特徵和/或功能。術語"分化"包拾譜系決定(lineagecommitment)和終末分化過程。可以通過例如使用免疫組織化學或本領域技術人員已知的其它方法來監測鐠系標誌物是否存在從而對分化進行評估。源自祖細胞的已分化後代細胞可以但不必然地與幹細胞來源組織相同的胚層或組織相關。例如，神經祖細胞和肌肉祖細胞可以分化成itjfeL細胞鐠系。術語"鐠系決定"和"特化"在本文中可互換使用，它們是指幹細胞經歷的過程，其中千細胞生成定向形成特定有限範圍的分化細胞類型的祖細胞。已定向祖細胞常常能夠自我更新或細胞分裂。本文使用的術語"終末分化"是指細胞最終分化為成熟的、完全分化細胞。例如，神經祖細胞和肌肉祖細胞可以分化為itjk細胞譜系，其終末分化形成特定細胞類型的成熟血細胞。通常，終末分化與退出細胞周期和停止增殖有關。本文使用的術語"祖細胞"是指定向為特定細胞鐠系並通過一系列細胞分裂而生成該鐠系細胞的細胞。祖細胞的實例包括成肌細胞，它僅能夠分化為一種類型的細胞，然而其自身並未完全成熟或完全分化。組合物本發明包括包含合適載體以及一種或多種上述化合物的組合物。所述組合物可以是包含可藥用載體的藥物組合物、包含合適的可食用載體的食用組合物或者包含可化妝用載體的化妝品組合物。本發明的食用組合物的實例包括上述活性化合物。該化合物的實例包括Hom/Xom多肽或其功能性片段、視黃酸、白藜蘆醇、鞣花酸、乙醯水楊酸、水楊酸、大黃素、黃酮類化合物以及這些化合物的衍生物。所述組合物還包括但不僅限於食品、食品添加劑、營養補充劑和藥物製劑。可以釆用以下形式片劑、混懸液、植入物、溶液、乳劑、膠嚢、粉劑、糖漿、液體組合物、軟膏、洗劑、霜劑、骨劑、凝膠等。作為膳食補充劑，可以包含另外的營養物(如礦物質或胺基酸)。食用組合物還可以是飲料製品或食物製品。如本文使用的，術語"飲料"和"食物"分別泛指任何種類的液體和固體/半固體物質，其用於飼餵動物以及維持動物(包括人)的正常或加速生長。飲料製品的實例包括但不僅限於基於茶的飲料、果汁、咖啡和奶。食物製品的實例包括果凍、餅乾、穀類食品、巧克力、士力架、草^1_取物(herbalextract)、乳製品(例如冰洪淋和酸奶)、大豆製品(例如豆腐)以及水稻製品等。本發明的組合物可包括載體。取決於組合物的種類，載體可以是適當的食用載體或可藥用載體。可藥用載體的實例包括但不僅限於生物相容性載體、佐劑、添加劑和稀釋劑，從而使組合物成為適用的劑型。將"可藥用載體，，施用於對象後不會引起不良生理反應。所述藥物組合物中的載體須是"可藥用的"還表示其與活性成分是相容的，並且優選能夠使其穩定。可以使用一種或多種增溶劑作為藥物載體用於遞送活性化合物。另一些載體的實例包括膠體二氧化矽、硬脂酸鎂、纖維素、十二烷J^f危酸鈉和D&CYellow#10。釆用上述任何形式的上述組合物可用於治療細胞增殖性疾病和炎症相關疾病。"有效量"是指對被治療對象起到治療效果所需的活性化合物的量。本領域技術人員已知，有效劑量將根據所治療疾病的類型、使用途徑、賦形劑的使用以及可能與其它治療性處理共同使用而發生變化。本發明的藥物組合物可以通過腸胃外、口服、鼻、直腸、局部或含服等方式iMfe用。本文使用的術語"腸胃外，，是指皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內或顱內以及任何合適的輸注技術。無菌可注射組合物可以是可腸胃外施用的無毒稀釋劑或溶劑中的溶液或混懸液，如l,3-丁二醇中的溶液。可以施用的可接受載體和溶劑包括甘露醇、水、g液和氯化鈉等滲溶液。另外，固化油(fixedoil)也常規用作溶劑或懸浮介質(例如，合成的甘油單酯或甘油二酯)。脂肪酸如油酸及其甘油酯衍生物可用於製備注射劑(injectable),這是由於它們是天然的可藥用油(如橄欖油或蓖麻油，尤其以其聚氧乙烯化形式)。這些油溶液或混懸液還可以包含長鏈醇稀釋劑或M劑、羧甲基纖維素或類似的分散試劑。為了配製的目的還可以使用其它常用的表面活性劑，如常用於製備可藥用固體、液體或其它劑型的吐溫或司盤(Span)或其它類似的乳化劑或生物利用度促進劑(bioavailabilityenhancer)。口服施用的組合物可以釆用可口月Mfe用的任何劑型，其包括膠嚢、片劑、乳劑和7jc性混懸液、M劑和溶液。在片劑的情形中，常用的載體包括乳糖和玉米澱粉。通常還加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。對於釆用膠嚢形式的口服施用來說，有用的稀釋劑包括乳糖和幹玉米澱粉。當口服施用水性混懸液或乳劑時，可以將活性成分與乳化劑或混懸劑一起懸浮或溶解在油相中。如果需要的話，可加入某些甜味劑、調味劑或著色劑。鼻用氣霧劑或吸入組合物可以根據製藥領域眾所周知的技術進行製備。例如，這樣的組合物可以製備成鹽溶液，其中使用苯甲醇或另一些合適的防腐劑、吸收促進劑(用以提高生物利用度)、氟碳化合物和/或本領域已知的其它增溶劑或^劑。包含活性化合物的組合物還可以釆用栓劑形式用於直腸施用。局部應用的組合物包含適於應用至皮膚的安全且有效量的皮膚可用栽體。通常，局部應用的組合物可以是固體、半固體、霜劑或液體。它可以是採用軟骨、洗劑、泡沫、霜劑、皿或溶液的化妝品或皮膚病藥品。皮膚可用載體將在下文詳細描述。本發明的組合物可以單獨使用或與其它生物活性成分聯合使用。當單獨使用或與其它生物活性成分聯合使用時，可以在一段時間內向對象一次性給藥或者多次給藥。