IL-12及TNF-α自體腫瘤疫苗的製作方法

2023-12-09 01:59:36

專利名稱：IL-12及TNF-α自體腫瘤疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥技術領域，特別是適用於可耐受活檢及手術病人的IL-12及 TNF-a自體腫瘤疫苗。
背景技術：
惡性腫瘤是威脅人類健康和生命的主要疾病之一，其發病率逐年增高，且目前許 多腫瘤無法用手術、放療和化療等常規手段治癒。隨著對腫瘤發生、發展的分子機制的深入 研究和生物技術的迅速發展，生物治療已經成為腫瘤綜合治療的第四種模式，並受到了越 來越多的關注。腫瘤的生物治療(Biother即y)是應用現代生物技術及其產品進行腫瘤防 治的新療法，它通過調動宿主的天然防衛機制或給予天然(或基因工程)產生的靶向性很 強的物質來取得抗腫瘤效應，主要包括體細胞療法與細胞因子療法、腫瘤疫苗、分子靶向治 療、放免靶向治療、腫瘤的基因治療和生物化療等。其中，腫瘤疫苗是近年來國內外研究的 熱點之一，其原理是通過激活患者自身免疫系統，以達到清除或控制腫瘤的目的。隨著分子 生物學和基因工程的發展，腫瘤疫苗的研究取得了令人鼓舞的成果，現階段研究較多的腫 瘤疫苗有腫瘤細胞疫苗、腫瘤抗原疫苗、以DC(樹突狀細胞)為基礎的疫苗以及核酸疫苗 等。儘管現有疫苗表現出顯著的抗腫瘤潛能，但也存在特異性差、免疫原性不強、副作用大、 安全性差等缺點，故未能在臨床上推廣應用，如何研製出適合臨床應用，且副作用小的腫瘤 疫苗是目前腫瘤界面臨的一項重大課題。

發明內容
本發明的目的是提供一種副作用小，免疫原性及靶向性強的IL-12及TNF- a自體 腫瘤疫苗。 本發明所述IL-12及TNF-a自體腫瘤疫苗為含有IL-12基因、TNF-a基因和腫 瘤細胞的組合物。 所述組合物具有一種或多種醫學上可接受的佐劑，如Titer Max Gold、 QS21、 PLGA、乙醯殼多糖微粒、SAF、 FAS-m等。 製備表達IL-12及TNF-a基因的腫瘤疫苗，是在無菌條件下將切除的腫瘤標本 分離成單個腫瘤細胞，將細胞移入培養瓶中，置於二氧化碳培養箱中，在37°C 、5% C02條件 下，含10X胎牛血清的匿EM培養液中培養，三天更換培養液，一周左右傳代。為提高轉染效 率，避免脂質體對腫瘤細胞的毒性，採用聲學微泡造影劑代替脂質體將IL-12真核表達質 粒轉染腫瘤細胞製成IL-12瘤苗，進而將TNF- a質粒轉染IL-12瘤苗，最後獲得含IL-12 及TNF-a基因的腫瘤疫苗。 本發明所述自體腫瘤疫苗將細胞因子轉染腫瘤細胞，選用的細胞因子之一為 IL-12 (白細胞介素-12) 。 IL-12主要由活化的巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞產生，有 較強的免疫調節作用，能誘導PHA剌激的T細胞增殖，體外實驗證明，IL-12是調節Thl細 胞輔助細胞免疫功能的因素之一。IL-12全身大劑量用藥雖能產生有效的抗腫瘤效果，但毒性反應嚴重而限制其臨床應用。基因治療的方法為局部釋放IL-12,可避免上述危及生命的 併發症。 本發明選用的另一細胞因子為TNF-a (腫瘤壞死因子-a)。 TNF的生物活性與 IL-1十分相似，只是TNF更易引起腫瘤血管阻塞，抗腫瘤作用更強。低濃度的TNF-a主要 在局部發揮作用，高濃度的TNF-a可以進入血流，引起全身性反應。研究表明，TNF包括 TNF-a和TNF-P。近來的研究表明人和小鼠TNF-a禾P |3的基因都與腿C基因緊密連鎖， 暗示其可能參與免疫調節基因的表達調控。