骨損傷遺傳易感性的診斷方法

2023-12-09 06:32:41

專利名稱：骨損傷遺傳易感性的診斷方法
技術領域：
本發明涉及β-A抑制素(INHBA)基因中新型核苷酸多態性的鑑定，以及該核苷酸多態性在診斷骨損傷的易感性，特別是骨折易感性中的應用。本發明還提供了含本發明的多核苷酸的轉基因非人動物，以及用於診斷和/或確定骨損傷易感性的方法和試劑盒。
β-A抑制素亞基與α亞基結合形成垂體FSH分泌抑制因子。已顯示抑制素負調節生殖基質細胞的增殖，並有腫瘤抑制因子的活性。此外，已顯示抑制素的血清水平反映顆粒細胞腫瘤的大小，因此可用作原發和復發病的標記。因為在生殖組織和各種外生殖組織中的表達能夠以組織特異的方式成倍變化，所以有人提出抑制素可以既是生長/分化因子又是激素。此外，β-A亞基形成同型二聚體，活化素A，β-A亞基也和β-B亞基結合形成異型二聚體，活化素AB，兩者均刺激FSH的分泌。最後，已顯示β-A亞基mRNA與細胞胞分化因子亞基mRNA相同，並且在人類基因組中只存在該mRNA的一種基因。
骨質疏鬆症是一種常見疾病，其特徵在於骨礦物質密度(BMD)的降低、骨微結構的損壞和骨損傷危險性的增加，如骨折。骨質疏鬆症是一個重要的公共健康問題，其影響生命質量並增加衛生保健提供者的費用。在歐洲，五十歲以上的人口中，每三位女性中就有一位和每十二位男性中就有一位存在這種危險。在美國，該病影響二千五百萬人，發病率比英國高25％，該病還在歐洲和日本影響合計五千萬人。據估計，到下個世紀中期，骨質疏鬆症患者的數量在西方將翻倍，但在亞洲和南美洲將增加六倍。骨折是骨質疏鬆症最嚴重的後果，尤其是髖骨折，該病每年在全球影響多達一百七十萬人。據估計，到2050年，由於人類預計壽命和年齡的增長，全球髖骨折患者的數量將超過六百萬。
骨質疏鬆症的治療並不理想。尤其是，一旦由於骨質疏鬆而發生骨損傷時，除了讓骨癒合外醫師沒有其它更好的辦法。對於老人而言，這將是一個漫長和痛苦的過程。對於存在患骨質疏鬆危險的人的診斷，可使預防措施更有效。該病的預防措施包括在早期成年期增加骨密度，以及在生命後期使骨損失最小化。已顯示生活方式的改變、營養和激素因子影響骨損失。
可認為骨質疏鬆症是有幾種作為表型可變性的遺傳決定基礎的基因變體的複雜遺傳性狀。低骨礦物質密度，作為骨質疏鬆症在臨床上最相關的特徵，是骨折的重要危險因素。
鑑於骨礦物質密度的多基因控制和因此的疾病狀態如骨質疏鬆，顯然，對造成骨損傷易感性的其它遺傳因素的鑑定將為這種疾病提供重要的新的了解，並可以應用預防措施，和開發新的診斷和/或預後檢測以及治療。
檢測遺傳易感性是重要的可實施的診斷手段。在許多情況下，優選的檢測將針對涉及例如骨質疏鬆症的疾病的超過一個的因素。隨著信息的增加，可提供關於男性或女性個體遺傳易感性的更廣的視角。遺傳易感性是個體患有疾病或者將患疾病的危險。
本發明在其它方面提供了確定男性或女性個體的骨損傷易感性的方法。
在第一方面，本發明提供了確定骨損傷易感性的方法，包括確定INHBA基因的至少一個等位基因在第39位多態性的存在或缺失。在一個具體的實施方案中，多態性由在第39位核苷酸鹼基A的存在構成。
第一方面的方法可應用於任何哺乳動物受試者。優選的，該哺乳動物患者是人類，最優選為成年人，優選為女性，或者男性。
已顯示INHBA基因中的新型多態性是骨損傷及相關病症如骨質疏鬆症易感性增加的原因。尤其是，本發明的多態性，其自身或與其它多態性相結合可用於鑑定易感或抵抗骨損傷的男性或女性個體以及用於該病的預防和/或治療。
本發明可用於骨損傷為因素之一的任何疾病，例如骨質疏鬆症和骨質疏鬆性骨折。骨損傷可定義為由低的骨礦物質密度造成的任何形式的損傷，並包括除了正常磨損之外的任何形式的結構損傷，例如骨折或骨碎(fractures，bones or chips)，和骨的降解或損壞。