本領域技術人員了解多種施用方式。施用組合物的劑量範圍要足夠大以產生期望的效果。然而，上述劑量不應太大以至於造成任何不良副作用(如有害的交叉反應等)。通常，所述劑量隨著對象的年齡、重量、性別、病症和病症程度以及預期目的而變化。本領域技術人員無需過多的實驗即可確定該劑量。如果具有任何禁忌、耐受或類似的情況，可以對劑量進行調整。基於該信息，本領域技術人員可以容易地評估這樣的因素，並確定待用於預期目的的本發明組合物的特別有效的濃30度。本發明還包括含有上述活性化合物的化妝品組合物。該化合物的實例包括Hom/Xom多肽或其功能性片段。實例還包括視黃酸、白藜蘆醇、鞣花酸、乙醯7jC楊酸、7jC楊酸、大黃素和黃酮類化合物，以及這些化合物的衍生物。該組合物包含適於局部應用至皮膚的安全且有效量的皮膚可用載體。它使得活性化合物和任選組分以合適的濃度遞送至皮膚。因此，所述載體作為稀釋劑、M劑、溶劑等以確保活性物質以合適的濃度被應用並均勻分布在所選靼標上。所述載體可以是固體、半固體或液體。優選地，它採用洗劑、霜劑或凝膠的形式，特別是具有足夠粘稠度或屈服點(yieldpoint)以防止活性物質沉澱的形式。所述載體本身可以是惰性的或對皮膚病具有益處。它還應當在物理和化學性質上與本文所述的活性化合物相容，而不應不適當地損害與所述組合物有關的穩定性、效力或其它用途優點。化妝品組合物中使用的載體類型取決於該組合物產品形式的類型。可以將化妝品組合物製成如本領域已知的多種產品形式。這些包括但不僅限於洗劑、霜劑、皿、棒狀產品(stick)、噴霧劑、軟骨、糊劑和摩絲。這些產品形式可以包含幾種類型的載體，其包括但不限於溶液、氣霧劑、乳劑、凝膠劑、固體和脂質體。優選的載體可包含皮膚可用的、親水性稀釋劑。合適的親水性稀釋劑包括水、有機親水性稀釋劑，如d-C4單羥基醇及低分子量二元醇和多元醇(包括丙二醇，分子量例如為200-600的聚乙二醇)、分子量例如為425-2025的聚丙二醇、甘油、丁二醇、1,2,4-丁三醇、山梨醇酯、1,2,6-己三醇、乙醇、異丙醇、山梨醇酯、乙氡基醚、丙HiJ^良其組合。所述組合物優選地包含至少約60%的親水性稀釋劑。優選的載體還包含具有親水相(尤其是7jC相)和疏7JC相(例如，脂質、油或油性物質)的乳劑。如本領域技術人員熟知的，親水相將分軟於疏7jC相中(或者反過來)從而取決於組合物成分分別形成親水或疏水的分似目(dispersedphase)或連續相。術語"^bt目"是本領域4支術人員熟知的術語，它是指以微粒或液滴在連續相中懸浮存在或被連續相包圍存在的相。所述^bf目也稱為內相或不連續相。所述乳劑可以是或包含(例如，在三相乳劑或其它多相乳劑中)水包油乳劑或油包水乳劑(如矽酮包水乳劑)。水包油乳劑通常包含1%至50%(優選1%至30%)的疏水^fbN和1%至99%(優選40%至卯％)的親水連續相；油包水乳劑通常包含1%至98%(優選40%至卯％)的親水^bf目和1%至50%(優選1%至30%)的疏水連續相。所述乳劑還可以包含^^網絡，如G.M.Eccleston,ApplicationofEmulsionStabilityTheoriestoMobileandSemisolidO/WEmulsions,Cosmetics&Toiletries,第101巻，1996年11月，73-92頁(其通過參考併入本文中)所述。本文優選的組合物是水包油乳劑。本發明的化妝品組合物的優選實例具有約5，000至約200,000mPa.s(釐泊)的表觀粘度。例如，優選的洗劑具有約10,000至約40,000mPa.s的^Jf見粘度；優選的霜劑具有約30,000至約160,000mPa.s的^J現粘度。表觀粘度可以使用BrookfieldDVIIRV粘度計(TD轉子)以5rpm或其等效條件來測定。在製備組合物並使其穩定之後(通常在製備組合物後在25。C士rC和常壓的條件下至少24小時)，對組合物進行粘度測定。在25°C±rC,轉子轉動30秒後測量組合物的表觀粘度。本發明的化妝品組合物通常配製為pH9.5或更低，一般為pH4.5~9,更優選pH58.5。某些實例，特別是包含額外活性劑(如7jC楊酸)的實例需要更低的pH值，從而保證該額外活性成分的全部效力。這些組合物通常配製為pH2.5~5，更優選pH2.74。所述化妝品組合物可以包含多種任選成分，只要這些任選成分在物理和化學性質上與本文所述的必需成分相容並且不會不適當地損害與組合物有關的穩定性、效力或其它應用優點即可。任選成分可以在本發明組合物的載體中分散、溶解等。示例性的任選成分包括潤膚劑、吸油劑(oilabsorbent)、抗微生物劑、粘合劑、緩衝劑、變性劑、化妝用收斂劑、外用止痛劑、成膜劑、保溼劑、遮光劑、香料、顏料、皮膚舒緩和癒合劑(skinsoothingandhealingagent)、防腐劑、拋射劑、透皮促進劑、溶劑、助懸劑、乳化劑、清潔劑、增稠劑、增溶劑、蠟、防曬劑、仿曬劑(sunlesstanningagent)、抗氧化劑和/或自由基清除劑、螯合劑、抗痤瘡劑、抗炎劑、脫皮劑、有機羥基酸、維生素和天然提取物。