TNF-a是由激活的單核巨噬細胞產生的一種可 溶性細胞因子，是目前發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子之一。鑑於TNF-a可直接殺傷瘤 細胞而不損傷正常細胞，比化療藥物毒性小，TNF-a可望較其他細胞因子更快地大量應用 於臨床。目前已上市的新藥唯美生(mI_chTNF)就是用放射性核素mI標記TNF發揮抗腫 瘤作用。 單獨使用TNF用量大，不容易獲得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止 用藥。將其它具有腫瘤抑制作用的細胞因子(如IL-2、 IFN等)或某些抗腫瘤藥物與TNF 聯合應用，既可減少各種藥物的用量、降低毒副作用，又可提高療效。因此本發明將IL-12 與TNF-a聯合應用，以期更大限度的殺傷腫瘤細胞，減少正常組織損傷。
將本發明所述自體腫瘤疫苗適用於可耐受活檢及手術的病人，將該自體腫瘤疫苗 加入免疫輔助劑Titer Max Gold回輸到患者體內，以激活其自身具有免疫效應的淋巴細 胞，並直接殺死腫瘤細胞，降低腫瘤局部復發及遠處轉移。 本發明將細胞因子與腫瘤細胞相結合，目的在於增強腫瘤免疫原性，提高T細胞
對腫瘤抗原的反應性，而IL-12及TNF-a基因導入腫瘤細胞可使局部持續分泌IL_12及
TNF- a ，從而直接殺傷腫瘤細胞，減少正常組織損傷，從而提高抑瘤率。 本發明具有操作簡單、免疫原性及靶向性強、製備成本低和便於臨床應用的特點，
主要用於抗腫瘤免疫治療，包括手術後殘留、不能切除的腫瘤的治療。


圖1、 PCR擴增出IL-12目的片段IL-12目的基因理論長度1625bp， PCR產物經 1%瓊脂糖電泳顯示成功擴增出約1700bp的mlL-12片段，大小與目的基因相符，而陰性對 照pcDNA3. 1 (+)無明顯條帶出現。 圖2、重組IL-12質粒的PCR鑑定以pcDNA3. 1 (+)-mIL-12 (lane6， 7)及 pORF-mIL-12 (lane3， 4)為PCR反應模板均擴增出約1700bp的mIL_12片段，而陰性對照無 明顯條帶出現(lane 1， 2) 圖3、重組IL-12質粒的酶切鑑定HindIII、 EcoR I雙酶切後得2個片段，各約 1700bp和5400bp(lanel)，與插入目的基因mlL-12片段及pcDNA3. 1(+)載體大小相符， HindIII單酶切後(lane2)較原始環狀質粒pcDNA3. 1 (+) (ane3)泳動稍慢。
圖4、重組IL-12質粒的測序鑑定各連接點正確，插入序列與GENEBANK序列完全 相符(p40Version NM-008352. 1， GI :6680398 ;p35Version M86672. 1， GI :198336)，表明 mIL-12基因已正確插入pcDNA3. 1 (+)載體中，證實pcDNA3. 1 (+)-mlL-12質粒構建成功。
圖5、轉染前的腫瘤細胞轉染前，腫瘤細胞呈梭形，細胞較亮，活性較好，貼壁生 長，細胞數呈對數增長，生長曲線較陡。
圖6、轉染後的腫瘤細胞轉染48h後，將細胞轉入培養瓶中，細胞貼壁，部分細胞
死亡，轉染pcDNA3. 1 (+) -mIL-12組細胞變圓，貼壁減少，生長曲線平緩，細胞數增長緩慢，
與對照組相比P 0. 05。 圖7、IL-12活性檢測pcDNA3. 1(+)-mlL-12轉染的腫瘤細胞培養上清能明顯引起
ConA激活的小鼠脾細胞增殖，且呈濃度依賴性(A570分別為0. 507±0. 035，0. 802±0. 040，