多態性通常定義為群體中基因的兩種或多種可能的序列，或等位基因。多態性位點是基因中發生序列趨異的位置。多態性顯示方式的例子包括限制性片段長度多態性、可變數目的串聯重複、高度可變區、小衛星、雙核苷酸重複或多核苷酸重複、插入元件和核苷酸缺失、添加或置換。通常將第一個鑑定出的等位基稱為參考等位基因，或野生型。其它等位基因通常指定為可變或變異的等位基因。在本文中，第一方面的序列指定為參考基因，並且不是本發明的一部分。本發明的在上述一個或多個位置與這些序列不同的核酸序列可稱作這些序列的變體。
單核苷酸多態性是指在單核苷酸殘基所佔位點的等位基因間的序列的變異。單核苷酸多態性(SNP’s)起因於在多態性位點核苷酸殘基的置換、缺失或插入。典型地，單核苷酸多態性導致變體序列位點被除了參考鹼基外的其它任意鹼基所佔據。例如，當參考序列在多態性位點包含鹼基「T」時，變體可在該點包含鹼基「C」、「G」或「A」。
本發明的多態性發生在非編碼區，因此可能並不影響蛋白質的序列，但是可通過影響複製、轉錄和/或翻譯而施加表型作用。多態性可影響超過一個的表表型特徵或者可能與特定的表型相關。
表1 INHBA02 SNP5′SNP 3′
其中R代表鹼基G向鹼基A的改變。
第一方面的方法通過本領域技術人員已知的方法實施。典型地，該方法包括使來自男性或女性個體的DNA樣品與藥劑接觸，所述藥劑可確定表1和/或

圖1所述的多態性的存在或缺失。這種藥劑可以是雜交核苷酸、抗體、PCR藥劑或其它藥劑。關於藥劑的進一步描述見下文，並且操作法的描述見本發明的實施例部分。
所述方法可包括確定一個或多個特定等位基因是否存在，或確定等位基因的哪一種組合(例如，單倍型)存在。該方法還包括確定受試者的特定等位基因或者單倍型是純合子還是雜合子。在一個優選的實施方案中，該方法包括確定本發明多態性的哪一個/哪幾個等位基因存在。
任何方法，包括本領域技術人員已知的方法，均可用於確定INHBA基因的哪一個(或哪幾個)等位基因存在。優選地，該方法包括首先從受試者分離樣品。更優選地，該方法包括獲得分離的多核苷酸樣品，以確定INHBA基因的哪一個(或哪幾個)等位基因存在。因此，本發明涉及非侵入性的診斷方法，其結果提供了骨損傷易感性的指示，但並不能夠提供需要立即進行醫療幹預的診斷。
任何包括含有核酸或者蛋白的細胞的生物樣品均適用於該目的。適合的樣品的例子包括全血、精液、唾液、眼淚、口腔(buccal)、皮膚或毛髮。樣品和/或核酸可以固定於載體，例如固體載體上。
在一個優選實施方案中，用多核苷酸實施所述方法。可使用確定多核苷酸中等位基因的任何方法，包括本領域技術人員已知的方法。優選地，例如，該方法可包括如下定義的反義多核苷酸的應用。這些多核苷酸可以是可通過優先結合來區分INHBA基因的等位基因的序列或者是在嚴格條件下與等位基因兩側的任一側區域雜交從而擴增一種或多種多態性的序列。
該實施方案的方法包括本領域技術人員已知的方法，例如，直接探測、等位基因特異性雜交、PCR方法，包括等位基因特異性擴增(ASA)、等位基因特異性雜交、單個鹼基延伸、遺傳位分析法和RFLP，或直接測序。適合的限制酶理所當然取決於多態性和限制位點，且包括本領域技術人員已知的限制酶。可使用本領域的任何方法進行消化片段的分析，例如凝膠分析或southern印跡。
