抗腫瘤試劑和新型DNase的製作方法

2023-12-09 01:50:36

專利名稱：：抗腫瘤試劑和新型DNase的製作方法
技術領域：
：本發明涉及抗胂瘤試劑和新型DNase。技術背景癌細胞的一個最大特徵就是非調控的增殖能力。抗腫瘤試劑大多以DNA為靶標，已知損傷的DNA可活化特異的凋亡途徑。凋亡不同於僅是細胞崩解過程的壞死，它是由基因調控的主動的細胞死亡過程(非專利文獻1)。以DNA為靶標、引起DNA損傷的抗胂瘤試劑，已經公知的有，例如烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、或Am-C(阿糖胞苦)等。烷化劑通過對DNA的鹼基進行烷基化修飾(形成加合物)，引起DNA不可逆的斷裂。拓樸異構酶抑制劑通過穩定拓樸異構酶與DNA的中間複合體(Cleavablecomplex)而引起DNA不可逆的斷裂。Ara-C作為脫氧腺苷錯誤參入到DNA中，抑制DNA聚合酶而引起DNA損傷。通過該抗肺瘤試劑造成DNA損傷時，最終可通過DNase引起凋亡而消除癌細胞。但是，以DNase自身作為抗腫瘤試劑使用還完全未知，而且，DNase是作用於正常細胞還是僅特異地作用於癌細胞也完全未知。另外，雖然已知限制性酶在特定識別位點切割DNA,但限制性酶其自身作為抗腫瘤試劑使用還完全未知，而且，限制性酶是作用於正常細胞還是僅特異地作用於癌細胞也完全未知。非專利文獻l:BritishJournalofCancer,(英國)，1972年,第26巻，p.239發明公開發明預解決的課題4"A口pi丄厶曰畫sJ"曰/j+"7"/Am工re4m工乂<e<i山乂+pfi工、#乂丄4、及h"wv-fe^7e^疋^疋'htv叫、'i下/n-j止吊多田月&向1又^r開;t也Tf幵J卞:fe，田llTF用少的抗胂瘤試劑，還才是供作為其有效成分有用的新型DNase。解決課題的手段上述課題通過本發明提供的含有DNase作為有效成分的抗腫瘤試劑而解決。本發明的抗腫瘤試劑的優選實施方案，其中有效成分含DNase和脂質體的複合體。本發明的抗腫瘤試劑的其它優選實施方案，其中DNase為限制性酶、或者後面所述的新型DNase(例如MKN-28DNase或HeLaDNase)。此外，本發明涉及具有如下性質的DNase(以下稱作MKN-28DNase):(a)作用及底物特異性具有核酸內切酶活性；(b)分子量48~43kDa(凝膠過濾色譜)；(c)最適pH:3.0-4.5;(d)熱穩定性100。C加熱10分鐘，核酸內切酶活性不失活；(e)對蛋白酶K處理的敏感性37'C反應15分鐘，核酸內切酶活性失活。本發明還涉及具有如下性質的DNase(以下稱作HeLaDNase):(a)作用及底物特異性具有核酸內切酶活性；(b)分子量63kDa(凝膠過濾色譜)；(c)最適pH:3.0~4.5;(d)熱穩定性100。C加熱10分鐘，核酸內切酶活性失活；(e)對蛋白酶K處理的敏感性37。C反應15分鐘，核酸內切酶活性不失活。此外，本發明還涉及藥物組合物，它包括MKN-28DNase或HeLaDNase,和藥劑學或者獸醫學可接受的常規的載體或稀釋劑。此外，本發明涉及DNase在抗腫瘤試劑製備中的應用。再者，本發明涉及癌的治療或預防方法，包括給有必要進行癌的治療或預防的對象，施用有效量的DNase。發明的效果本發明的抗腫瘤試劑對各種培養的細胞顯示出細胞增殖抑制效果，但對正常細胞無細胞增殖抑制效果。由於本發明的抗肺瘤試劑僅特異地作用於癌，所以是副作用少的抗腫瘤試劑。另外，本發明的新型DNase，或者能作為本發明的抗胂瘤試劑有效成分應用的限制性酶，對各種培養的細胞顯示出細胞增殖抑制效果，但對正常細胞無細胞增殖抑制效果。因此，本發明的新型DNase，或者所述的限制性酶，作為本發明的抗肺瘤試劑的有效成分有用。實施發明的最佳狀態[1]本發明的抗腫瘤試劑本發明的抗胂瘤試劑含有DNase作為其有效成分。對所述的DNase沒有特殊限定，只要是對胂瘤細胞顯示細胞增殖抑制效果，且對正常細胞無細胞增殖抑制效果的DNase即可。能作為本發明的抗腫瘤試劑的有效成分應用的DNase包括，例如，本發明的MKN-28DNase、本發明的HeLaDNase、DNaseII、DNaseI、NUC18、DNaseV、DNaseVI、Ca2+/Mg2+核酸內切酶(例如，人Ca^/Mg"核酸內切酶、牛Ca^/Mg"核酸內切酶、或大鼠Ca2+/Mg^核酸內切酶)、Mg^大鼠核酸內切酶、大鼠中性DNase、牛核核酸內切酶、CHO酸性核酸內切酶、大鼠DNasea、大鼠DNase(3、大鼠DNasey、或各種限制性酶等。此外，本發明不僅包括只具有DNase活性的酶，還包括除DNase活性以外還一起具有其它酶活性的酶，例如拓樸異構酶II(促旋酶)、整合酶(例如，Y整合酶)等。DNase既可以是核酸內切酶也可以是核酸外切酶，但優選核酸內切酶。本發明的抗腫瘤試劑中可單獨使用這些DNase中的一種，或者聯合應用2種以上的酶(例如，核酸內切酶間聯合，核酸外切酶間聯合、或者核酸內切酶與核酸外切酶聯合)。DNase是否對腫瘤細胞有細胞增殖抑制作用，而對正常細胞無細胞增殖抑制作用，例如，可以通過公知的抗肺瘤作用測定方法[例如，MTT法(J.Virol.Methods,20,309-321,1988;JournalofVirologicalMethods,20,309,]98"],本領域技術人員很容易確定出來。應用MTT法時，例如，按照後面實施例4中描述的程序，確定評價對象DNase是否對胂瘤細胞有細胞增殖抑制作用，而對正常細胞無細胞增殖抑制作用。具體而言，作為評價用的細胞，準備癌培養細胞(例如，MKN-28細胞或HeLa細胞)及正常細胞(例如，MRC-5細胞或HEF糹田胞)，製備各細胞的細胞懸液。將適當稀釋系列(例如，2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀釋)的評價對象DNase溶液分別加到微孔板的各孔中，然後，添加上述細胞懸液，培養一定的時間(例如4天)。培養終止後，向各孔中添加MTT[3-(4,5-甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基総溴化物，SigmachemicalCo.]溶液，培養一定的時間(例如，37。C4小時)，然後，去除培養上清，添加MTT曱臘洗脫液[含有10%(v/v)TritonX-100的酸化異丙醇]溶液。振蕩板子後，用微板讀數儀測定在540nm和690nm測定雙波長OD值，算出IC5。。IC5。值表示對對照細胞(未添加抗腫瘤試劑)增殖的抑制達50%的試驗液的稀釋倍數或藥劑濃度(例如，^g/ml)。因此，稀釋倍數越高，或者藥劑濃度越低，即可斷定是效果高的藥劑(物質)。作為本發明的抗腫瘤試劑的有效成分應用的DNase，優選是本發明的MKN-28DNase或者是HeLaDNase,或者是限制性酶。已知正常細胞癌變的原因之一是存在於正常細胞中的原癌基因發生點突變。例如，人癌基因活化型c-ras(H-ms、K-ras、N-ras),就是由於proto-ras基因的特定密碼子發生點突變而激活的。例如，來源於人的肺癌培養細胞A549,c-Ki-ras2的第12位的密碼子的鹼基序列由5'-GGT-3，(Gly)變為5，-AGT-3'(Ser)，也就是說，密碼子的3個鹼基中第一個鹼基由G變成了A,從而使細胞變成癌細胞。A549細胞中，c-Ki-ras2的第11和12位的鹼基序列突變前為GCTGGT,突變後變成GCTAGT。