1. 246±0. 028)，與對照組相比p < 0.05 (圖2-3)，與O' donnell等的結果一致。 圖8、成瘤的裸鼠裸鼠右後腿皮下接種對數生長期的A549細胞2X 106個細胞/
只後，小鼠的精神狀態、食慾、活動能力下降，睡眠時間增加，成瘤率90%，平均成瘤時間為
10d，未接種腫瘤的10隻小鼠生存狀況良好。 圖9、PBS治療組腫瘤組織病理切片PBS治療後腫瘤組織無明顯壞死，也無巨噬細
胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞等浸潤，腫瘤細胞較多，生長狀態較好。 圖10、 A549瘤苗治療組腫瘤組織病理切片A549瘤苗治療組與
pcDNA3. 1(+)-mlL-12質粒治療組腫瘤出現大片壞死，有大量巨噬細胞、中性粒細胞及嗜
酸性粒細胞等浸潤。免疫組化結果證實，腫瘤組織浸潤的淋巴細胞主要為CD4+、 CD8+淋巴
細胞浸潤(黃色_棕黃色顆粒)，且A549瘤苗治療組更多(p < 0. 05)，而空載體治療組
pcDNA3. 1 (+)及PBS治療組無CD4+、 CD8+淋巴細胞(不顯色)。
具體實施例方式
—、製備表達IL-12及TNF-a基因的腫瘤疫苗 1、腫瘤細胞分離將切除的腫瘤標本放入含50 ii g/ml慶大黴素的生理鹽水中，無 菌條件下快速送至實驗室。在超淨臺內去除壞死組織、脂肪和正常組織，用滅菌的PBS液將 取出的臟器清洗三次，然後用眼科手術剪刀仔細將組織反覆剪碎，直到成lmm3左右的小塊， 再用PBS清洗，洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中，靜置數分鐘，使組織塊自然沉澱 到管底，棄去上清。吸取0. 25%胰蛋白酶一 0. 02% EDTA混合消化液lml，加入離心管中，與 組織塊混勻後，加上管口塞子，37t:水浴中消化8 10分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使 組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5 10ml含5%小牛血清的DMEM 培養基，用吸管吹打混勻，臺盼藍排斥試驗檢測活細胞> 80X，細胞濃度2X107ml。將細 胞移入二個培養瓶中，置於二氧化碳培養箱中培養。 2、腫瘤細胞培養A549細胞在37°C、5% 0)2條件下，在含10X胎牛血清的DMEM 培養液中培養，三天更換培養液， 一周左右傳代。傳代培養時，將處於對數生長期的細胞用 0. 25%胰酶消化2-5min後，用DMEM培養液終止消化，在低速離心機上1500rpm離心5min， 棄上清液，再用PBS液重懸細胞，再離心5min。利用ELX800微孔板讀數儀調整細胞濃度後， 接種到新的培養瓶。 3、製備IL-12腫瘤疫苗IL-12真核表達質粒由發明人製備並進行鑑定(圖1，2， 3，4)，其生物學活性已檢測(圖5，6)，為提高轉染效率，避免脂質體對腫瘤細胞的毒性，本 發明採用聲學微泡造影劑代替脂質體進行轉染。 ①聲學微泡造影劑的配製將聲諾維(六氟化硫聲學微泡)凍幹製劑加入雙蒸水 2ml/支復溶，終濃度為20 ii g/ml，輕微振動5min，即成聲學微泡造影劑(A液)，室溫靜置備 用。
②濃度為1 y g/ y L的IL-12質粒溶液1 y L加入100 ii 1無血清無抗生素的DMEM 培養液中作為B液。 ③將A液及B液各lOOiU按體積比1 : 1混合，使聲學微泡造影劑充分包裹質 粒，此時肉眼可見呈雲霧狀。室溫下靜置10—15min備用。加入轉染液800iil，終體積lml， 輕微振蕩，使之充分混勻。 ④從培養箱中取融合率達到40% —60%的LLC細胞2瓶。用100 iU轉染液清洗 細胞表面2次備用。 ⑤將步驟③中的液體加入培養細胞中，使均勻覆蓋於細胞表面。放入37t:、5X(A 培養箱中轉染20hr。 ⑥棄上清液，加入新鮮DMEM液繼續培養72hr， 24hr換液一次。