這些物質的實例描述於Harry，sCosmeticology，第7版，Harry&Wilkinson(HillPublishers,London1982);PharmaceuticalDosageForms-DisperseSystems;Lieberman,Rieger&Banker,第1巻(1988)&第2巻(1989);MarcelDecker,Inc.;TheChemistryandManufactureofCosmetics,第2版，deNavarre(VanNostrand1962-1965);以及TheHandbookofCosmeticScienceandTechnology,第1版,Knowlton&Pearce(Elsevier1993),它們也可用於本發明。明的化妝品組合物。所述方法通常包^;一步或多步中將所'述成分混合成相對均勻的狀態，其中可以使用或不使用加熱、冷卻、抽真空等。所述化妝品組合物可用於調節或改善皮膚狀況，其包括調節可見的或可觸知的皮膚皺紋或不連續(discontinuity)，例如皮膚紋理或色澤的可見或可觸知的皺紋或不連續，特別是與皮膚炎症、老化或其它內部因素(例如，皮膚內部的生化改變)或外部因素(例如，紫外線輻射、環境汙染、風、熱、溼度低、粗糙的表面活性劑和磨料)有關的皺紋或不連續。可以預防性或治療性地調節皮膚狀況。預防性調節包括延緩、最小化或防止可見或可觸知的皮膚腫脹、皺紋或不連續。另一方面，治療性調節包括改善、減少、最小化或消除這些腫脹、皺紋或不連續。調節皮膚狀況包括改善皮膚的外觀感覺，例如使其外觀或感覺更加光滑、平整以及減少衰老的跡象。化妝品組合物以安全且有效的量局部應用至皮膚。其使用量、使用頻率和使用周期隨著給定組合物的活性水平以及期望的調節水平而變化。通常，可以每日使用一次所述組合物。然而，使用頻率可以在大約每周一次至大約每天3次或更多次之間變化。本發明的化妝品組合物應用至皮膚後使皮膚狀況迅速得到顯著改善。所a速改善包括遮蓋或掩蓋皮膚的缺陷(如紋理不連續(包括與皮膚炎症或老化相關的紋理不連續，例如毛孔擴大))，或者提供更均一的膚色。長期局部使用所述化妝品組合物也可以明顯改善皮膚狀況，例如，4吏用一周、一年或對象的整個生活期間。優選通過使用皮膚洗劑、霜劑、化妝品等形式的組合物(其可以較長時間地留在皮膚上從而起到某些美容、預防、治療或其它作用，即"留存(leave-on)，，組合物)來調節皮膚狀況。在向皮膚施用所述組合物後，該"留存"組合物優選留在皮膚上至少15分鐘並且可達12小時。根據以上的描述，本領域技術人員可以容易地確定本發明的必需特徵，並且在不背離本發明的精神和範圍的前提下，可以對本發明進行多種改變和修飾以使之適於多種用途和情況。因此，以下權利要求的範圍內也33包含另外的實施方案。以下的具體實施例僅作為示例進行解釋，而不以任何方式對說明書的其餘內容進行限制。無需進一步闡述，認為本領域技術人員可以基於本文的描述來最大限度地應用本發明。本文引用的全部出版物全部通過參考併入本文中。另外，下文中提及的任何機制均不以任何方式限制本申請的範圍。實施例1實驗步驟製備爪蟾胚胎，顯微注射和螢光素酶測定一一處理爪蟾胚胎和螢光素酶測定的實驗操作方法大致描述於Zhu等，2002，DevCell3,557-568。典型的細胞螢光素酶測定包括將2xlS個細胞分至12孔細胞培養板中並孵育24小時，然後用3fil脂質體轉染試劑(ThmsITl,Mirus)、1嗎所選基因的DNA質粒和0.3嗎才艮告質粒進行轉染(Hela細胞需要所述DNA和脂質體用量的1/3,而293T細胞需要1/6)。轉染48小時後，所述細胞用PBS洗滌，用lx細胞裂解緩衝液(Promega細胞裂解緩沖液)進行裂解，刮下並收集。冰上孵育30分鐘後，通過12，000g離心15秒收集細胞並將其移至新管；然後將20nl細胞裂解物與100^螢光素酶檢測試劑(Promega)混合，並通過閃爍計數來測量螢光素酶的活性。質粒和重組蛋白一一利用基於聚合酶鏈式反應的技術，將爪蟾的LEF1、LEF1AHMG、LEFlA60、LEFlAl60、Xom及其缺失突變體亞克隆至pCS2+和PGEX4T3載體中，並通過體外翻譯和測序進行驗汪。pGL3-OT和pGL3-OF由Dr.BVolgestein饋贈；p2.4BMP4-Luc獲贈於Dr.JFeng;pGL3國MSX2啟動子(WT)和pGL3-MSX2國SDM-600/-766啟動子獲贈於Dr.CSirard。製備細胞核和細胞質提取物——用胰蛋白酶消化細胞(4xl06)並用PBS洗滌兩次，離心收集沉澱。通過用含有lx蛋白酶抑制劑(Roche，蛋白酶抑制劑混合物)的150piRIPA緩衝液(150mMNaCl、1%NP40、0.5%DOC、0.1%SDS、50mMTrispH8.0)裂解細胞而獲得總蛋白。通過用含有lx蛋白酶抑制劑的150pl低滲緩衝液(0.05%NP40、10mMHEPESpH7.9、1.5mMMgCl2、10mMKCl、1mMDTT)在冰上孵育細胞(2xl06)IO分鐘，然後離心(4000rpm)2分鐘，從而獲得細胞質蛋白。收集上清液並作為細胞質蛋白使用。細胞核沉澱用PBS洗滌兩次。通過用150plRIPA緩衝液在冰上孵育所述沉澱60分鐘而得到細胞核蛋白。使用特異性抗體(TakaraBio)利用Western印跡來測定分級分離的細胞提取物中的P-聯蛋白水平。GST沉降實驗(GSTpull-downassay)——將5照GST融合蛋白和5nl35S標記的/Kr蛋白與20pi50%穀胱甘肽Sepharose4B珠子混合於500nl結合緩衝液(50mMTrispH8.0、100mMNaCl、50mMKCl、5mMMgCl2、lmMDTT、10%甘油和0.2%NP40)中。