白念珠菌細胞凋亡促進因子基因及其用途的製作方法

2023-12-09 09:52:36 1

專利名稱：白念珠菌細胞凋亡促進因子基因及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的編碼白念珠菌凋亡促進因子CaWwml的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽，本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和製備，更具體地，本發明涉及從白念珠菌的基因組中克隆到白念珠菌細胞凋亡促進因子基因CaffWMl及其用途。
背景技術：
白念珠菌也稱為白色念珠菌(Candida albicans),它是一種臨床上分離到的一種機會性人體致病真菌，在免疫下調的病人中，如器官移植病人，愛滋病毒感染者等，可以引起廣泛的淺部和深部系統感染，感染部位包括口腔，女性陰道等，引起鵝口瘡，陰道炎等疾病，也可以侵入表皮和內皮細胞進入血液到達內臟器官，如腎臟，腦部等，導致敗血症，嚴重可以導致死亡(Odds, F. C. 1994. J Am Acad Dermatol. 31:S2_S5.)。細胞凋亡是一種重要的細胞生理活動，是外界刺激信號通過細胞信號轉導通路引起細胞「自殺」的一種機制，過去認為細胞凋亡主要在多細胞生物中發生，起到協調機體生長的作用。但是，近年來的研究發現，單細胞的酵母也存在這種生理活動，乙酸，過氧化氫，葡萄糖，抗真菌藥物能引起酵母發生凋亡。然而，究竟哪些基因參與酵母細胞凋亡的信號轉導還不十分清楚。有報導在釀酒酵母中表達高等生物的Bax,Bax InhibitorCBI), Caspase等凋亡相關基因會影響釀酒酵母的凋亡率，說明從酵母到高等生物其凋亡的機理存在一定相似性。目前發現，白念珠菌在多種理化因子的誘導下會發生細胞凋亡，然而，對白念珠菌凋亡發生的分子機制研究尚不清楚。

由於白念珠菌會嚴重威脅人們的身體健康，因此，開發白念珠菌凋亡有關的各種蛋白或因子，對於更好的防治白念珠菌感染有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的與白念珠菌生長有關的凋亡促進因子CaWwml蛋白以及其片段、類似物和衍生物。本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。在本發明的第一方面，提供新穎的分離出的CaWwml多肽，它包括具有SEQ IDN0:2胺基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO:2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO:2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，並且具有調控白念珠菌菌絲形成的功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，該多肽是具有SEQ ID N0:2胺基酸序列的多肽。在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)編碼上述白念珠菌CaWwml多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO:2所示胺基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO:1中1-711位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-708位的序列；或(c)具有SEQ ID NO:1中翻譯起始密碼子到終止密碼子的序列。在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。在本發明的第四方面，提供了製備具有白念珠菌CaWwml蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達白念珠菌CaWwml蛋白的條件下,培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有白念珠菌CaWwml蛋白活性的多肽。在本發明的第五方面，提供了與上述的白念珠菌CaWwml多肽特異性結合的抗體。在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗白念珠菌CaWwml多肽活性的化合物，以及抑制白念珠菌CaWwml多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或製備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是白念珠菌CaWwml多肽的編碼序列或其片段的反義序列。在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CaWwml蛋白的方法，它包括將樣品與CaWwml蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CaWwml蛋白。在本發明的第八方面，提供了一種檢測與白念珠菌CaWwml多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用於篩選促進白念珠菌CaW wml多肽活性的激動劑，或者篩選抑制白念珠菌CaWwml多肽活性的拮抗劑、或者被用於肽指紋圖譜鑑定。本發明的白念珠菌CaWwml蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如O. 001-99. 99wt%)的本發明的白念珠菌CaWwml多肽的拮抗劑或抑制劑或抗體以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療白念珠菌感染等病症。