由於突變後的鹼基序列GCTAGT中的序列'CTAG，是限制性酶XspI的酶切識別序列'C:TAG，(符號'，表示酶切位點)，所以給A549和因相同點突變而惡性轉化的腫瘤使用時，本發明的抗肺瘤試劑可作為其有效成分，例如可選擇限制性酶XspI。此外，也可選擇識別相同鹼基序列的同裂酶。需要指出的是，由於限制性酶XspI不酶切突變前的鹼基序列GCTGGT,所以對正常細胞沒有影響。本發明中，根據治療的腫瘤的種類，以其點突變的鹼基序列為基礎，可選擇適當的限制性酶。其具體例示於表l。表l中，"突變前密碼子"一欄的括號內的數字代表密碼子的序號。"突變後密碼子"一欄中，用小寫字母表示的鹼基為突變的鹼基，鹼基序列中的下劃線表示限制性酶識別的序列。[表l]tableseeoriginaldocumentpage7本發明的抗腫瘤試劑，可單獨含有DNase，但優選含有DNase和脂質體的複合體形式。可在本發明中應用的脂質體，例如，可以是由磷脂、糖脂或膽固醇等脂質分子和/或表面活性劑等製備而成的脂質體，可以是單層膜的脂質體，可以是多層膜的脂質體。可用於製備脂質體的磷脂一般包括，例如，甘油磷脂(磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、或心磷脂)，或者鞘磷脂(例如鞘髓脂，神經醯胺磷脂醯乙醇胺、或神經醯胺磷脂醯甘油)。可用於製備脂質體的糖脂包括，例如，甘油糖脂(雙半乳糖甘油二酯、甘露糖脂質(seminolipid))或鞘糖脂(神經醯胺半乳糖、神經醯胺乳糖)。可用於製備脂質體的表面活性劑包括，例如、聯十六烷基磷酸鹽、硬脂醯胺。本發明的抗胂瘤試劑含有DNase和脂質體的複合體時，對其存在形式沒有特殊限定，只要DNase和脂質體可同時以複合體的形式包含在其內即可。作為複合體，可包括多種形式，例如DNase和脂質體以混合物的形式，或者用脂質體包埋DNase的包埋體形式，或者膠嚢化等形式，但優選包埋體。包埋體的製備可以，例如用將本發明中的有效成分DNase封入到脂質體的方法。即，將構成脂質體的脂質(例如，磷脂醯膽鹼、聯十六烷基磷酸鹽、膽固醇)溶解到適當的溶劑(例如氯仿)中，傾注到適當的容器中，然後通過吹入氮氣除去溶劑，將另外製備的DNase溶液移入到該容器中，混旋後，在預定的溫度(例如37°C)預定的時間(例如30分鐘)內進行孵育，製備成封入了DNase的脂質體。此外，本發明的抗腫瘤試劑含有DNase和脂質體的複合體時，該複合體中還可含有熱變性的免疫球蛋白G(AggregatedIgG)。熱變性IgG可以這樣製備，例如，將15mg人IgG(人IgGPurified,SigmaChemicalCo.)溶解到lmLRinger溶液中，60。C力。熱10分鐘[Biochemistry,15，452，1976]。加入DNase和脂質體的複合體量的1/100的熱變性IgG,將IgG最終濃度調成l50^ig/ml。已知熱變性IgG能與Fc受體結合。因此，如果熱變性IgG存在於脂質體表面，就能通過存在於腫瘤細胞膜的Fc受體，與Fc受體結合，引起受體介導的內吞，從而顯示更高的細胞增殖抑制作用[Biochemistry,15(2),452-460,1976]。本發明的抗肺瘤試劑中，可將DNase(優選DNase與脂質體的複合體)單獨，或者與期望的藥劑學或獸醫學上可接受的常規的載體或稀釋劑一起施用給動物，優選哺乳動動物(尤其是人)。此外，發明中的有效成分DNase(優選DNase與脂質體的複合體)可在抗胂瘤試劑的製備中使用。施用的劑型無特殊限定，包括，例如粉劑、細粒劑、顆粒劑、片劑、膠嚢劑、懸浮液、乳液、糖漿、浸膏劑、或丸劑等口服試劑，或者注射劑、外用的液體製劑、軟膏、栓劑、局部施用的乳膏、或點眼液等非經口製劑。這些經口劑，例如，可應用明膠、藻酸鈉、澱粉、玉米澱粉、白糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、羧曱基纖維素、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、結晶纖維素、大豆卵磷脂、蔗糖、脂肪酸酯、滑石、硬脂酸鎂、聚乙二醇、矽酸鎂、無水矽酸、或合成的矽酸鋁等賦形劑、粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、流動性促進劑、稀釋劑、保存劑、色素、香料、矯味劑、穩定劑、保溼劑、防腐劑、或抗氧化劑等按照常規方法製備。作為非經口施用方法，例如注射(皮下、靜脈內、動脈內等)或直腸施用等。這些製劑中，注射劑是最適宜的。例如，製備注射劑的過程中，除作為有效成分的DNase(或前述的複合體)之外，可任意應用，例如生理鹽水或Ringer液等水溶性溶劑、植物油或脂肪酸酯等非水溶性溶劑、葡萄糖或氯化鈉等等滲液、助溶劑、穩定劑、防腐劑、懸浮化劑或乳化劑等。另外，本發明的抗胂瘤試劑可以應用緩釋性多聚體的緩釋劑形式應用。例如，將本發明的抗胂瘤試劑整合到聚乙烯乙烯醋酸多聚體的小球中，將該小球外科移植到用於治療或預防的組織中。本發明的抗肺瘤試劑，其DNase(或前述的複合體)的含量在0.01~99%(重量)，優選0.1~80%(重量)，但並不限定於此。應用本發明的抗腫瘤試劑時的施用量，例如可根據疾病的種類、患者的年齡、性別、體重、症狀的程度、或施用方法等適當確定，可經口或非經口施用。再者，形式也不僅限於醫藥品，可多種形式給予，例如以功能性食品和健康食品、或作為飼料以食物的形式給予。能用本發明的抗腫瘤試劑進行治療和/或預防的癌包括，例如胃癌、大腸癌、肝癌、腎臟癌、乳腺癌、口腔癌、胰腺癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、肺癌或白血病等，但不限於這些部位。[2]本發明的DNase能作為本發明的抗肺瘤試劑的有效成分使用的DNase中，本發明的MKN_28DNase及HeLaDNase均是新型的DNase。本發明的MKN-28DNase,例如可從來源於人的胃癌培養細胞MKN-28(RCB1000，理化學研究所)中獲得，它具有以下性質(a)作用及底物特異性具有核酸內切酶活性；(b)分子量48~43kDa(凝膠過濾色譜)；(c)最適pH:3.0~4.5;(d)熱穩定性10(TC加熱10分鐘，核酸內切酶活性不失活；(e)對蛋白酶K處理的敏感性37。C反應15分鐘，核酸內切酶活性失活；(f)2價陽離子要求性Ca^要求、Mg^不要求。微微依賴於Mn^或Zn2+。(Mn2+0.011.0mmlo/L,Zn2+0.010.1mmol/L)。高濃度(10mmol/L)時，Ca2+、Mg2+、Mn2+、或Zn2+產生抑制作用；(g)DNase抑制劑敏感性G-actin(球狀肌動蛋白)不抑制核酸酶活性。金4青三羧酸(Aurintricarboxylicacid,ATA)卞卩制4亥酸酶活性。檸檬酸抑制核酸酶活性。碘代醋酸(Iodoacetate)抑制核酸酶活性。硫酸根離子(S042—)抑制核酸酶活性。精胺輕微抑制核酸酶活性。Ca2+、Mg2+、Mn2+、或Zn2+高濃度(10mmol/L)時抑制核酸酶活性。(3-丁內酯不抑制核酸酶活性。1,3-二氧化丁二烯不抑制核酸酶活性。從來源於人的胃癌培養細胞MKN-28獲得本發明的MKN-28DNase時，例如可按照後面實施例1和實施例6(9)中描述的程序獲得。即，本發明的MKN-28DNase可通過含有以下步驟的製備方法進行製備(1)向MKN-28細胞破碎液中添加硫酸鎂及ATP後，離心，獲得上清；(2)用70%硫酸銨對所得上清進行鹽析，離心，獲得上清；(3)通過凝膠過濾色譜，從所得上清中獲得分子量48~43kDa的級分。步驟(3)，例如，按照後面實施例2的程序，應用SephacrylS-300HR，以DNase活性為指標獲得目的級分。