用直接探測確定多態性的等位基因通常包括使用反義序列，例如本發明第三方面所述的反義序列。這些反義序列可通過合成或切口平移來製備。可利用例如放射性標記、酶標記、氟標記、生物素-親和素標記適當標記反義探針，用於在隨後的例如southern印跡程序中進行觀察。標記的探針可與樣品DNA或樣品RNA反應，並且攜載互補序列的DNA或RNA區域將與探針雜交，從而使它們自身被標記。然後可通過例如放射自顯影來觀察被標記的區域。
上述方法可能需要擴增來自受試者的DNA樣品，這可以通過本領域已知的技術如PCR來實現。其它適合的擴增方法包括連接酶鏈式反應(LCR)、轉錄擴增、自動維持序列擴增和核酸鹼基序列擴增(NASBA)。後兩種方法都包括基於等溫轉錄的等溫反應，該方法分別以30或100∶1的比率分別產生單鏈RNA和雙鏈DNA作為擴增產物。
當需要確定受試者樣品中多重單核苷酸多態性或單倍型的存在時，可優選使用陣列(arrays)。該陣列可含有許多探針，每個探針設計為鑑定本發明的上述單核苷酸多態性中的一種或多種。
本發明的第二方面提供了INHBA基因本身的片段或與該片段互補的序列。這些片段可用於本發明第一方面的方法。它們可被分離或重組。
本發明的多核苷酸優選為DNA，或可以是RNA或其它的選擇。
「分離」是指已經充分純化到可以進行等位基因辨別的水平的多核苷酸序列。例如，分離的序列將基本不含任何其它DNA或蛋白質產物。這些分離的序列可通過PCR擴增、克隆技術或合成器上合成而得到。「重組」是指人工重組的多核苷酸。
優選片段的長度為至少10到1000個核苷酸長度，更優選為10到100個核苷酸長度。更優選地，片段的長度為10、20、30、40、50、60、70、80、或90個核苷酸長度。片段應當包括含多態性的序列。
根據本發明的第二方面，優選的片段是INHBA基因的互補序列，該互補序列與圖1給出的核酸序列的一部分雜交。這些「反義」序列可用作鑑定患有或易患骨損傷的男性或女性個體的藥劑。
本發明的反義序列包括與本發明的多態性等位基因(優選為變異等位基因)雜交的序列。這些序列用作探針。為用作探針，該反義序列應當與本發明的一種或多種多態性的一個等位基因優先結合，並且優選地包括本發明的一種或多種多態性的一個等位基因的精確的互補序列。因此，例如，當變體在多態性位點包括殘基「A」時，反義序列優選包括殘基「T」。可按照本領域已知的方法設計這些反義序列，其能夠特異雜交以檢測單個鹼基錯配。只要反義序列區別多態性等位基因的能力沒有受到損害，就本發明的目的而言這些反義序列的序列變異是可以接受的。優選地，反義序列在下面定義的嚴格條件下與所需的序列雜交。
與本發明相關的「嚴格條件」是指用於雜交方案的洗滌條件。通常地，洗滌條件應當是溫度和鹽濃度的組合，以使變性溫度比所研究的核酸的Tm計算值低約5到20℃。根據針對短寡核苷酸的華萊士法則(Wallace Rules)，在標準條件(1M NaCl)下以[4(C ×(G+C)+2(C ×(A+T)]計算20個鹼基或更少鹼基的核酸探針的Tm。對於長DNA片段而言，可採用最鄰近法，其組合了固體熱力學和實驗數據。可在預備實驗中容易地確定雜交的最佳鹽和溫度條件，在該預備實驗中使固定在濾紙上的DNA樣品與目的探針雜交，然後在不同的嚴格條件下洗滌。雖然PCR條件可能和標準條件不同，但Tm可作為引物預期相對穩定性的指導。對於大約14個核苷酸的短引物而言，使用約44℃到50℃的低退火溫度。根據所用引物序列的鹼基組成，溫度可以更高。