將混合物在4。C孵育3小時，用含有0.2%NP40的lxPBS洗滌4次。用2x樣品緩衝液釋放所結合的物質，在95。C煮沸5分鐘，快速離心，並通過SDS-PAGE和放射自顯影顯示結果。免疫共沉澱——通過將20plG蛋白瓊脂糖珠(proteinGplus-Agarosebead,SantaCruzBiotechnology)與1jxg相應抗體混合來製備親和G蛋白珠。用含有lx蛋白酶抑制劑(Roche)的lx細胞裂解緩衝液(Promega)將總共2xl(^個細胞裂解，冰上孵育30分鐘，快速超聲處理，並在4'C以12,000g離心5分鐘。在4°C，用20pi未經處理的G蛋白瓊脂糖珠和2嗎免疫前血清對所得上清液進一步純化2小時。然後，將上清液與20pi預先標記的G蛋白瓊脂糖珠於4。C過夜混合。用含有0.2%NP40的PBS洗滌珠子4次。用2x樣品緩沖液釋放所結合的蛋白質，在95'C煮沸5分鐘，快速離心，並使用特異性抗體通過Western印跡分析顯示結果。組織學染色——在指定階段，用3.7%曱醛、0.1MMOPS(pH7.4)、2mMEGTA和1mMMgS02固定胚胎。然後將胚胎包埋到石蠟中並切成10nm厚的切片。用蘇木精和伊紅(H&E)對切片染色，並進行組織學分析。繼而用2嗎/ml的4，，6-二W^2-丐l咮苯(DAPI,Invitrogen)對切片染色，從而顯示胚胎細胞的細胞核。利用實時PCR分析基因表達——利用Trisol法提取總RNA。將來自每個處理組的8個胚胎合併，並用1mlTrizol(Invitrogen)進行勻漿。然後向樣品中加入氯仿(200nl)。振蕩混合後，將樣品以12,000rpm離心l分鐘，並將上清液收集至新管中。向每個樣品加入異丙醇(500nl)，混合，並在室溫放置10分鐘。然後將樣品離心30分鐘。用70%乙醇洗滌所得沉澱兩次，在空氣中乾燥，並用100pl雙蒸水進行懸浮。通過在OD26進行測量來確定RNA的終濃度。根據製造商的說明，使用Superscript第一鏈合成系統(Invitrogen)來合成第一鏈cDNA。筒言之，使用來自每個樣品的2.5照總RNA。RT(逆轉錄)產物的務本積為20fil，並稀釋到200pl(IO倍稀釋)；使用8fU的經稀釋RT產物用於實時PCR(才艮據製造商的i兌明，^酸86-326)和XomID110(^J^酸1-130與胺基酸241-326的融合蛋白)。所有含有同源框區域的Xom突變體均與抗TCF4珠子發生免疫共沉澱，而缺少該同源域的突變體則不能。這些數據表明，Xom的同源域在介導Xom和LEF1/TCF因子之間形成複合物中起關鍵作用。在證實了Xom和TCF4在體內形成複合物之後，又鑑定了LEF1/TCF參與與Xom相互作用的關鍵結構域。在脊推動物中，已經鑑定了LEF1/TCF家族的至少四個成員(LEF1、TCF1、TCT3和TCF4),其中LEF1的表i^漠式與Xom類似。LEF1的合子轉錄始於MBT起始後，並在動物體的腹-尾側富集(Molenaar等，1998，MechDev75，151-154)。遺傳學數據表明LEFl對腹-後側的圖式形成起關鍵作用(Roel等，2002,CurrBiol12,1941-1945),這使得LEFl成為與Xom相互作用蛋白的可能候選物。因此，檢測Xom是否與LEFl相互作用，並通過缺失突變分析來研究LEFl參與該相互作用的關鍵結構域。發現很少有細胞共表達Xom和全長LEFl。因此，Xom和LEFl間可能的相互作用通過體外結合實驗**測。當35S標記的LEFl或其缺失突變體的體外翻譯(iTT)產物與GST-Xom或單獨的GST混合時，GST-Xom將LEFl沉降下來，而對照GST卻不能。LEFl的C端缺失突變體LEFlAHMG與Xom的親合力顯著減弱，而N端缺失突變體LEFl△60和LEF1A160結合GST-Xom與野生型LEFl同樣有效。因此，Xom和LEFl之間的相互作用似乎依賴於LEFl的C端基序，該假設進一步得到了LEF1/TCF反式激活測定的支持。為了確定LEF1/TCF介導轉錄的Xom反式激活的可能的生理學相關性，利用啟動子-愛光素酶分析檢測了Xom對BMP4下遊基因表達的影響。Msx2基因是BMP4的下遊基因，前者的啟動子包含LEF1/TCF結合位點和BMP4應答元件(SBE)(Hussein等，2003，JBiolChem278，48805-48814)。與LEF1/TCF可能直接參與BMP/Xom信號傳導一致的是，發現Xom既激活野生型Msx2啟動子也激活SBE突變的Msx2啟動子(其僅保留了有功能的LEF1/TCF結合位點)。Xom反式激活LEF1/TCF介導的轉錄，其不需要通過|3-聯蛋白積累來介導一一先前的研究已顯示，LEF1/TCF介導的轉錄由P-聯蛋白激活(Behrens等,1996,Nature382,638-642;Huber等，1996,MechDev59，3-10;Molenaar等，1996，Cell86，391-399)。為了研究Xom激活LEF1/TCF介導轉錄的機制，並排除Xom反式激活LEF1/TCF介導的轉錄是通過P-聯蛋白的蛋白水平升高或核易位增加來實現的可能性，在HCT116細胞中檢測Xom表ii^J"j3-聯蛋白的蛋白7JC平和細胞內分布的影響。已發現，儘管Xom的表達以濃度依賴性的方式激活LEF1/TCF介導的轉錄，但是細胞內p-聯蛋白的總蛋白水平並^M目應地增加(反而稍有降低)。