⑦UGT1025型超聲基因轉染儀探頭用75%酒精作偶合劑，將已經加好IL-12質粒 溶液+聲學微泡造影劑細胞培養瓶放置在裝有一定脫氣水的玻璃缸中進行超聲照射，每瓶 照射20s，探頭聲波發射設置為定時間歇觸發，即兩次聲波發射間隔ls，每次發射聲波持續 ls。本實驗選用0. 5W/cm2超聲聲強。 ⑧轉染後的LLC細胞即為IL-12腫瘤疫苗，瘤苗中加入DMEM培養基，放入37t:、 5% C02培養箱中大量培養，三天換液，一周左右傳代。 4、製備IL-12及TNF-a腫瘤疫苗從培養箱內取出處於對數生長期的IL-12腫 瘤疫苗，將濃度為1 y g/ y L的TNF- a質粒溶液1 ii L加入100 y 1無血清無抗生素的DMEM 培養液中作為B液，聲學微泡造影劑為A液，按前述方法進行轉染，最後獲得含IL-12及 TNF-a基因的腫瘤疫苗。
二、體外實驗 lj中瘤疫苗IL-12及TNF-a表達 ELISA :收集轉染48h後的A549腫瘤疫苗上清，用蒸餾水將mIL_12標準品稀 釋至2000pg/mL，將稀釋標準品及待測樣品分別加入已包被mlL-12單克隆抗體的酶標 板上，100 L/孔，三復孔，再加入生物素化的抗mIL-12，再加入辣根過氧化物酶標記的 Str印tavidin與生物素結合，加入酶底物OPD，加終止液硫酸，在492nm處測OD值，用 mIL-12標準品作出標準曲線(第8孔作為空白對照)，根據標準曲線求待測樣品的mIL-12 濃度。TNF- a的檢測方法一樣，只是取TNF- a ELISA試劑盒檢測。 RT-PCR :收集轉染48h後的A549細胞，PBS洗2次，lOOOrpm離心5min，抽提總RNA 後經DNasel處理再進行RT-PCR， PCR的反應條件94°C ， 2min預變性；94°C ， 50s， 55°C ， 90s， 72。C，2min，27個循環;72"延長10min。 ， 1 %瓊脂糖電泳。抽提轉染pcDNA3. 1 (+)的LLC細 胞總RNA進行RT-PCR作為陰性對照。 2、檢測IL-12生物活性(T細胞增殖實驗)採用"單克隆抗體捕獲法"進行。首先 用化20)3緩衝液(pH 9. 5)稀釋大鼠抗小鼠IL-12抗體至濃度為5ii g/L，包被96孔板，然後 加入不同稀釋度的待測樣品和對照樣品100iU，37t:作用lh，以利於單克隆抗體將樣品中 的mIL-12捕獲，培養孔經PBS洗滌3次後，於每孔內加入經ConA(2mg/L)和mIL-12 (20mg/ L)活化培養3d的裸鼠脾淋巴細胞2X104，37^5^ 0)2培養2處，採用MTT法測定淋巴細 胞增殖活性。 TNF-a生物活性TNF-a 、TNF_|3具有直接殺傷某些腫瘤細胞的作用，採用TNF敏感的細胞株小鼠成纖維細胞株L929作為指示細胞，通過3H-TdR釋放法或染料染色等可檢 測待檢樣品中TNF的活性水平。 3、內毒素檢測經實驗檢測，產品的內毒素含量低於5個內毒素單位/kg，符合疫 苗生產的國際標準。 結果PCR產物經1%瓊脂糖電泳顯示成功擴增出約1700bp的mIL-12片段，大小 與目的基因相符，而陰性對照pcDNA3. 1(+)無明顯條帶出現。PCR鑑定、酶切鑑定及測序均 證實重組IL-12質粒構建成功。含IL-12及TNF- a的A549肺癌細胞腫瘤疫苗具有生物學 活性，能夠促進淋巴細胞增殖，增強細胞免疫能力，誘導腫瘤細胞凋亡。