在本發明的第三方面，本發明上述方面的多核苷酸可以是載體的形式，以進行多核苷酸序列的體外或體內表達。多核苷酸可與一個或多個調控元件可操作連接，所述調控元件包括啟動子；啟動子的上遊或下遊區，例如調節啟動子活性的增強子；複製起點；適當的限制位點以克隆鄰近多核苷酸序列的插入片段；標記物如抗生素抗性基因；核糖體結合位點；RNA剪接位點和轉錄中止區；聚合位點；或其它任何促進多核苷酸序列克隆和/或表達的元件。當將本發明的兩種或多種多核苷酸插入到同一載體時，每個序列均可由其自身的調節序列來控制，或者所有序列可由相同的調節序列來控制。同樣地，每個序列可包括3』聚腺苷酸化位點。可將載體引入到微生物、酵母或動物DNA、染色體或線粒體中，或者載體也可作為質粒獨立存在。適合的載體是本領域技術人員已知的，包括pBluscript II、LambdaZap和pCMV-Script(Stratagene Cloning Systems，La Jolla(USA))。
適合的調節元件尤其是啟動子通常根據表達載體所插入的宿主細胞進行選擇。當使用微生物宿主細胞時，啟動子如乳糖啟動子系統、色氨酸(Trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或噬菌體λ啟動子系統是適合的。當使用酵母細胞時，優選的啟動子包括醇脫氫酶I或糖分解啟動子。在哺乳動物宿主細胞中，優選的啟動子來源於免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳突淋瘤病毒等。適用於不同宿主細胞的啟動子對於本領域技術人員是顯而易見的。
本發明的第四方面提供了用以表達多核苷酸的宿主細胞，其包括上述任一方面的多核苷酸。該宿主細胞可包括表達載體，或編碼所述多核苷酸的裸DNA。許多種宿主細胞可供選擇，既有真核細胞又有原核細胞。例子包括諸如大腸桿菌的細菌、酵母、絲狀真菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，優選無限增殖化的，諸如小鼠、CHO、HeLa、骨髓瘤或Jurkat細胞系、人細胞系和猴細胞系以及它們的衍生物。這些宿主細胞可用於藥物篩選系統以用於診斷或治療患有或易患骨損傷的男性或女性個體的藥劑。
將所述多核苷酸引入宿主細胞的方法通常取決於載體/DNA和靶細胞的性質，並包括本領域技術人員已知的方法。適合的已知方法包括融合、接合、轉染、轉導、電穿孔或注射，如Sambrook等人所述。
本發明的第五方面提供抗體，其與諸如第二方面的多核苷酸的抗原反應(任選地或特異性地)。可通過標準程序製備抗體。簡要地，將純化的抗體以足以引發免疫應答的量和時間間隔注射動物。既可直接純化抗體，也可從動物中獲取脾細胞。然後使細胞和無限增殖細胞系融合併篩選得到抗體分泌物。抗體可用於篩選DNA克隆文庫以得到分泌抗原的細胞。然後可對這些陽性克隆測序。優選地，檢測和/或用於產生特定抗體的抗原包括第二方面的多核苷酸或片段。
可用本領域已知的方法，例如使用與第一抗體結合的第二抗體，或使用配體，來幫助檢測抗體和抗原的結合。免疫分析包括免疫螢光分析(IFA)和酶聯免疫吸附分析(ELISA)，並且可用免疫印跡法檢測抗原的存在。例如，當使用ELISA時，所述方法可包括抗體與底物結合，使結合的抗體與含抗原的樣品接觸，使上述和結合於可檢測部分(通常是酶，如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酯酶)的第二抗體接觸，使上述與酶的底物接觸，最後觀察顏色變化，其顯示樣品中存在抗原。
本發明的第六方面提供了含本發明第二方面的多核苷酸的轉基因非人動物。轉基因非人動物可用於分析單核苷酸多態性及它們的表型作用。在轉基因非人動物中通常用如下方法表達本發明的多核苷酸將多核苷酸與啟動子序列和/或增強子序列可操作連接，優選產生前面所述的載體，然後用顯微注射技術將載體引入宿主動物的胚胎幹細胞。然後應當將轉基因構建體與宿主的內源基因進行同源重組。可通過監控標記基因的表達來選擇含所需多核苷酸序列的這些胚胎幹細胞，並將這些胚胎幹細胞用於產生非人轉基因動物。優選的宿主動物包括小鼠和其它嚙齒類動物。