另外，對所得級分進行進一步純化，例如，按照實施例3的程序，應用離子交換色譜，以DNase活性為指標進行純化。本發明的MKN-28DNase作為本發明的抗腫瘤試劑的有效成分應用時，既可應用純化的DNase,也可應用其純化過程中的^f且品DNase(例如，上述步驟1或2中所得離心上清，或者步驟3中所得的級分)。本發明的HeLaDNase，例如可從來源於人的子宮頸癌培養細胞HeLa(RCB0007,理化學研究所，或ATCCCCL-2，ATCC(AmericanTypeCultureCollection))中獲得，它具有以下性質(a)作用及底物特異性具有核酸內切酶活性；(b)分子量63kDa(凝膠過濾色譜)；(c)最適pH:3.0-4.5;(d)熱穩定性IO(TC加熱IO分鐘，核酸內切酶活性失活；(e)對蛋白酶K處理的敏感性37C反應15分鐘，核酸內切酶活性不失活；(f)2價陽離子要求性Ca2+、Mg2+、Mn2+及Zn2+不要求。高濃度(lOmmol/L)時，Ca^或Mg2+產生抑制作用；(g)DNase抑制劑敏感性G-actin(Globularactin)不抑制核酸酶活性。金精三羧酸不抑制核酸酶活性。檸檬酸不抑制核酸酶活性。硤代醋酸抑制核酸酶活性。硫酸根離子(S042—)抑制核酸酶活性。精胺不抑制核酸酶活性。Zn^不抑制核酸酶活性。|3-丁內酯不抑制核酸酶活性。1,3-二氧化丁二烯不抑制核酸酶活性。從來源於人的子宮頸癌培養細胞HeLa獲得本發明的HeLaDNase時，例如可按照後面實施例1和實施例6(9)中描述的程序獲得。即，本發明的HeLaDNase可通過含有以下步驟的製備方法進行製備(1)向HeLa細胞破碎液中添加硫酸鎂及ATP後，離心，獲得上清；(2)用70%硫酸銨對所得上清進行鹽析，離心，獲得上清；(3)通過凝膠過濾色譜，從所得上清中獲得分子量63kDa的級分。步驟(3),例如，按照後面實施例2的程序，應用SephacrylS-300HR,以DNase活性為指標獲得目的級分。另外，對所得級分進行進一步純化，例如，按照實施例3的程序，應用離子交換色譜，以DNase活性為指標進行純化。本發明的HeLaDNase作為本發明的抗胂瘤試劑的有效成分應用時，既可應用純化的DNase，也可應用其純化過程中的粗品DNase(例如，上述步驟1或2中所得離心上清，或者步驟3中所得的級分)。本發明的DNase對癌培養細胞(例如，MKN-28細胞或HeLa細胞)顯示細胞增殖抑制效果，而對正常細胞(例如。人胎肺成纖維細胞MRC-5,或人胎兒成纖維細胞HEF)無細胞增殖抑制效果。因此，本發明的DNase作為抗腫瘤試劑的有效成分有用。本發明的MKN-28DNase及HeLaDNase，以及/>知的DNaseII和DNaseI的各性質示於表2和表3。[表2]tableseeoriginaldocumentpage13a):除DNaseI,均通過凝膠過濾色譜獲得。已知DNaseI有A、B、C、D4種分子量。[表3]tableseeoriginaldocumentpage14二彿實施例以下，通過實施例對本發明進行具體說明，但本發明的範圍並不限定於此。《實施例1:各種癌培養細胞的細胞提取液的製備》本實施例中，按照以下所示程序，分別從來源於人的胃癌培養細胞MKN-28(RCBIOOO，理化學研究所)及來源於人的子宮頸癌培養細胞HeLa(RCB0007,理化學研究所，或ATCCCCL-2,ATCC)製備細胞提取液，再進行分級。另外，為了進行比較，用人胎兒肺成纖維細胞MRC-5(RCB0211,理化學研究所，或ATCCCCL171,ATCC),進行同樣操作。具體而言，用DMEM培養基作為培養液培養各種培養細胞，應用培養3天形成單層的細胞，進行以下操作。用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌細胞後，用細胞刮收集細胞，用PBS離心(1200rpm，5分鐘)洗滌3次。將收集的各細胞懸浮到PBS5mL中，使總細胞數為8x107個(MKN-28細胞)和1x108個(HeLa細胞)。用超聲波破碎儀[UH-50型，(抹)MST制]將各細胞懸液在冰浴中處理5分鐘(20kHz，50W),使細胞破碎。接著，添加硫酸鎂(MgS04)和ATP,使其終濃度分別達2mg/mL和10mg/mL，37。C》文置過夜(22小時)。3000rpm4。C離心30分鐘後，回收上清，用70。/。硫酸銨[(NH4)2S04]進行鹽析(每10mL添加4.72g硫酸銨粉。4t:鹽析1小時後，1500rpm4。C離心15分鐘，將上清與沉澱物分開。將所得上清、溶到PBS中的沉澱物，分別邊攪拌邊在PBS中進行透析，4。C透析18小時(其間更換PBS4次)。將透析後的各溶液傾到冷管中，-2(TC保存。以上操作，儘可能的進行無菌操作。-2CTC保存的各樣品在以下操作中使用時，4。C10000rpm離心30分鐘，使用其上清。以下，將鹽析後的離心上清溶解到PBS中後的透析後溶液簡單的稱為"離心上清"，將鹽析後的離心沉澱物溶解到PBS中後的透析後溶液簡單的稱為"離心沉澱"。《實施例2:應用凝膠色譜(SephacrylS-300HR)對培養細胞來源的離心上清的DNase活性(+)級分進行分級》在以下條件下對實施例1中所得MKN-28細胞來源的離心上清進行分級凝膠使用SephacrylS-300HR(球形蛋白質的分級範圍=1x104~1.5xl06,Amersham，17-0599-01)。總凝膠床體積(TotalGelBed)為114.8mL[=(0.75cm)2x3.14x65cm].4主<吏用1.5cm(直徑)x75cm(高)的#主(Econo—Column,Bio-Rad)。緩衝液PBS(pH7.2)流速0.4mL/min分部2mL/管從所得各分部中選擇DNase活性(+)的級分，再檢測該級分的入DNA消化能力(Titer)。具體而言，使用各級分的原液，檢測出哪一部分有DNase活性後，對活性陽性的級分，進行XDNA消化能力的滴定。DNase活性及其滴定，以XDNA消化能力為指標，通過電泳進行確認。特別是，滴定時，將各級分進行4個階段的稀釋，根據XDNA分解反應物的泳動模式(人DNA分解的強弱)確定其滴度。結果如表4所示。DNase活性的峰以No.40為中心，在No.39~No.42中。人DNA分解能力的峰值在No.40,其滴度為80倍。因此，應用No.39-No.42(4分部)，通過離子交換色譜進行下面的純化。[表4]級分No.3839404142434445464748滴度_2040(80)80(160)4040404020105<5《實施例3:應用離子交換色譜進行MKN-28DNase的純化》通過離子交換色譜對實施例2中所得的DNase活性(+)級分進行進一步純化，色譜中應用Econo-PacHighQ柱(St訓ganion,732-0094,BIO-RAD)。具體而言，由於實施例2中所得DNase活性(+)級分(No.39~No.42級分的混合物)是以PBS作緩衝液的，所以要通過透析置換成HighQ用緩衝液，然後用0.45|iim的濾膜進行過濾。確認該操作後的樣品具有DNase活性後，上Econo-PacHighQ柱柱。使用含0.02~0.3mol/L-NaCl的50mmol/L-Tris-HCl(pH7.5)作洗脫緩沖液，用NaCl的濃度梯度進行洗脫。流速為1.5mL/2min/級分。以入DNA分解能力為指標，通過電泳確認哪個級分中具有DNase活性。DNase活性測定時，使用級分原液(未稀釋)。檢測各級分的XDNA分解能力後，進行DNase活性(+)級分的滴定，求出DNase活性的峰。