三、動物體內實驗 1、建立荷瘤鼠模型裸鼠右後腿皮下接種對數生長期的A549細胞2Xl(f個細 胞/只，觀察接種腫瘤後小鼠的精神狀態、食慾、活動能力、睡眠狀況等。腫瘤長至直徑 0. 5-1. 0cm時，將小鼠隨機分成4組，每組10隻。另設一空白對照組(無腫瘤的10隻小 鼠)，進行生存期比較(圖7)。 2、免疫程序從培養箱內取出製備好的含IL-12及TNF-a基因的A549腫瘤疫苗，
PBS洗三次，再加入免疫輔助劑Titer Max Gold (購於美國CytRx公司)，調整細胞濃度，每
次每隻小鼠瘤內注射2X106個細胞，整個療程分5次接種，每次間隔3d。 3、統計學處理所得數據用S±s表示，Excel軟體作圖，採用SPSS10. 0軟體進行
單因素方差分析，比較各實驗組與對照組的差異，p < 0. 05有顯著性差異。
4、療效評價 1)特異性CTL、 NK細胞活性檢測 (1)脾臟單細胞懸液的製備(在開始治療後第21d分別分離4組接種小鼠的脾臟 細胞作為效應細胞) ①將無菌飼養小鼠斷頸處死後接血，製備血清(室溫放置2h後於4t:過夜，次日 4000rpm離心10min，吸取上清)。 @小鼠浸泡在75%酒精中10min，用無菌眼科剪刀和鑷子取出脾臟。 ③無菌PBS衝洗後以眼科彎剪刀反覆剪碎，無菌PBS衝洗至無菌平皿中，2000rpm
離心5min，棄上清。
沉澱中加入紅細胞裂解液2ml ，室溫裂解2min後加入含10 %小牛血清的 RPMI1640完全培養基，200目尼龍網過濾製成單細胞懸液，2000rpm離心5min，棄上清。
⑤沉澱懸浮於2ml完全培養基中，即為脾細胞，計數，調至2 X 107個細胞/ml ，置於 37°C 5% (A孵箱中備用，即效應細胞。 (2)腫瘤細胞特異性CTL活性檢測採用3H_TdR釋放法[10]
①取體外傳代處於對數生長期的A549細胞2X 106個。 ②加入740KBq/20 ill的[3H]-TdR，混勻後於37°C ， 5% C02條件下培養4h，每0. 5h 振蕩1次。 ③標記後用Hank' s液充分洗滌細胞3次以洗去游離的[3H]_TdR，計數後調細胞 濃度至4X 105個細胞/ml，即靶細胞。 ④於96孔板中每孔分別加100iil(2Xl6個)脾細胞，50 iU (2 X 104個細胞)及 25 iU (1 X 104個細胞)[3H] -TdR標記的靶細胞，三復孔，設自發釋放對照孔，37°C ， 5% C02條件下培養18h。 ⑤收集細胞於玻璃纖維濾膜上，烤乾，液閃儀測cpm值。
⑥按下列公式計算特異性CTL細胞殺傷活性
CTL細胞殺傷活性=(1-實驗孔cpm/自發釋放孔cpm) X 100%
(3)脾臟NK細胞毒活性檢測 ①取體外傳代處於對數生長期的Yac-l細胞2 X 106個，加入740KBq/20 ii 1 的3H-TdR，混勻後於37°C ， 5% C02條件下培養4h，每0. 5h振蕩1次。 ②標記後用Hank' s液充分洗滌細胞3次以洗去游離的3H_TdR。計數後調細胞濃 度至4X105個細胞/ml。 ③於96孔板中每孔加100iil(2Xl6個細胞)脾細胞，50 iU (2X 104個細胞)，
25 iil (1 X 104個細胞)3H-TdR標記的Yac-l細胞，三復孔，設自發釋放對照孔，37°C ， 5% C02
條件下培養18h後收集細胞於玻璃纖維濾膜上，烤乾。
液閃測cpm值，按下列公式計算特異性NK細胞殺傷活性 NK細胞殺傷活性=(1-實驗孔cpm/自發釋放孔cpm) X 100% 脾臟NK細胞毒活性檢測方法不同之處在於其標記體外傳代處於對數生長期
Yac-l細胞作為靶細胞。 2)治療前後IL-12、IFN-y濃度的變化主動免疫治療前3d， 5次免疫治療後1周，
