測定病毒滴度的酶免疫斑點法的製作方法
2023-12-09 06:43:41 1
專利名稱：：測定病毒滴度的酶免疫斑點法的製作方法
技術領域：
：本發明涉及病毒滴度的測定方法，特別是酶免疫斑點法(EIS)測定病毒滴度。病毒學理論研究應用病毒學的研究及生產過程都涉及病毒量的測定，即病毒滴度的測定。以往和現行的測定方法主要有動物法、蝕斑法和細胞病變法，其中常用的是蝕斑法和細胞病變法，特別是細胞病變法(CPE)，因其較蝕斑法簡便，利於多份樣品的測定，常在多批量的測定中採用。但是，CPE法是以顯微鏡下觀察細胞病變為判定指標，並依此計算半數細胞感染劑量(TCID50)；試驗對操作者技術要求高，不同病毒造成的細胞病變有差異也有雷同，造成病變結果不易辯認。因此，試驗結果受主觀因素影響較大，操作誤差大，另外，CPE工作量大，工作強度高，操作時間長。本發明的目的是提供一種病毒滴度的測定方法，該方法簡便、快速、便於記錄結果，操作誤差小。為實現上述目的，本發明採取以下技術方案一種測定病毒滴度的酶免疫斑點法，它包括以下幾個步驟(1)單層細胞準備，並向細胞培養板各孔中加入細胞懸液；(2)病毒稀釋，並將稀釋後不同濃度的病毒分別加到測定用的細胞培養板孔中；(3)感染細胞的培養；(4)將步驟(3)中的感染細胞固定、封閉；(5)加入該病毒的特異性抗體；(6)加酶標記的第二抗體；(7)加酶底物，數分鐘後有病變的部位即出現染色斑點。上述測定步驟中，從細胞準備至感染細胞培養系常規技術方法，對絕大多數病毒均適用，在作具體病毒的測定中，僅需改變該病毒的特異性抗體即可，其餘各培養、反應步驟中，溫度控制在36-37℃之間，抗體反應時間控制在20分鐘至60分鐘(除酶與底物作用時間較短外，底物抗體反應在室溫下進行)。本發明利用免疫反應的特異性和酶化學反應放大性特點，創造性地形成染色斑點，使顯微鏡下才能辯別出來的細胞病變以肉眼可見的形式表現出來，並且保證了這種表現方式的特異性(抗原-抗體特異性結合)，以往的酶聯免疫吸附試驗(EIA)都以顯色反應測定OD值來判定結果或觀察液體的顏色變化，其抗原、抗體反應是在可溶解和分散的狀態下進行的，底物顯色也是在溶解於液體中再表現出來的，而EIS與EIA的不同在於前者的反應及表現都是在細胞病變部位發生的，是定位的，有形的，與酶免疫組織化學技術相比，EIS是在細胞培養板上直接檢測染色斑點，是有重要區別的。本發明優點通過引入酶免疫技術使微量板上出現的CPE部位形成特異的染色斑點，從而可以用肉眼直接判定各孔是否出現CPE，免去顯微鏡下觀察CPE造成的工作量增加，使結果客觀、更直觀，快速、便於記錄，操作誤差小。下面結合實施例對本發明作進一步說明實施例11、取培養3-5天，生長良好的FL細胞(長春生研所提供)，用細胞消化液處理後，棄幹消化液，將細胞於細胞培養液中(MEM培養基含5％小牛血清，青黴素、鏈黴素各1萬u/ml，稀釋成30-50×104/ml濃度。在96孔細胞培養板上每孔加細胞懸液100μl。2、取麻疹病毒(長春生物製品研究所(長47株)50批)在試管中稀釋成10-4、10-5濃度，分別加入細胞培養板孔中，每個濃度加8孔，每孔100μ1，繼續做細胞培養。3、培養板置於5％CO2培養箱中，37℃，8天，上述幾個步驟可見計劃免疫技術管理規程(衛生部1987年)。4、固定將培養8天的培養板棄其培養液，各孔加固定液(70％丙酮/PBS(磷酸鹽緩衝液))150μl，置冰盒內15分鐘，棄去固定液，通風處涼幹，置-20℃備用或直接進行下一步。5、封閉各孔加稀釋液(PBS/BT)〔即PBS(0.01M，PH7.2)+0.5％明膠及0.15％吐溫-20(Tween-20)〕150μl，37℃，30分鐘，再用洗液(PBS/T)〔PBS+0.05％吐溫-20(Tween-20)〕洗3次。6、加抗麻疹病毒單克隆抗體(McAb)V17株，該抗體以PBS/GT稀釋1∶3000，隨後每孔加75μl，37℃，40分鐘，洗6次(洗液同上。7、加抗鼠IgG-過氧化物酶標記物(Ab-E)(美國ZYmed公司產品)用時以PBS/GT稀釋1∶3000，每孔加75μl置37℃，40分鐘，洗6次(洗液同上)。