結果如表5所示。DNase活性的峰值在級分No.5(NaCl濃度=0.08mol/L)和No.6(NaCl濃度=0.10)中。[表5]級分No._1234567891011NaCl(mol/L)0.010.020.040.060.080.100.120.140.160.180.201DNA分解一±++++++++++++'一±—一《實施例4:各種培養細胞來源的各級分細胞增殖抑制效果的分析》本實施例中，用MTT法評價實施例1中製備的各種癌培養細胞和正常細胞來源的離心上清和離心沉澱的細胞增殖抑制效果。具體而言，作為評價用的培養細胞，使用MKN-28細胞和HeLa細胞作為癌培養細胞，使用MRC-5細胞作為正常細胞。將評價用的各培養細胞培養3天後，用胰蛋白酶分散細胞，用PBS離心洗滌細胞。用含8%胎牛血清的DMEM培養基(以下叫做GM)製備細胞懸液後，用血球計數板對細胞進行計數，用GM將細胞數調整為5000個/50pL和2500個/50iuL(MRC-5細胞，10000個/50iuL和5000個/50iuL)。將實施例1中製備的離心上清或離心沉澱的稀釋系列(原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋)加到96孔平底培養板中，50pL/孔，然後添加調整好的細胞懸液50pL/孔，C02孵箱中37。C培養。培養第3天或第4天，添加MTT溶液，20pL/孔，37。C培養3小時。除去各孔中的培養上清後，向各孔添加100pL的MTTformazan洗脫液，室溫振蕩5分鐘，用酶標^義在540nm和690nm雙波長測定OD值，算出IC50。應用PBS代替離心上清和離心沉澱的稀釋序列作為對照。另外，為了進行比較，使用5-氟尿嘧啶(5-FU)的5倍梯度稀釋液(100pg/ml，20pg/ml，4|iig/ml，0.8|ug/ml，0.16)ug/ml,0.032pg/ml)代替離心上清和離心沉澱的稀萍,序列。使用癌培養細胞MKN-28細胞作為評價細胞，使用MKN-28細胞來源的離心上清或離心沉澱作為細胞級分時的ICso值示於表6。使用PBS作為對照時，使用5-FU用於比較時結果以一併列出。表6(以及後面的表7~10)中IC5o的值是多次(2次4次)的平均值。ICso值是對對照細胞(未添加抗肺瘤劑)的增殖抑制達50%時的試驗液的稀釋倍數，也就是說，是相對值。或是藥劑濃度(5-FU時，pg/ml)。正如表6所示，MKN-28細胞來源的離心上清或離心沉澱均對MKN-28細胞顯示細胞增殖抑制效果。[表6]tableseeoriginaldocumentpage17使用癌培養細胞HeLa細胞作為評價細胞，使用HeLa細胞來源的離心上清或離心沉澱作為細胞級分時的IC5o值示於表7。如表7所示，HeLa細胞來源的離心上清或離心沉澱均對HeLa細胞顯示細胞增殖抑制效果。[表7]tableseeoriginaldocumentpage18</table使用正常細胞MRC-5細胞作為評價細胞，使用MRC-5細胞來源的離心上清或離心沉澱作為細胞級分時的ICso值示於表8。如表8所示，MRC-5細胞來源的離心上清或離心沉澱均對MRC-5細胞無細胞增殖抑制效果。[表8]tableseeoriginaldocumentpage18使用3種類型的細胞作為評價用細胞，使用各細胞來源的離心上清作為細胞級分時的ICso值示於表9(培養3天時)和表10(培養4天時)。如表9和表10中所示，任何一種細胞來源的離心上清對癌培養細胞MKN-28細胞和HeLa細胞均顯示增殖抑制效果，但對正常細胞MRC-5細胞無增殖抑制效果。對細胞來源的離心上清的敏感性是MKN-28糹田月包〉HeLa細胞〉MRC-5糹田月包。另夕卜，如後面的實施例6中所示，MKN-28細胞和HeLa細胞的離心上清剪切DNA,所以是核酸酶。[表9][培養&天}tableseeoriginaldocumentpage19[表io][培養4天]tableseeoriginaldocumentpage19《實施例5:RNase處理、DNase處理或加熱處理對MKN-28或HeLa細胞來源的各離心上清對MKN-28細胞增殖抑制活性的影響》為了研究實施例1中製備的癌培養細胞MKN-28和HeLa細胞來源的各離心上清的性狀，本實施例中觀察RNase處理、DNase處理或加熱處理之後對癌培養細胞MKN-28的細胞增殖抑制活性。細胞增殖抑制活性按照實施例4中描述的方法進行測定。結果(IC5)值示於表11。表11中的符合[-]表示未進行測定。RNase處理(表11中的符合[RN])的實施是用10|ug的RNase(R5125,TypeIIIA，SIGMA)對lOO^L的細胞提取物，37。C處理1小時。DNase處理(表11中的符合[DN])的實施是用134單位的DNase(Lotl860k，NipponGene)對100|liL的細胞提取物，37。C處理l小時。作為RNase處理和DNase處理的對照，37。C處理1小時(表11中的符合[37。C])。為了檢驗RNase和DNase自身的細胞增殖抑制活性，實施[RNase+PBS]處理(表11中的符合[RN-Cont])和[DNase+PBS]處理(表11中的符合[DN-Cont])。加熱處理的實施是56。C加熱處理30分鐘(表11中的符合[56。C])。用PBS處理作為對照(表ll中的符合[PBS])。如表11所示，RNase處理和DNase處理沒有使癌培養細胞來源的離心上清的細胞增殖抑制活性失活(具體的數據未顯示，用RNaseH處理也未失活)，56。C30分鐘的加熱處理也未失活。這些結果表明，癌培養細胞來源的離心上清中顯示細胞增殖抑制活性的因子(1)不是核酸，(2)加熱後不失活。如實施例6中所示的，其活性受反應緩衝液的影響。[表11]_tableseeoriginaldocumentpage20《實施例6:癌培養細胞來源的離心上清性狀的分析》(1)針對入DNA和MKN-28細胞基因組DNA的核酸酶活性本實施例與施例1中製備的癌培養細胞MKN-28和HeLa細胞來源的各離心上清相關，探討其DNA分解能力。由於各離心上清中含PBS,所以預先置換成TE緩衝液(lOmmol/L-Tns-HCl,lmmol/L-EDTA,pH8.0)使用。使用XDNA(48502bpTakara)和用市售的i式劑盒(GenomicPrep.TMcellsandTissueDNAIsolationKit,Amershampharmaciabiotech.)從MKN-28細胞提取的的MKN-28細胞基因組DNA作為分解對象。緩沖液使用L(Low)緩衝液(未添加NaCl)、M(Medium)緩衝液(50mmol/LNaCl)和H(High)緩衝液(100mmol/LNaCl)。各緩衝液是在基本組成(lOmmol/L-Tns-HCl(pH7.5),lOmmol/L_MgCl2,lmmol/L-DTT(二硫蘇糖醇))的基礎上添加規定量的NaCl。37。C反應1小時，反應終止後，通過電泳7見察DNA的分解情況。MKN-28細胞來源的離心上清在L或M緩衝液中可分解任一種DNA(即ADNA和MKN-28細胞基因組DNA),在H緩衝液中不能分解任何DNA。HeLa細胞來源的離心上清在L、M或H緩沖液所有緩衝液中均不能分解任何DNA(即XDNA和MKN-28細胞基因組DNA)。(2)最適緩衝液應用上面(1)中使用的反應緩衝液以外的緩衝液，A緩衝液[50mmol/L隱Mes緩沖液(pH5.8),lmmol/L-CaCl2,3mmol/L-MgCl2]和B[50mmol/L-Mops緩衝液(pH7.0),lmmol/L-CaCl2,3mmol/L-MgCl2]緩衝液，重複上面(1)中的操作。