分別採集小鼠血清，檢測血清中IL-12、IFN-y水平。IFN-y及IL-12ELISA試劑盒由美國
Genezyme公司提供。結果判定每個血清標本的A (OD)值減去對照孔的A值為絕對值，根
據A值計算標本的IL-12、 IFN- y濃度。 3)腫瘤組織免疫組化分析CD4+、 CD8+T細胞 (1)載玻片處理 ①清潔液浸泡，自來水衝洗。 ②泡硫酸洗液過夜。 ③取出後自來水衝洗，用蒸餾水衝洗後烘乾。 ④在無水乙醇中浸泡過夜，擦乾後用鋁箔包好備用。 ⑤使用時取出用防脫片液浸泡lmin，蒸餾水浸洗2次，晾乾備用。 (2)免疫組化檢測CD4+及CD8+細胞 ①瘤組織石蠟切片，6(TC加溫l-2h， 二甲苯脫蠟2次，10min/次。②無水乙醇洗2次，5min/次，新鮮配製的0. 5%過氧化氫甲醇液中浸泡30min，水
化後在O. 1%的胰蛋白酶中37t:溫浴45min。 ③滴加大鼠抗小鼠CD4+、 CD8+單抗，溼盒內lh， PBS洗3次。
加生物素標記的二抗，37"，溼盒內lh， PBS洗3次。 ⑤加酶作用底物DAB顯色，蘇木精液復染40min， PBS洗3次後中性樹膠封片保存。
陽性結果為細胞核呈棕褐色。 4)檢測腫瘤細胞凋亡分別取各組荷瘤鼠3隻處死後，取出腫瘤組織，常規固定、 切片，按試劑盒說明書進行原位末端標記(TUNEL)染色，觀察細胞凋亡情況。
5)觀察病理學改變21d後處死小鼠，取治療組和對照組腫瘤組織10%福馬林 固定，石臘包埋切片後HE染色，鏡下觀察病理學改變。取治療組和對照組腫瘤組織10%福馬林固定，石臘包埋，切片。切片二甲苯染色15minX2次，100X乙醇浸泡5minX2次， 95%乙醇浸泡5min，80X乙醇浸泡3min，70X乙醇浸泡2min，50X乙醇浸泡2min，蒸餾水 洗，HE染色，光學顯微鏡下常規病理觀察(圖9、圖10)。 結果裸鼠右後腿皮下接種對數生長期的A549細胞2X 106個細胞/只後，成瘤 率90%，平均成瘤時間為10d。未接種腫瘤的IO只小鼠生存狀況良好。A549瘤苗治療組 與pcDNA3. 1 (+)-mIL-12質粒治療組腫瘤出現大片壞死，有大量巨噬細胞、中性粒細胞及嗜 酸性粒細胞等浸潤。免疫組化結果證實，腫瘤組織浸潤的淋巴細胞主要為CD4+、 CD8+淋巴 細胞浸潤(黃色_棕黃色顆粒)，且A549瘤苗治療組更多(p < 0. 05)，而空載體治療組 pcDNA3. 1 (+)及PBS治療組無CD4+、 CD8+淋巴細胞(不顯色)。 此結果說明含IL-12及TNF-a基因的A549肺癌細胞瘤苗能夠產生針對腫瘤的免 疫反應，導致腫瘤組織壞死，從而降低腫瘤局部復發及遠處轉，而對正常組織無損傷，適合 各種實體瘤治療，且副作用小，具有較大的發展潛力。
權利要求
IL-12及TNF-α自體腫瘤疫苗，其特徵在於為含有IL-12基因、TNF-α基因和腫瘤細胞的組合物。
2. 根據權利要求l所述IL-12及TNF-a自體腫瘤疫苗，其特徵在於所述組合物具有 一種或一種以上醫學上可接受的佐劑。
全文摘要
本發明涉及一種適用於可耐受活檢及手術病人的IL-12及TNF-α自體腫瘤疫苗，該疫苗為含有IL-12基因、TNF-α基因和腫瘤細胞的組合物，具有操作簡單、免疫原性及靶向性強、製備成本低和便於臨床應用的特點，主要用於抗腫瘤免疫治療，包括手術後殘留、不能切除的腫瘤的治療。
文檔編號A61P35/00GK101716339SQ20091025100
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月25日 優先權日2009年12月25日
發明者尹曉玲, 林海波 申請人:尹曉玲