下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明範圍。圖1顯不了白念珠菌CaWwml蛋白因子和釀酒酵母ScWwml蛋白因子結構域比較。圖2顯示了利用PCR從白念珠菌基因組DNA中擴增得到CaWWMl基因編碼區。圖3為Northern雜交圖，顯示了在白念珠菌菌株SC5314酵母型與菌絲型生長狀態下中CaffWMl基因的表達狀況。以CaACTl基因為對照。圖4顯示了在釀酒酵母中表達CaffWMl基因後，釀酒酵母在乙酸與過氧化氫的作用下的細胞生存率。結果顯示，CaWwml蛋白提高了釀酒酵母在乙酸和過氧化氫中的凋亡率，這種效應在低濃度的情況下尤其明顯。圖5顯示了 CaWwml因子和CaMcal因子存在相互作用。
具體實施例方式本發明人通過廣泛而深入的研究，首次在白念珠菌中克隆了一種促進白念珠菌凋亡因子基因CaWwml。具體地，本發明人利用基因表達原理，在釀酒酵母中高表達CaWWMl，導致釀酒酵母細胞存活率比對照細胞明顯降低，尤其是在低濃度乙酸及過氧化氫作用下，CaffWMl基因在釀酒酵母中的表達導致釀酒酵母細胞凋亡率提高，說明CaWwml蛋白是白念珠菌中的一個重要的促凋亡因子，在此基礎上完成了本發明。在本發明中，術語「CaWwml蛋白」、「CaWwml多肽」或「凋亡促進因子CaWwmr』可互換使用，都指具有白念珠菌凋亡促進因子CaWwml胺基酸序列(SEQ ID N0:2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的凋亡促進因子CaWwml。如本文所用，「分離的」是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，「分離的CaWwml蛋白或多肽」是指CaWwml多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化CaWwml蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯醯胺凝膠上能產生單一的主帶。CaWwml多肽的純度能用胺基酸序列分析。本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆 蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發明還包括白念珠菌CaWwml蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語「片段」、「衍生物」和「類似物」是指基本上保持本發明的天然白念珠菌CaWwml蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個胺基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的胺基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。在本發明中，術語「白念珠菌CaWwml多肽」指具有白念珠菌CaWwml蛋白活性的SEQID N0:2序列的多肽。該術語還包括具有與白念珠菌CaWwml蛋白相同功能的、SEQ IDN0:2序列的變異形式。這些變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)胺基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括白念珠菌CaWwml蛋白的活性片段和活性衍生物。該術語還包括與SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列具有至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%序列相同性，並且具有調控白念珠菌菌絲形成的功能的多肽。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與白念珠菌CaWwmlDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗白念珠菌CaWwml多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含白念珠菌CaWwml多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了白念珠菌CaWwml多肽的可溶性片段。通常，該片段具有白念珠菌CaWwml多肽序列的至少約10個連續胺基酸，通常至少約30個連續胺基酸，較佳地至少約50個連續胺基酸，更佳地至少約80個連續胺基酸,最佳地至少約100個連續胺基酸。發明還提供白念珠菌CaWwml蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然白念珠菌Caffwml多肽的差別可以是胺基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露於誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同於天然L-胺基酸的殘基(如D-胺基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如β、Y-胺基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽並不限於上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙醯化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。在本發明中，「白念珠菌CaWwml蛋白保守性變異多肽」指與SEQ ID NO: 2的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替 換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表I進行胺基酸替換而產生。表I
權利要求
1.一種分離的白念珠菌CaWwml多肽，其特徵在於，該多肽選自下組(a)具有SEQID NO: 2胺基酸序列的多肽；(b)將SEQID N0:2胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，並且具有促進細胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於該多肽是具有SEQID NO: 2胺基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特徵在於，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組Ca)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特徵在於，該多核苷酸的序列選自下組的一種Ca)具有SEQ ID NO:1中1-711位的序列；(b)具有SEQ ID NO:1中1-708位的序列。
5.—種載體,其特徵在於它含有權利要求3所述的多核苷酸。
6.—種遺傳工程化的宿主細胞,其特徵在於它含有權利要求5所述的載體。
7.—種多肽的製備方法,其特徵在於,該方法包含Ca)在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出白念珠菌CaWwml蛋白多肽。
8.一種能與權利要求1所述的白念珠菌CaWwml蛋白特異性結合的抗體。
9.一種檢測樣品中是否存在CaWwml蛋白的方法，其特徵在於將樣品與權利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體複合物，形成了抗體複合物就表示樣品中存在CaWwml蛋白。
10.如權利要求1-9所述的多肽、多核苷酸和編碼序列，可用於篩選促進白念珠菌Caffwml多肽活性的激動劑，篩選抑制白念珠菌CaWwml多肽活性的拮抗劑，或者被用於肽指紋圖譜鑑定，多聚核苷酸可用於CaWwml蛋白相關疾病的診斷，白念珠菌CaWwml蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用於PCR擴增反應，或者作為探針用於雜交反應，或者用於製造基因晶片或微陣列。
全文摘要
本發明公開了一種白念珠菌細胞凋亡促進因子基因CaWWM1及其用途，屬於生物醫藥技術領域。包括提供了一種新的細胞凋亡調控因子-CaWwm1蛋白，編碼CaWwm1蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這種CaWwm1蛋白的方法，以及編碼這種CaWwm1蛋白的多核苷酸的用途，CaWwm1是對白念珠菌凋亡有促進作用的蛋白，它的表達量提高能促進酵母細胞發生凋亡。
文檔編號C12N1/19GK103059110SQ20131000170
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月5日 優先權日2013年1月5日
發明者倪堅, 尹軍霞, 金立方, 弭忠祥 申請人:紹興文理學院