HeLa細胞來源的離心上清在A緩衝液中可分解任一種DNA(即入DNA和MKN-28細胞基因組DNA),在B緩衝液中不能分解任何DNA。MKN-28細胞來源的離心上清中的核酸酶活性在A緩衝液中顯著，在B緩衝液中對XDNA僅少量分解。(3)對加熱處理的耐受對各種離心上清100。C加熱處理IO分鐘後，檢測其核酸酶活性。MKN-28細胞來源的離心上清即使在加熱處理後，在L或M緩衝液中仍可分解XDNA或MKN-28細胞基因組DNA中的任一種DNA。也就是說，不因加熱處理而失活。HeLa細胞來源的離心上清，在A緩衝液中未進行加熱處理時可分解入DNA,但在加熱處理時不能分解XDNA。也就是說，因加熱處理而失活。(4)對蛋白酶K處理的耐性對各種離心上清，蛋白酶K處理(37°C15分鐘)後，檢測其核酸酶活性。MKN-28細胞來源的離心上清，在M緩衝液中蛋白酶K未處理時能分解入DNA,但在蛋白酶K處理時不能分解人DNA。也就是說，因蛋白酶K處理而失活。HeLa細胞來源的離心上清，即使在蛋白酶K處理後，在A緩沖液中仍能分解XDNA。也就是說，未因蛋白酶K處理而失活。表12中顯示了(1)~(4)的結果。[表12]tableseeoriginaldocumentpage22以人DNA的分解能力為指標檢測各離心上清的核酸酶活性。XDNA的分解反應是在添加lmmol/L-DTT的50mmol/L各種緩衝液[醋酸-HCl(pH1.0畫5.5),MOPS-NaOH(pH6.0-7.0),Tris-HCl(pH7.5-8.5),pH從1.08.5,每增加0.5]反應液中，37。C進行30分鐘，然後通過電泳進行確認。任何一種離心上清(即，MKN-28細胞來源的離心上清及HeLa細胞來源的離心上清)在pH5.4以下均能完全分解XDNA。當不加離心上清，進行同樣操作時，pH2.5以下人DNA可分解。因此，個離心上清的最適pH為3.04.5。(6)2價陽離子的要求性以XDNA的分解能力為指標檢測各離心上清的2價陽離子(Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+)的要求性。預先用PBS(無Ca2+,Mg2+)對各種離心上清進行透析，然後測定效價，確定其最佳稀釋濃度。MKN-28細胞來源的離心上清及HeLa細胞來源的離心上清的最佳稀釋濃度分別是5倍稀釋和3倍稀釋。分別應用添加了3mmol/L-MgCl2的醋酸-HCl緩衝液檢測的Ca2+要求性，應用添加了3mmol/L-CaCl2的醋酸-HC1緩沖液檢測的Mg2+要求性，應用醋酸-HC1緩衝液(無Ca2+,Mg2+)檢測的Mn2+或Zn2+的要求性。各緩沖液的pH是，MKN-28細胞來源的離心上清pH4.5，HeLa細胞來源的離心上清pH4.0。與MKN-28細胞來源的離心上清相關的結果示於表13,與HeLa細胞來源的離心上清相關的結果示於表14。表13中[+]數越多對人DNA的分解程度越高，[-]表示未進行檢測。此外，表中未顯示的，Ca2+，Mg2+不存在下是[+++],僅緩沖液時為[-](未分解)。如表13所示，MKN-28細胞來源的離心上清(5倍稀釋)，對Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zi^+任何2價陽離子均無要求(依賴)性，高濃度(10mmol/L)下，Ca2+，Mg2+，或Zn2+有抑制作用。為了在高敏感度檢測MKN-28細胞來源的離心上清對2價陽離子的要求性，應用40倍的稀釋物(入DNA分解檢測極限濃度)進行同樣的實驗，結果發現，對Ca^，Mg^無要求(依賴)性，對Mi^+稍有依賴性(0.01~1.0mmol/L)，對Zn2+稍有依賴性(0.01-0.1mmol/L)，高濃度(10mmol/L)時，Ca2+,Mg2+，Mn2+,或Zn2+有抑制作用。如表14所示，HeLa細胞來源的離心上清(3倍稀釋)，對Ca2、Mg2+，Mn2+，Zn^任何2價陽離子均無要求(依賴)性，高濃度(10mmol/L)下，Ca2+，Mg2+有抑制作用。應用20倍稀釋的HeLa細胞來源的離心上清(XDNA分解檢測極限濃度)進行同樣的實驗，結果發現，Ca2+,Mg2+,Mn2+,Zn2+任何2價陽離子均無要求(依賴)性，高濃度(lOmmol/L)時，Ca2+,Mg2+，Mn2+，或Zn2+有抑制作用。[表13]tableseeoriginaldocumentpage23a)對DNase抑制劑的敏感性以入DNA的分解能力為指標檢測各離心上清對各種抑制劑的敏感性。使用5倍稀釋的MKN-28細胞來源的離心上清，在各種抑制劑存在下，pIW.5、"。C孵育30分鐘後，通過電泳進行判定。使用3倍稀釋的HeLa細胞來源的離心上清，在各種抑制劑存在下，pH4.0、3TC孵育30分鐘後，通過電泳進行判定。表15和表16中顯示了各種抑制劑是否抑制XDNA的分解。表15中，(G)表示G-肌動蛋白(Globularactin，來源於牛肌肉，Sigma),其下的數值(l,10,100)表示G-肌動蛋白的濃度Ug/mL)。(A)表示ATA金精三羧酸(Aurintricarboxylicacid,Wako),其下的數值(1，10，100)表示ATA的濃度(pmol/L)。(c)表示檸檬酸(杵檬酸鈉,Wako),(I)表示石典代醋酸(Iodoacetate,Nakami),(SO)表示SO/—(MgS04,Wako),011)表示2112+(ZnCl2,Wako),(S)表示精胺(Wako)。表16中，(B)表示p-丁內酯(東京化成工業)，其下的數值(O.l,1.0，10)表示p-丁內酯的濃度(mmol/L)。(BD)表示1,3-二氧化丁二烯(東京化成工業)，其下的數值(O.l，1.0,10)表示1，3-二氧化丁二烯的濃度(mmol/L)。另夕卜，[+]數越多抑制人DNA分解的活性越高，[-]表示無抑制XDNA分解的活性，[士]表示有弱的抑制。[表15]tableseeoriginaldocumentpage24以有無對環狀雙《連DNA(質粒pACYC184,NipponGene,13-0220)的剪切為指標，檢測各離心上清時核酸內切酶還是核酸外切酶。MKN-28細胞來源的離心上清和HeLa細胞來源的離心上清均能酶切質粒pACYC184,因此是核酸內切酶。c)分子量(通過凝膠過濾色譜確定)通過凝膠過濾色譜對各離心上清進行分部，純化本發明的DNase的同時確定其分子量。條件如下柱使用1.5cm(直徑)x75cm(高)的柱子(Econo-Column,Bio-Rad)。凝膠SephacrylS-300HR(球形蛋白質的分級範圍=1x104~5x106,Amersham)。總月交體積(TotalGelBed)是114.8mL[=(0.75cm)2x3.14x65cm].緩沖液PBS(pH7.2)。流速0.4mL/min分部2mL/管分子量計算使用市售的試劑盒(GelFiltrationCalibrationKits,AmershamBioscience)。用白蛋白(分子量67000)、卵清蛋白(分子量43000)和糜蛋白酶原(分子量25000)作為分子量標誌物。分離完成後，以XDNA分解能力為指標，測定各級分的效價，確定包含本發明DNase的峰。用MKN-28細胞來源的離心上清時，No.25和No.26為峰部，其分子量為48~43kDa。用HeLa細胞來源的離心上清時，No.25為峰部，其分子量為63kDa。