在優選的實施方案中，轉基因非人動物可包括第二方面的反義核酸序列。在轉基因非人動物中反義序列的表達可用於確定這些序列對高的骨礦物質密度的影響，或用於中和動物體內基因變體的有害影響。優選地，宿主動物易患骨損傷。該病可以是自然發生的，或是人工誘導的。
本發明的第七方面還提供了第六方面的轉基因非人動物在篩選用於確定患有或易患骨損傷的男性或女性個體的藥劑中的應用。
在一些優選的實施方案中，例如，當骨損傷易感性為人工誘導時，將調節轉基因非人動物以使其不再表達相應的內生INHBA基因。這些動物可被稱為「基因敲除的動物」。在某些情況下，調節內源基因的表達，或在特定組織裡表達本發明的多核苷酸可能是適合的。如果基因表達在所有組織裡被取消或被誘導時，該方法消除了可行性的(viability)問題。
本發明的第八方面提供了篩選用於確定患有或易患骨損傷的男性或女性個體的藥劑的方法，所述方法包括使假定藥劑與本發明第二方面的多核苷酸接觸，並監控它們之間的反應。可能的藥劑是與本發明的變體和與參考等位基因進行不同反應的藥劑。參考等位基因可以是野生型等位基因(即，沒有多態性)。可以預想，通過使假定藥劑與包括本發明的多核苷酸或者蛋白的宿主細胞或者轉基因動物接觸可以實施本方法。假定藥劑包括本領域技術人員已知的藥劑，並且包括化學物質或者生物化合物，諸如與第一方面的編碼序列互補的反義多核苷酸序列，或與諸如第二方面的蛋白質或蛋白質片段相結合的多克隆或單克隆抗體。它們還可用於確定骨損傷易感性，或用於診斷、預後或治療相關病症。
本發明的第九方面提供了適於PCR反應的引物序列，以用於確定本文描述的多態性的存在或缺失。適合的序列應當包括至少18個核苷酸鹼基，並可以是選自如下的一個或多個序列任何與INHBA基因雜交的序列。引物可與INHBA序列100％互補，或與INHBA序列80％或更高程度的互補。序列優選為18至25個鹼基長度。
在另一方面，本發明提供了試劑盒，以用於診斷患有或易患骨損傷的男性或女性個體，該試劑盒包括用於確定本文描述的多態性存在或缺失的藥劑。試劑盒的藥劑可包括多核苷酸，最優選為反義序列，如第二方面的反義序列，以用作探針或引物；本發明第八方面的序列；與INHBA多肽的等位基因結合的抗體，如第五方面的抗體；或用於檢測INHBA多肽存在的限制酶。優選地，試劑盒還包括反應的檢測裝置，例如核苷酸標記檢測裝置、標記二抗或尺寸檢測裝置。在又一優選的實施方案中，藥劑可固定在底物如陣列上，如WO95/11995所述。試劑盒還包括顯示受試者基因型與高骨礦物質密度之間關係的裝置。這種裝置可以是圖表的形式或助視器的形式，顯示INHBA基因的一種或多種等位基因的存在與骨損傷的易感性有關。
本發明的第十一方面提供了診斷，並隨後用於對本文描述的多態性的任一診斷的方法而預防和/或治療骨損傷。可用任何方法進行預防和/或治療，包括用多態性取代等位基因。可通過添加等位基因或部分等位基因用骨損傷無關的INHBA基因的多肽進行取代。
每個方面的優選實施方案適用於本發明的其它方面，在細節上作必要的修正。
現在將通過非限定實施例結合下述的圖1描述本發明，其中圖1顯示相關單核苷酸多態性位點的核苷酸序列實施例1通過PyrosequencingTM進行雙等位基因多態性的基因型分型在雙等位基因多態性兩側的任一側設計用於PCR擴增的一對寡核苷酸，以產生大小在50bp和350bp之間的產物。設計測序寡核苷酸，其中止於距多態性位點5』或3』的30bp內。用5』-生物素標記所有用於產生測序引物互補鏈的擴增寡核苷酸(見表2)。
表2 PSQ分析寡核苷酸和PCR退火溫度