另外，當將細胞內總蛋白分成細胞質部分和細胞核部分時，^Ji見察到Xom表達時P-聯蛋白明顯的核易位(同樣地，而是稍有降低)。還發現，與Xom相互作用的LEF1結構域位於其C端區域，該區域與參與|3-聯蛋白相互作用的N端結構域相分隔。在TOPFlash測定中，發現LEF1△60(LEF1的顯性失活突變體，其阻斷P-聯蛋白對LEF1/TCF介導轉錄的反式激活)促進Xom對LEF1/TCF介善轉錄的反式激活。這與Xom可能通過直接相互作用來反式激活LEF1/TCF介導的轉斜目一致。Xom通過其N端的TAD(反式激活域)來反式激活LEF1/TCF—一Xom與LEF1之間的相互作用允許我們進一步研究Xom反式激活LEF1/TCF介導轉錄的分子機制。先前的研究已顯示,P-聯蛋白通過其中部的Armadillo重複與TCF結合，而通過其C端基序激活TCF(vandeWetering等，1997,Cell88，789-799以及Orsulic等，1996,JCellBiol134,1283-1300)。因此，在鑑定了參與LEF1/TCF相互作用的Xom關鍵結構域之後，進一步分析了參與LEF1/TCF反式激活的Xom功能結構域。與僅轉染TOPflash的對照細胞相比，當將編碼Xom或其缺失突變體的cDNA與TOPflash報告基因構建體共轉染進293T細胞時，Xom及其C端缺失突變體XomCD85激活了TOPflash幾乎10倍。相比而言，Xom的N端缺失突變體(XomND55和XomND175)激活LEF1/TCF介導轉錄的能力顯著減弱。特別地，XomND175幾乎不具有反式激活LEF1/TCF介導轉錄的能力。與Xom通過直接相互作用反式激活LEF1/TCF介導轉錄的模型一致的是，發現缺少LEF1/TCF相互作用基序的Xom突變體不能在胚胎發生早期激活LEF1/TCF介導的轉錄。已知Xom是背側基因表達的轉錄阻遏蛋白。為了確定Xom的雙重轉錄功能是否彼此獨立，進一步研究了這些Xom缺失突變體對背側基因表達的作用。當把編碼Xom及其缺失突變體的mRNA連同編碼激活素(Activin)的mRNA和Gsc啟動子-螢光素酶構建體共同注射進兩細胞期的胚胎時，Xom的N端缺失突變體和C端缺失突變體均強烈抑制激活素誘導的Gsc啟動子活化。這些數據表明，Xom反式激活域的功能與Xom阻遏蛋白功能是獨立的，並且Xom反式激活域(TAD)位於其N端區域，這得到了胚胎發生早期TOPflash測定的進一步支持。Xom的N端TAD^_側信號傳導所需的一一Xom在中胚層分化期2005，ProcNatlAcadSciUSA102，4943-4948)。已提出，Xom與BMP4形成正加強環路(positivere-enforcementloop)以促進腹側細胞命運(Schmidt等，1996,Development122,1711-1721)。為了確定Xom的N端TAD是否在Xom反式激活腹側特異性基因中起作用，檢測了XomND175在胚胎形成早期對反式激活BMP4啟動子的作用(BMP4-螢光素酶構建體獲贈於Dr.J.Feng)(Zhang等,2002,BiochemBiophysResCommun293,1412-1419以及Ogawa等,2006,JBiolChem281,18363-18369)。結果發現，與Xom不同的是，XomND175不能反式激活BMP4啟動子。而且，與對照胚胎的荄光素酶活性相比，注射有XomND175的胚胎表現出較低的螢光素酶活性，這提示XomND175的表達發揮了顯性失活的作用從而阻斷了內源Xom的活性。為了進一步確定Xom的TAD對下遊基因的影響，將編碼Xom或XomND175的mRNA分別注射進兩細胞期胚胎的兩個卵裂^一。使該胚胎發育至原腸胚階段(10.5期)，從經注射的胚胎和未經注射的胚胎提，取總mRNA。使用組蛋白H4作為內部對照，利用Q-PCR來檢測BMP4和Xom的表達水平。與其反式激活腹側基因表達的作用一致的是，野生型Xom的表達增強了BMP4的表達。相反地，XomND175的表達不能增強BMP4的表達，這提示Xom的TAD是其反式激活BMP439表達所需的。而且，與破壞BMP4和Xom的自主正^J績環路(positiveautofeedbackloop)—致的是，XomND175的表達強烈抑制Xom本身的表達。聯繫到腹側特異性基因啟動子上的LEF1/TCF結合位點是其應答BMP4信號傳導所需的，並且LEFl功能喪失導致腹側缺陷(Roel等,2002,CurrBiol12,1941-1945以及Karaulanov等，2004,EmboJ23，844-856)，我們的結果提示Xom對LEF1/TCF介導轉錄的反式激活可能在腹側信號轉導和腹側細胞命運決定中起關鍵作用。Xom反式激活LEF1/TCF是原腸胚形成所必需的一一我們的生化和誘變研究顯示，Xom在其N端區域包含LEFl/TCF反式激活域。經鑑定，Xom突變體(XomND175)幾乎沒有LEF1/TCF反式激活能力，但仍保留了轉錄阻遏蛋白的功能。為了確定Xom反式激活LEF1/TCF介導的轉錄在胚胎發生早期的潛在生理學功能，使用失功能(lossoffunction)方法來研究XomND175表達對胚胎發生的作用。將編碼Xom、XomND175和另一些Xom缺失突變體的mRNA注射進四細胞期的兩個腹側卵裂球之一。觀察到，用XomND175的mRNA而非其它Xom突變體的mRNA注射的胚胎表現出原腸胚形成期間的破壞性影響。