《實施例7:有關含有MKN-28細胞來源的離心上清的脂質體製劑的評價MKN-28細胞增殖抑制效果，脂質體的細胞毒性、反應緩衝液及其pH》如實施例6所示，MKN-28細胞來源的離心上清是DNase。以人DNA分解為指標，用電泳法確定的MKN-28細胞來源的離心上清(MKN-28DNase)的最適pH是酸性(pH3.0~4.5)的(前述)。應用不影響培養細胞增殖的許可範圍內的酸性緩衝液製備含MKN-28DNase的脂質體製劑，檢驗其細胞增殖抑制效果。脂質體的製作是磷脂醯膽鹼(L-a-phosphatidylcholine,來源於卵黃，Nakami)、聯十六烷基磷酸鹽(dicetylphosphate,Sigma)和膽固醇(ICNBiochemicalInc.)以7:2:1(摩爾比)的比例混和，蒸發掉氯仿。具體的講，首先，將70)iimol磷脂醯膽鹼、20^imol聯十六烷基磷酸鹽和10|umol膽固醇溶解到lmL氯仿中，(7:2:1,100)iimol/mL)。用氯仿16倍稀釋(6.25pmol/mL)後，分裝到樣品瓶中，各50^1(0.3125pmol/瓶)。接著，邊轉動樣品瓶邊衝入氮氣，使氯仿蒸發掉後，減壓，再度使氯仿蒸發，製備成脂質體單詞。該培養瓶中加入了500vil溶解了DNase的緩沖液(或只有緩衝液)(0.3125|umol/500|Lil=0.625)umol/mL)。考慮到等張性，使用PBS作為與DNase—起封入到脂質體的反應緩沖液。通過改變PBS中KH2P04與Na2HP〇4的混和比率，可很容易的配成pH6.0和pH7.2的各種緩沖液。檢測作為反應緩衝液PBS是否合適，檢測因PBS的pH之差會給細胞增殖抑制效果帶來什麼影響。應用濃縮用濾膜(Amicon),濃縮MKN-28細胞來源的離心上清(MKN-28DNase),置換成pH6.0和pH7.2的PBS。向先前製備的脂質體單詞樣品瓶中加入500)ulPBS(pH6.0或pH7.2)或含MKN-28DNase的PBS(pH6.0或pH7.2)，渦動(vortex)攪拌後，加入熱變性的人IgG(終濃度=150pg/mL),37。C孵育30分鐘，製備成含有熱變性IgG包被(coated)(Agg-IgGcoated)MKN-28DNase的脂質體製劑(pH6.0或pH7.2)。所謂熱變性人IgG是指將15mg人IgG(人IgGPurified,SigmaChemicalCo.)溶解到lmLRinger液中後，60。C力口熱10分鐘。用MTT法評價含有熱變性IgG包被(Agg-IgGcoated)MKN-28DNase的脂質體製劑(pH6.0)及相同製劑(pH7.2)對MKN-28細胞和正常細胞人胚成纖維細胞HEF(J.Infect.Dis,163,270-275,1991)的增殖抑制效果。首先，向96孔微量培養板中加入用GM製備的含有熱變性IgG包被(Agg-IgGcoated)MKN-28DNase的脂質體製劑的稀釋系列(原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋)，50^1/孔。接著，添加調整成5000細胞/S0iul的MKN028細胞懸液和HEF細胞懸液，每孔50|iil,不換培養液，一直在37。C的C02培養箱中培養，培養4天後，用MTT法算出IC50值。用熱變性IgG包被脂質體(無MKN-28DNase)的2倍稀釋液、僅MKN-28DNase(無熱變性IgG包被)的2倍稀釋液、和緩沖液(PBS，pH6.0或pH7.2)作為對照代替含有熱變性IgG包被(Agg-IgGcoated)MKN-28DNase的脂質體製劑的2倍稀釋液，進行同樣的操作。結果如表17和18所示。表17和18中，[LP-DN]、[LP(無DN)]、[DN(無LP)]、[僅PBS]分別表示含有熱變性IgG包被MKN-28DNase的脂質體、熱變性IgG包被脂質體(無MKN-28DNase)、僅MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)和僅PBS(緩衝液)。表17和18中所示IC5o值是24次實驗的平均值。表17中顯示對癌培養細胞MKN-28的增殖抑制效果，表18中表示對正常細胞人胚成纖維細胞HEF的增殖抑制效果。[表17]tableseeoriginaldocumentpage27[表18]tableseeoriginaldocumentpage27對於MKN-28細胞的ICsQ值，用PBS(pH6.0)製備的含有熱變性IgG包被MKN-28DNase的脂質體[LP-DN]是24.5，而熱變性IgG包被脂質體(無MKN-28DNase)[LP(無DN)]是4.3,僅MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)[DN(無LP)]是15.0，僅PBS(緩沖液)[僅PBS]是2.7。另夕卜，用PBS(pH7.2)製備的含有熱變性IgG包被MKN-28DNase的脂質體是26.0,而熱變性IgG包被脂質體(無MKN-28DNase)是3.5,僅MKN_28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)是15.0，僅PBS(緩衝液)是2.5。另一方面，對於HEF細胞的ICsQ值，用PBS(pH6.0)製備的含有熱變性IgG包被MKN-28DNase的脂質體是4.0，而熱變性IgG包被脂質體(無MKN-28DNase)是3.5，僅MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)<2..0,僅PBS(緩衝液)<2.0。另夕卜，用PBS(pH7.2)製備的含有熱變性IgG包被MKN-28DNase的脂質體是3.8，而熱變性IgG包被脂質體(無MKN-28DNase)是3.2,僅MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)<2.0,僅PBS(緩衝液)<2.0。使用PBS作為反應緩衝液時，對於MKN-28細胞，pH6.0時IC50值是2.7，pH7.2時IC5o值是2.5。對於HEF細胞，pH6.0時IC50值<2.0，pH7.2時IC5o值〈2.0。該結果表明，PBS對細胞無毒性，作為反應緩衝液很好，另外，在pH6.0和7.2時，其IC5Q值幾乎無差異。此外，脂質體(無DNase),對於MKN-28細胞，pH6.0時IC50值是4.3，pH7.2時ICsQ值是3.5。對於HEF細胞，pH6.0時ICs"直是3.5,pH7.2時ICso值是3.2。脂質體的濃度在0.5pmol/L以下，所以，脂質體濃度在0.5)imol/L以下時對細胞無毒性。此外，DNase(無脂質體)，對於MKN-28細胞，pH6.0時IC50值是15.0,pH7.2時ICs"直是15.0。對於HEF細胞，pH6.0時IC5"iDNase(無脂質體)，將DNase封入脂質體是有效的。如上所述，本發明有效成分之一的上述離心上清，適用於抗腫瘤劑的應用。而且，與脂質體的複合體用於抗腫瘤劑的應用非常有效。《實施例8:細胞分裂與細胞增殖抑制效果間的關係》當DNase作用於癌細胞的DNA時，DNase與癌細胞的DNA的直接接觸是必要的。細胞質內的DNase與DNA接觸時，由於核膜的存在而抑制了二者的接觸。核膜不存在的情況只出現在細胞分裂期(M期)。為了檢測高效的DNase的細胞增殖抑制活性效果，從各種培養細胞製備M期細胞，觀察含有DNase的脂質體對M期細胞的抑制效果。使用合成的秋水仙鹼秋水仙醯胺製備M期細胞(J.Radiat.Res.,14,258-270,1971),探討收集M期活細胞的最適條件，以及用MTT法評價細胞增殖抑制效果的條件。