加底物用10ml的底物稀釋液(用1.0M檸檬酸將0.1M醋酸鈉至PH5.5)加入200μlTMB(系Sigma公司產品，100mgTMB溶於20mlDmso中，分裝成1ml/瓶，置-20℃備用)再加20％H2O22μl，混勻後每孔加75μl，室溫下放置5-20分鐘。結果判定白色背景下肉眼觀察，出現蘭色斑點為陽性，未加病毒細胞的對照孔不出現染色斑點，記錄各孔情況見圖片(附圖1)。圖1中兩個「S」指兩份樣品，「-4，-5」指10-4和10-5兩個稀釋度，NO.V.Contr指沒有病毒的對照，即沒有感染病毒的細胞經處理後不出現染色斑點，陰性對照。病毒滴度計算(Karber法)計算半數細胞感染濃度(TCID50)，用其對數表示病毒滴定，LogTCID50=Xm+d(50-pi100)]]>Xm＝病毒最高濃度的對數d＝稀釋倍數對數ΣPi＝每個稀釋度出現病變(斑點)孔數佔同稀釋度所用孔數的百分數，在公式中，Xm＝-4，d＝1，Pi計算時分母為8，如10-4濃度下有6孔出現斑點，則P-4＝6/8×100％＝75％，即10-4濃度下有75％孔出現斑點。結果1、試驗的50批病毒滴度(TCID50/ml)，最低的小於4.5，最高的6.5，分布見表1，50批病毒滴度與CPE法相比較，49份相符，符合率98.0％(49/50)，其中一份病毒滴度不一致，EIS法滴度為6.50，CPE法是6.375。2、50批病毒滴度共用800個試驗孔，各孔結果(+/-)總符合率為99.88％(799/800)。所有陰性對照孔未出現斑點。3、以800個試驗孔結果(+/-)計算特異性，按下述方式計算真陽性數假陰性數5100510假陽性數真陰性數本試驗1289290總數800敏感性＝510/510×100％＝100％特異性＝289/290×100％＝99.66％表150批麻疹病毒EIS法滴度分布權利要求1.一種測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特徵在於它包括以下幾個步驟(1)單層細胞準備，並向細胞培養板各孔中加入細胞懸液；(2)病毒稀釋，並將稀釋後不同濃度的病毒分別加到測定用的細胞培養板孔中；(3)感染細胞的培養；(4)將步驟(3)中的感染細胞固定、封閉；(5)加入該病毒的特異性抗體；(6)加酶標記的第二抗體；(7)加酶底物，數分鐘後有病變的部位即出現染色斑點。2.根據權利要求1所述的測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特徵在於所述的病毒為麻疹病毒，特異性抗體為抗麻疹病毒單克隆抗體，酶標記的第二抗體為抗鼠IgG一過氧化物酶標記物。3.根據權利要求2所述的測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特徵在於所述的抗麻疹病毒單克隆抗體以PBS/GT稀釋，加至封閉後的感染細胞上，溫度控制在36-37℃。4.根據權利要求2所述的測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特徵在於所述的抗體反應時間控制在20-60分鐘，溫度37℃。5.根據權利要求1所述的測定病毒滴度酶免疫斑點法，其特徵在於所述的加入酶標記物以PBS/GT稀釋，溫度控制在36-37℃。6.根據權利要求1所述的測定病毒滴度酶免疫斑點法，其特徵在於所述的抗體反應時間控制在20-60分鐘，溫度37℃。全文摘要一種測定病毒滴度的酶免疫斑點法,它包括以下幾個步驟:單層細胞準備,病毒稀釋,感染細胞培養、固定、封閉,加入該病毒的特異性抗體,加酶標記的第二抗體,加酶底物、數分鐘後有病變的部位即出現染色斑點,本方法通過引入酶免疫技術使微量板上出現的CPE部位形成特異的染色斑點,從而可用肉眼直接判定各孔是否出現CPE,免去顯微鏡下觀察CPE造成的工作量增加,使結果客觀、更直觀,便於記錄,快速,操作誤差小,易於推廣使用。文檔編號G01N33/569GK1196394SQ9710007公開日1998年10月21日申請日期1997年2月21日優先權日1997年2月21日發明者呂長國,馬沈英,吳燕平,扈光偉,李守幫,薄平,宋潔槐申請人:吉林省衛生防疫站