除了XomND175的突變特異性表型以外，XomND175的作用似乎還是階段特異性的。與XomND175-mRNA不同的是，XomND175-cDNA在原腸胚形成期間幾乎不導致異常。進一步研究顯示，用XomND175-mRNA注射的胚胎可以正常通過卵裂期和原腸形成前期；然而，當原腸胚形成開始時，許多較大的灰白色細胞出現在注射一側。隨著原腸胚形成的繼續進行，這些細胞逐漸喪失既定的細胞外觀，使胚胎變成"破爛狀(rottenappearance)",為了確定與XomND175表達有關的細胞和組織改變，將經XomND175-mRNA注射的胚胎和對照胚胎固定，切成10pm厚的切片，用H&E和DAPI進行染色。在卵裂期和原腸胚形成前期，幾乎沒有與ND175表達有關的組織改變，但是在原腸胚形成期觀察到許多大的圓縮(rounded-up)結構，其看上去是死細胞。經ND175注射的胚胎中這些大的圓縮結構均不能用DAPI染色，這提示它們已失去正常的細胞結構(如細胞核)。胚胎似乎對XomND175的作用非常敏感。少於50pg的XomND175-mRNA就能實現50%有效滲透率(結果未顯示)。發現缺少TAD的Xom顯性失活突變體的表達導致胚胎發育阻滯於原腸胚形成期，這提示Xom反式激活LEF1/TCF介導的轉錄對原腸胚形成是關鍵的。與BMP4有關的另一些轉錄因子(如Bix3)也有類似的發現(Trindade等,2003，Development130，4611-4622)。實施例2為了研究Xom與LEF1的細胞內相互作用及其可能的細胞作用，利用標準方法研究了Hela細胞中LEF1存在或不存在時Xom的細胞內分布和作用。結果發現，在經轉染的Hda細胞中，野生型Xom聚集在細胞核中。然而，當將Xom和LEF1共轉染進Hela細胞時，很少有細胞表達這兩種蛋白。共表達Xom和LEFl的少數細胞常常包含巨大的多葉細胞核，這表明共表達Xom和LEF1導致生長停滯。為了證實Xom通過與LEF1在功能上相互作用來介導生長抑制作用，將Xom與顯性失活的LEF1(LEF1AHMG)共轉染進Hela細胞。結果發現，許多經轉染的細胞共表達Xom和LEFlAHMG，這表明Xom通過與LEF1在功能上相互作用來介導生長抑制作用。使用GFP和MTA細胞活力測定來進一步驗證該假設。簡言之，將5xl4個細胞鋪在96孔細胞培養板上。鋪板24小時後，用0.3jxlTransIT-1和0.1嗎質粒DNA轉染細胞。轉染36小時後，使用CellTiter96Aqueous非放射性細胞增殖檢測試劑盒(Promega)來測量細胞的活力。每種轉染重複4次以減少實驗溪差。結W明，共表達Xom和LEFl顯著降低了經轉染Hela細胞的活力。Xom和LEF1在功能上的相互作用對Xom影響細胞命運是重要的，與W目一致地，在共表達Xom和LEFl(AHMG)的細胞中生長停滯表型削弱了。在用Xom和LEF1或LEF1AHMG轉染的細胞中，對胱天蛋白酶3(caspase3)的活化水平進行了檢測，從而研究Xom與LEF1相互作用對細胞生長停滯的影響是否與胱天蛋白酶的活化有關。結果發現，Xom和Xom/LEF的表達增強了胱天蛋白酶3的活化水平，該作用可以被凋亡抑制劑ZVAD阻斷。Xom對胱天蛋白酶3的活化作用被LEFAHMG的共表達所阻斷，這提示Xom與LEF1之間在功能上的相互作用是激活細胞凋亡所需的。Xom介導的LEF1促凋亡活性似乎與j3-聯蛋白介導的LEF1/TCF抗凋亡作用是相反的。BMP4/Xom是背腹圖式形成的關鍵調節物。儘管先前的研究確定了LEF1/TCF在背側發育中的作用，然而LEF1/TCF與Xom之間的相互作用提示了LEF1/TCF在腹側發育中在介導BMP4/Xom途徑的信號傳導中起作用。為了發汪該假設，對LEF1是否增強Xom的腹側發育作用進行了研究。當在背側卵裂球中表達低水平的Xom或LEFl時，幾乎未檢測到可辨識的腹側發育作用。然而，共表i^目同濃度的Xom和LEF1則導致顯著的背側發育抑制。與這些結果一致的是，發現單獨表達LEF1以劑量依賴的方式輕微地抑制背側發育。為了確定LEF1在介導Xom信號傳導中的功能特異性，研究了顯性失活的LEF1(AHMG)對Xom的腹側發育作用的影響。結果發現，AHMG的表達拯救了過表達高水平Xom所導致的腹側發育表型，而在背側卵裂球單獨表達AHMG則幾乎不引起可辨識的變化。上述結果表明，先前已知作為Wnt/p-聯蛋白途徑的介導物的LEF1/TCF家族轉錄因子還參與BMP4/Xom途徑。因此，Xom和卩-聯蛋白可以竟爭LEF1/TCF，從而實現它們在細胞命運決定中的不同功能。先前的研究已確定LEF1/TCF在抗凋亡和背側發育中與Wnt途徑的P-聯蛋白有關的作用。我們目前的研究表明，LEF1/TCF與Xom的結合導致細胞生長停滯與腹側發育。因此，LEF1/TCF作為Xom/BMP4和(3-聯蛋白/Wnt信號傳導的匯合點來介導它們對細胞^^運的共同信號傳導作用。除了與同家族的轉錄因子(針對不同的表型)竟爭並且與Smad相區別以外，發現Xom的表達降低了P-聯蛋白的蛋白水平並阻斷了j3-聯蛋白對LEF1/TCF介導轉錄的反式激活。鑑於在圖式形成和多種癌症的惡性轉化中P-聯蛋白反式激活LEF1/TCF的提示，對LEF1/TCF介導的細胞命運決定中BMP/Xom之分子機制的進一步研究對於了解胚胎發生的基^制非常重要，並且對治療腫瘤和退行性疾病具有重要的提示性意義。