具體的講，用25cm2培養瓶(Falcon，3014,50mL)培養細胞，培養3天(形成單層)，洗滌後，換成含有0.25pg/mL秋水仙醯胺(Nakami,09356-74)的增殖培養基，37。C培養6小時。輕輕洗滌細胞後，輕輕振蕩(gentleshaking)培養瓶，收集脫落的細胞。用培養基(GM)離心洗滌收集的細胞，除去秋水仙醯胺後，懸浮到增殖培養基中，開始培養。用顯微鏡適時觀察分裂期細胞的出現，結果示於表19。分裂期細胞的出現以球狀細胞(roundcell)的出現為指標。即，大多數培養細胞接觸到培養瓶表面，薄薄的鋪展，但細胞一旦進入分裂期就變成球形，很容易從培養瓶表面漂浮起來，所以以變成球形從單詞脫落細胞的出現為指標。表19中，[-]表示球形細胞的出現佔總細胞的0%，[士]表示球形細胞的出現不到5%，[+]表示球形細胞的出現在5%以上但不到30%。此外，[球狀細胞數/培養瓶]欄的括號內的數字是胎盤蘭染色陽性細胞數。[表19]_5泉形細胞出現_5求形細胞數/並瓦細胞lhr2hr3hr4hr5hr____MKN—28—±+++9.3萬(0)MRC-5—±+++15.3萬;0)__秋水仙醯胺處理細胞的回收率(處理後回收細胞數/處理前細胞數)，MKN-28細胞為1.4%(9.3萬/630萬)，MRC-5細胞是29%(15.3萬/52.3萬)。接下來，將經過0.25)ig/mL秋水仙醯胺、37。C培養6小時的處理所得的細胞接種到96孔板中，檢測分裂期細胞的增殖能力。具體而言，對於MKN-28細胞，每孔的細胞數為9300、4650、2325和1162個，37。C培養5天進行觀察，結果表明，9300細月包/孑L或比它稍多的糹田月包悽t更適於MTT法(增殖能力稍低下)。對於MRC-5細胞，每孔接種15300、7650、3825、和1912個細胞，未形成成纖維細胞所特有的單層(細胞雖然增殖，但雜亂)，但7650或3825個細胞/孔可在MTT法中應用。總結上述的結果，雖然目前MTT法主要按5000個細胞/孔，37X:培養4天的條件實施，但我們認為，對於經秋水仙醯胺處理所得的分裂期細胞，MKN-28細胞10000個細胞/孔，MRC-5細胞8000個細胞/孔更適於MTT法。MKN-28細胞與通常的培養細胞(即秋水仙醯胺非處理)的增殖能力相比，其增殖能力低下，培養到第3~4天可見到死細胞。此外，MRC-5細胞不僅增殖能力低下，而且細胞增殖活性紊亂，不能形成完整的單層。以下的實驗中，在上述條件下進行MTT檢測。《實施例9:含有MKN-28細胞來源的純化DNase的脂質體製劑對各種細胞的增殖抑制效果的評價》本實施例中，按照實施例2中的程序，用SephacrylS-300HR對實施例1中製備的各種癌細胞和正常細胞來源的離心上清進行純化，再按照實施例3的程序用離子交換色i普進行純化，應用所得MKN-28細胞來源的純化DNase製備脂質體製劑，評價其MKN-28細胞增殖抑制效果。具體的講，4吏用實施例3中所得DNase活性的峰部，即No.5[50mmol/L-Tris-HCl(pH7.5)+0.08mol/L-NaCl]和No.6[50mmol/L-Tris-HCl(pH7.5)+0.10mol/L-NaCl]]分部作為MKN-28細胞來源的純化DNase。按照實施例中描述的程序製備脂質體。但，實施例7中使用實施例1中所得的離心上清作為DNase,而本實施例中使用實施例3中所得純化的DNase。另外，實施例7中使用PBS作為反應緩衝液，而本實施例中使用50mmol/L-Tris-HCl(pH7.5)+0.08mol/L-NaCl。MTT法也與實施例7同樣進行。所得含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體製劑(懸浮液)中所含純化MKN-28DNase的量為17單位/100pL。1單位是將l昭XDNA37。C處理1小時能完全將之分解的DNase量。脂質體製劑中的DNase量是，將100|liL脂質體製劑離心除去其上清後，添加IOO)liL含0.2%TritonX-100的PBS溶液，溶解脂質體，通過評價該狀態下其XDNA水解能力而確定出的。先前驗證了TritonX-100對DNase活性無影響。本實施例中，用細胞懸浮(cell-suspension)法及單層法評價純化的MKN-28DNase對MKN-28細胞和MRC-5細胞的增殖抑制活性。細胞懸浮法中，首先將用GM配備的含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的稀釋系列(原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋)分為50pL/孔，然後添加調整為5000個細胞/50iuL的MKN-28細胞懸液或MRC-5細胞懸液，50pL/孔，C02孵箱中37。C培養。培養4天後，用MTT法算出IC50。此外，用熱變性IgG包被脂質體(無純化的MKN-28DNase)的2倍稀釋液、純化MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)的2倍稀釋液、或反應緩衝液作為對照代替含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的2倍稀釋液，進行同樣的操作。單層法中，將調整為5000個細胞/100iuL的MKN-28細胞或MRC-5細胞加到96孔孩i量培養板中，100^iL/孔，37。C培養。培養20小時後，向除去了培養液的孔中添加用GM配備的含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的稀釋系列(原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋)，100pL/孔，37。C培養。培養4天後，用MTT法算出IC50。此外，用熱變性IgG包被脂質體(無純化的MKN-28DNase)的2倍稀釋液、純化MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)的2倍稀釋液、或反應緩沖液(含有0.8mol/L-NaCl的0.5mmol/L-Tris-HCl,pH7.5)作為對照代替含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的2倍稀釋液，進行同樣的操作。結果如表20所示。[表20]tableseeoriginaldocumentpage31如表20中所示，對於MKN-28細胞來講，細胞懸浮法中，含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的[LP-DN]的1(:5值是5.3，熱變性IgG包被脂質體(無純化的MKN-28DNase)[LP(無DN)]的IC50值是2.7,純化MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)[DN(無LP)]的IC5o值是2.7,僅反應緩衝液時IC5o值是2.8。很明顯，含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體對MKN-28細胞有增殖抑制效果。另一方面，在單層法中，未看到增殖抑制效果。與此相對，對於正常細胞MRC-5細胞，無論是細胞懸浮法還是單層法其IC5。值均<2.0,未看到增殖抑制效果。月旨質體濃度在0.5|iimol/L以下，如前所述，在O.5|umol/L以下幾乎無細胞毒性，所以考慮與脂質體的濃度無關。《實施例10:含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體對M期細胞的增殖抑制效果》為了提高細胞增殖抑制效果，將細胞調整到分裂期，因為這時候核膜消失，DNase更容易與DNA相接觸。也就是說，如實施例8所示，用合成的秋水仙石鹹秋水仙醯胺處理細胞。具體的講，將培養3天的MKN-28細胞或MRC-5細胞換成含0.25|iig/mL秋水仙醯胺的增殖培養基，37。C培養6小時。輕輕振蕩，收集脫落的細胞，用不含秋水仙醯胺的增殖培養基洗滌後，將用GM配備的含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的稀釋系列(原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀釋)加到96孔微量培養板中，50|uL/孔。接下來，向各孔中添加調整為10000個細胞/50iuL的MKN-28(M期)細胞懸液，或者添加調整為8000個細胞/50iuL的MRC-5(M期)細胞懸液，50pL/孔，37。C培養。培養4天後，用MTT法算出IC5Q。另外，用熱變性IgG包被脂質體(無純化的MKN-28DNase)的2倍稀釋液、純化MKN-28DNase(無熱變性IgG包被脂質體)的2倍稀釋液、或反應緩衝液作為對照代替含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的2倍稀釋液，進行同樣的操作。結果如表21所示，對於經秋水仙醯胺處理的MKN-28細胞來講，含有熱變性IgG包被純化MKN-28DNase的脂質體的[LP-DN]的1。50值是9.3，可觀察到其細胞增殖抑制效果。與此相對，對正常細胞MRC-5細胞而言，IC5"i<2.0，未看到細胞增殖抑制效果。如上，本發明的DNase適於抗腫瘤劑的應用。此外，與脂質體的複合體作為抗肺瘤劑的有效成分更有效。與一火水仙醯胺一起應用也有效。tableseeoriginaldocumentpage33《實施例11:含有熱變性IgG包被限制性酶XspI的脂質體的增殖抑制效果的評價》本實施例中，使用限制性酶Xspl(Takara，109SA)代替MKN-28DNase，按照實施例7中描述的程序製備含有限制性酶Xspl的脂質體製劑，應用MTT法(細胞懸液法或單層法)評價其細胞增殖抑制效果。使用人源肺癌培養細胞A549(RCB0098，理化學研究所，或ATCCCCL-185，ATCC)、人源胃癌培養細胞MKN-28及正常細胞人胚肺成纖維細胞MRC-5作為評價細胞。原癌基因N-ras、Ha-ras、Ki-ras均是第ll位和第12位的密碼子GCT(Ala)和GGT(Gly)，在A549細胞中變成了GCT(Ala)和AGT(Ser)。A549細胞的鹼基序列GCTAGT中的序列'CTAG，是限制性酶XspI的酶切識別序列'C:TAG，(符號'，表示酶切位點)。另外，MKN-28細胞的突變原因未明確。結果(IC5。值)示於表22和23中。表22中1(:50值指稀釋倍數，表23指IC5o值指Xspl單位/孔/100pl的單位。表22和23中[LP-Xsp]、[LP(無Xsp)]、[Xsp(無LP)]和[僅RB]分別表示含有熱變性IgG包被限制性酶XspI的脂質體、熱變性IgG包被脂質體(無限制性酶XspI)、僅限制性酶Xspl(無熱變性IgG包被脂質體)、和反應緩沖液[20mmol/L畫Tns畫HCl(pH8.5),10mmol/L-MgCl2,1mmol/L-DTT,100mmol/L-KC1]。tableseeoriginaldocumentpage34[表23]tableseeoriginaldocumentpage34如表22中所示，對於人源肺癌培養細胞A549來講，細胞懸浮法中，含有熱變性IgG包被限制性酶XspI的脂質體的ICso值是12.0，僅限制性酶XspI的ICso值是11.5,均有細胞增殖抑制效果。另外，對於人源胃癌培養細胞MKN-28來講，細胞懸浮法中，含有熱變性IgG包被限制性酶XspI的脂質體的IC5o值是7.3，僅限制性酶Xspl的ICsQ值是7.2;在單層法中，含有熱變性IgG包被限制性酶Xspl的脂質體的ICso值是15.0,僅限制性酶Xspl的ICso值是19.0,均有細胞增殖抑制效果。另一方面，對於正常細胞MRC-5來講，無論是含有熱變性IgG包被限制性酶Xspl的脂質體還是限制性酶Xspl均無細胞增殖抑制效果。這表明本發明的抗腫瘤劑不作用於正常細胞。《實施例12:含有熱變性IgG包被限制性酶Xspl的脂質體對M期細胞的增殖抑制效果》按照實施例10中描述的方法評價含有熱變性IgG包被限制性酶Xspl的脂質體對M期細胞的增殖抑制效果。結果如表24和表25所示。如表24和表25所示，本發明的抗肺瘤劑對人源肺癌培養細胞A549和人源胃癌培養細胞MKN-28顯示細胞增殖抑制效果，而對正常細胞無作用。[表24]_ICs。值(稀釋倍數)__細胞LP-XspLP(無.Xsp)Xsp(無LP)RB[表25]IC5。值(Xsp單位/孔/10QiuL)_細胞LP-XspLP(無Xsp)Xsp(無LP)RB產業上利用的可能性本發明的DNase適用於抗腫瘤劑的應用。以上是用特殊的實施方案對本發明進行的說明，本領域技術人員明顯的變更和改良也包含在本發明的範圍內。tableseeoriginaldocumentpage35法法法力籲々牙力於懸縣5懸4596法法法浮浮懸懸懸權利要求1.一種抗腫瘤劑，其含有DNase作為有效成分。2.權利要求l的抗腫瘤劑，它含有DNase和脂質體的複合體作為有效成分。3.—種DNase,它具有以下性質(a)作用及底物特異性具有核酸內切酶活性；(b)凝膠過濾色譜測定的分子量48~43kDa;(c)最適pH:pH3.0-4.5;(d)熱穩定性10(TC加熱10分鐘，核酸內切酶活性不失活；(e)對蛋白酶K處理的敏感性37。C反應15分鐘，核酸內切酶活性失活。4.一種DNase，它具有以下性質(a)作用及底物特異性具有核酸內切酶活性；(b)凝膠過濾色i普測定的分子量63kDa;(c)最適pH:pH3.04.5;(d)熱穩定性10(TC加熱10分鐘，核酸內切酶活性失活；(e)對蛋白酶K處理的敏感性37。C反應15分鐘，核酸內切酶活性不失活。5.—種醫藥組合物，它含有權利要求3或4中的DNase，和藥劑學或獸醫學中可接受的常規載體或稀釋劑。6.權利要求1或2的抗腫瘤劑，其中DNase為限制性酶，或者是權利要求3或4中的DNase。7.DNase在製備抗肺瘤劑中的用途。8.權利要求7的用途，其中DNase是DNase與脂質體的複合體。9.權利要求7或8的用途，其中DNase是限制性酶，或是權利要求3或4所述的DNase。10.—種癌的治療或預防方法，它包含給需要癌治療或預防的對象施用有效量的DNase。11.權利要求10的方法，其中DNase是DNase與脂質體的複合體。12.權利要求10或11的方法，其中DNase是是限制性酶，或者是4又利要求3或4中的DNase。全文摘要公開了一種含有DNase作為有效成分的抗腫瘤試劑，以及一種來源於人胃癌的培養細胞MKN-28來源的新型DNase和一種來源於人宮頸癌的培養細胞Hela來源的新型DNase。該抗腫瘤試劑不作用於正常細胞，僅特異地作用於癌。文檔編號A61K38/46GK101155595SQ200680011350公開日2008年4月2日申請日期2006年4月6日優先權日2005年4月7日發明者紺野謙治,茂田土郎,須永進申請人:森尼韋爾公司;須永進