我們在研究中發現，BMP4途徑的新組分對細胞命運決定是至關重要的。基於我們的上述結果，還發現BMP4途徑利用TCF/LEF1轉錄因子來轉導其信號。還發現，共表達LEF1/TCF因子和Xom(BMP4途徑的組分)誘導結腸癌細胞死亡，其效力接近100%。在宮頸癌和前列腺癌細胞的基因治療方法中也有效。利用標準方法克隆Xom的人同源物Hom(先前稱為VentX2)，並進行上述測定。結果發現，Hom的功能與爪蟾Xom的功能相似。Xom的穩定性對細胞命運決定是關鍵的。單獨表達野生型Xom造成30%結腸癌細胞生長阻滯，而表達穩定型Xom則導致60%結腸癌細胞生長阻滯。Xom的蛋白水平受蛋白酶解控制，並受Serl40/144磷酸化的控制。開發了用於監測Xom激酶活性的方法和材料(例如，特異性磷酸化抗體)，可以使用所述方法和材料來篩選有效預防和治療癌症的藥物。實施例3如上所述，Hom是脊推動物中Xom的人同源物。生化研究表明，Hom結合轉錄因子LEF1/TCF並阻斷Wnt/p-聯蛋白途徑中致癌信;f傳導對LEF1/TCF的反式激活。Hom定位於染色體10q26，該區域常在^"移癌(如轉移性結腸癌)中缺失，這提示Hom在癌症形成和轉移中的作用。為了研究Hom對癌細胞生長的潛在作用，將Hom在結腸癌細胞和肺癌細胞(分別為HCT116和H460)中瞬時表達，並研究與Hom表達有關的形態學改變。將編碼GFP-Hom或單獨GFP的質粒(0.5~2嗎)轉染進HCT116或H460細胞。在轉染36小時後，用多聚甲醛固定細胞。利用相差顯^t鏡或螢光顯^t鏡來研究與GFP-Hom或GFP表達有關的形態學改變。結果發現，在瞬時表達GFP-Xom的結腸癌細胞和肺癌細胞中，GFP-Hom的表達使超過80%的細胞變為圓縮表型。相反地，在該測定中，在表達GFP的結腸癌細胞和肺癌細胞中，少於10%的細胞變為圓縮表型。為了進一步確定與GFP-Hom的表達有關的形態學改變並確定所述圓縮表型是否與細胞生長阻滯/死亡有關，對瞬時表達GFP-Hom的癌細胞進行TUNEL測定。用編碼GFP(載體)或GFP-Hom的質粒瞬時轉染HCT116或H460細胞。在轉染24小時後，收集細胞並用Hoechst33258染色以顯示細胞核。包含典型的凝縮染色質和片段化細胞核的細胞被記作凋亡細胞。通過對凋亡細胞和正常形態細胞計數來確定表現為凋亡形態的細胞的百分比。通過隨機選取現野，針對每個樣品對至少400個細胞進行計數。結果發現，在瞬時表達GFP-Hom的HCT116和H460細胞中大約30%表現為凋亡表型，而在對照GFP組中大約5%的細胞表現凋亡表型。該結果提示，Hom的表達誘導癌細胞死亡。Hom對癌細胞的生長抑制作用在體外集落形成實驗中也得到了驗證。結果發現，與表達GFP的對照細船目比，GFP-Hom的表達使結腸癌細胞和肺癌細胞的集落形成減少了100%。p53是參與腫瘤抑制的關鍵細胞因子。已顯示，p53與另一些腫瘤抑制基因(如ARF)—起作用從而抑制腫瘤細胞生長。p53的失功能突變被認為是惡性腫瘤轉化的主要步驟。為了確定p53是否在Hom抑制癌細胞43生長中起作用，根據上述實驗步驟分別使用HCT116p53-A和H1299細胞，對Horn在p53缺失或突變的結腸中的作用ii行研究。結果發現，GFP-Hom的表達導致約30%的p53-A結腸癌細胞和肺癌細胞出現凋亡表型，該表型與^^有野生型p53的結腸癌細胞和肺癌細胞類似。該結果提示，Horn引起的細胞死亡是p53非依賴的。因此，Hom可以在p53發生突變的多種癌細胞中發揮著主要的腫瘤抑制功能。為了確定Hom是否可以在體內抑制腫瘤形成，在無胸腺棵鼠中對Hom對於結腸癌細胞生長的作用進行了研究。所用棵鼠購自Charles'RiverLaboratory。用編碼GFP-Hom的質粒瞬時轉染HCT116細胞(GFP用作成功轉染的指示)。對照HCT116通過轉染GFP空載體來製備。對於皮下注射來說，每個注射部位準備5xl06個細胞。用胰蛋白酶將細胞從培一分離，之後用完全血清將胰蛋白酶滅活。然後收集細胞，以400g離心5分鐘，並用PBS重懸至終濃度為5xl(T個細胞/ml。進行兩組測試。在第一組中，在轉染後，使用GFP作為分選標記，從未轉染的細胞中分選出經GFP-Hom或GFP轉染的HCT116細胞。在第二組中，不進行GFP表達的分選，將轉染細胞直接用於注射(轉染效率約為60%)。在使用酒精局部消毒後，使用l-cc注射器將所述細胞皮下注射進棵鼠的背側肩部。每個部位注射100pl細胞，其中包含5xl(^個細胞。將經注射的小鼠做耳部標記，每天進行觀察，直至21天(棵鼠中形成腫瘤通常需要7到10天)。在形態學觀察之後，將該動物處死並將肺瘤取出。使用HE染色和顯微鏡觀察來確定肺瘤的細胞和結構異常。結果發現，用表達GFP-Hom的經分選HCT116細胞注射的棵鼠中無腫瘤形成。相反地，用僅轉染GFP載體的HCT116細胞注射的棵鼠中發現腫瘤。類似地，用表達GFP-Hom的未經分選HCT116細胞注射棵鼠中具有腫瘤，但是與用僅轉染GFP的HCT116細胞注射的對照棵鼠相比，其腫瘤尺寸減小約60%。這些結果支持了Hom抑制肺瘤發生。為了確定Hom表達是否在體內影響細胞增殖和生存，將腫瘤樣品切片並進行TUNEL測定，其中可以通過末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)將BrdU(5-溴脫氧尿苷)三磷酸摻入DNA片段(凋亡標誌)的3，羥基端。可以使用螢光標記的抗BrdU抗體iM^測BrdU摻入情況。TUNEL測定顯示，表達GFP-Hom的腫瘤細胞凋亡顯著，而^l^達GFP的肺瘤細胞中幾乎檢測不到凋亡發生。其它實施方案本說明書所公開的所有特徵可以以任何組合方式進行組合。本說明書中公開的每個特徵可以替換為具有相同、等效或類似目的的可選特徵。因此，除非另有說明，所公開的每個特徵只是一系列等效或類似特徵的示例。已對本發明的若干實施方案進行描述。然而，可以理解的是，在不背離本發明的精神和範圍的前提下，可以進行多種修改。因此，以下權利要求的範圍內還包括其它實施方案。權利要求1.一種用於治療對象中細胞增殖性疾病的方法，該方法包括向有此需要的對象施用有效量的包含SEQIDNO1或3的多肽或其功能等效物。2.權利要求l的方法，其中所述細胞增殖性疾病是以LEF1/TCF所介導轉錄的異常活化為特徵的病症。3.權利要求2的方法，其中所述多肽缺少LEF1/TCF反式激活域。4.一種用於治療對象中炎症相關疾病的方法，該方法包括向有此需要的對象施用有效量的包含SEQIDNO:1或3之多肽或其功能等效物的抑制劑。5.權利要求4的方法，其中所述炎症相關疾病是自身免疫病或炎性疾病。6.—種用於治療骨髓發育不良症候群的方法，該方法包括向有此需要的對象施用有效量的包含SEQIDNO:1或3之多肽或其功能等效物的抑制劑。7.—種鑑定用於治療細胞增殖性疾病或炎症相關疾病的化合物的篩選方法，該方法包括將測試化合物與含有SEQIDNO:3中包含Serl40或Serl44之片段的多肽接觸，或者與包含所述多肽的細胞接觸；以及確定Serl40或Serl44的磷酸4匕，其中，如果所述化合物存在時的磷酸化水平低於該化合物不存在時的磷酸化水平，則表明該化合物是治療所述疾病的候選藥物。8.權利要求7的方法，其中所述片段的長度至少為ll個胺基酸殘基。9.組合物，其包含具有SEQIDNO:l序列或其功能等效物的多肽或者該多肽的激活劑。10.權利要求9的組合物，其中所述組合物包含白藜蘆醇、鞣花酸和乙醯水楊酸。11.權利要求10的組合物，其中所述組合物還包含水楊酸、大黃素或黃酮類化合物。12.權利要求9的組合物，其中所述組合物是局部應用的組合物。13.權利要求9的組合物，其中所述組合物是食用組合物。14.權利要求13的組合物，其中所述組合物是茶、軟飲料、果汁、奶、咖啡、果凍、冰淇淋、酸奶、餅乾、穀類食品、巧克力、士力架、糖果、口香糖、糖漿或食物膠嚢。15.—種用於護膚的方法，其包括向有此需要的對象施用安全且有效量的權利要求12所述的組合物。16.—種評估對象中癌症預後的方法，該方法包括從該對象獲得生物樣品；以及確定該樣品中是否存在編碼含有SEQIDNO:1的多肽的基因，由此，如果所述基因存在於兩條染色體上，則表明該對象具有良好的預後；反之，如果所述基因從染色體之一丟失，則表明該對象具有差的預後。17.權利要求16的方法，其中所述生物樣品是腫瘤活檢樣品、血樣、尿樣或糞便樣品。18.—種評估對象中癌症預後的方法，該方法包括從該對象獲得生物樣品；以及確定該樣品中編碼含有SEQIDNO:1的多肽之基因的表達水平，其中，如果所述表達水平高於對照水平，則表明該對象具有良好的預後；反之，如果所述表達水平低於對照水平，則表明該對象具有差的預後。19.權利要求18的方法，其中所述方法還包括在確定該樣品中編碼含有SEQIDNO:1的多肽之基因的表達水平之前，將所述樣品與化療試劑接觸。20.權利要求18的方法，其中所述生物樣品是腫瘤活檢樣品、血樣、尿樣或糞便樣品。21.—種用於維持多潛能細胞的方法，該方法包括將所述細胞與含有SEQIDNO:1的多肽的激活劑接觸。22.權利要求21的方法，其中所述多潛能細胞是幹細胞。23.權利要求22的方法，其中所述幹細胞選自造血幹細胞、胃腸幹細胞、神經幹細胞和皮膚幹細胞。24.包含SEQIDNO:l、3或17所述序列的分離的多肽。25.權利要求24的分離的多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:11、12、13、14、15或16。26.分離的核酸，其包含編碼權利要求24的多肽的序列。27.包含權利要求26的核酸序列的表達載體。28.包含權利要求26的核酸序列的宿主細胞。29.—種產生多肽的方法，其包括在允許表達核酸所編碼的多肽的條件下，在培養基中培養權利要求28的宿主細胞，以及從所述培養細胞或該細胞的培養基純化所述多肽。30.—種診斷對象中骨髓發育不良症候群的方法，該方法包括從該對象獲得生物樣品；以及確定該樣品中編碼包含SEQIDNO:1的多肽之基因的表達水平，其中，如果所述表達水平高於對照水平，則表明該對象患有或者易於發生骨髓發育不良症候群。31.—種診斷對象中系統性紅斑狼瘙的方法，該方法包括從該對象獲得生物樣品；以及確定該樣品中編碼包含SEQIDNO:1的多肽之基因的表達水平，其中，如果所述表達水平高於對照水平，則表明該對象患有或者易於發生系統性紅斑狼瘡。全文摘要本發明公開了用於治療發育相關疾病的組合物和方法。還公開了診斷方法、預後方法和藥物篩選方法。文檔編號C07K14/435GK101505780SQ200780010741公開日2009年8月12日申請日期2007年2月22日優先權日2006年2月22日發明者朱正崙,紅高申請人:朱正崙;高紅