使用PCR擴增寡核苷酸通過PCR擴增基因分型的樣品。每個反應使用在最終體積10μl中，20ng DNA(乾重)、0.6單位的AmpliTaqGoldTMDNA聚合酶、1X PCT緩衝液II、2.5mM MgCl2、1mM dNTP和10pmol的每種PCR寡核苷酸。所用的PCR循環條件為95℃12分鐘，如下進行45次循環94℃15秒、TA15秒、72℃30秒和72℃5分鐘。
擴增後，分離與測序引物互補的每個PCR模板的DNA鏈，以待高溫酸測序(PSQ)。為此，1)將50μl的Dynabead溶液(2mg/mlDynabeads、5mM Tris-HCl、1M NaCl、0.5mM EDTA、0.05％的吐溫20)添加到PCR產物中，並在65℃振蕩15分鐘，2)用磁體將模板轉移至50μl的0.5M NaOH中1分鐘，3)用磁體將模板轉移至100μl的1X退火緩衝液(20mM Tris-乙酸鹽，5mM MgAc2)中1分鐘，和4)用磁體將模板轉移至含15pmol測序寡核苷酸的45μl 1X退火緩衝液中(表4)。
分離模板後，如下使測序寡核苷酸退火至模板上在80℃變性2分鐘，然後冷卻到室溫10分鐘。在PSQ96TM(Pyrosequencing AB)上通過PyrosequencingTM對每個標記物/樣品組合進行測序/基因分型(圖3)。基因分型結果儲存於PSQ oracle資料庫中以待統計分析。
實施例2
INHBA基因多態性以確定骨質疏鬆性骨折的遺傳易感性使用程序遺傳(用於不確定單倍型遺傳的遺傳/不平衡檢驗的概括。Clayton D.Am J Hum Genet 1999 Oct；65(4)1170-7)對一組譜系檢驗INHBA02SNP的遺傳畸變(transmission distortion)，該譜系起初被收集用於骨礦物質密度的全基因組連鎖分析。疾病狀況(affection status)定義為年齡在五十歲以上的女性所有自己報導的骨折。結果顯示在表3中。
表3 女性INHBA02的遺傳畸變，及年齡＞50歲的女性自己報導的骨折
這些結果表明非常顯著的傳遞畸變，說明很少的普通等位基因(「A」等位基因)與年齡大於50歲的女性增加的骨折危險有關。
實施例3SNP與骨礦物質密度的聯繫使用來自一組譜系的2,812位個體的基因型通過邏輯回歸檢測INHBA02 SNP與骨礦物質密度(BMD)的聯繫，該譜系起初被收集用於骨礦物質密度的全基因組連鎖分析。對腰脊柱的調整BMD和未調整的BMD的測量如下所示。
INHBA02的等位基因1(A)與男性中未調整的腰脊柱BMD(p＝0.034，影響程度＝-2.1％)和調整的腰脊柱BMD(p＝0.035，影響程度＝-0.121)的顯著下降相關。
權利要求
1.一種確定骨損傷易感性的方法，包括確定男性或女性個體中INHBA基因的至少一個等位基因在第39位多態性的存在或缺失。
2.如權利要求1所述的方法，其中的多態性是核苷酸鹼基A的存在。
3.一種分離或重組的多核苷酸，包括INHBA序列的從至少10到1000個連續的核苷酸鹼基，所述序列包括在第39位的核苷酸。
4.如權利要求3所述的分離或重組的多核苷酸，包括INHBA序列的從至少10到100個連續核苷酸的鹼基，所述序列包括在第39位的核苷酸。
5.如權利要求3或4所述的多核苷酸，其中在第39位的核苷酸不是核苷酸G。
6.如權利要求5所述的多核苷酸，其中在第39位的核苷酸是核苷酸A。
7.載體，包括權利要求3到6任一項的多核苷酸。
8.宿主細胞，包括權利要求3到7任一項的多核苷酸或載體。
9.抗體或抗體片段，其與權利要求3到6任一項的序列優先結合。
10.轉基因的非人動物，包括權利要求3到8任一項的多核苷酸序列、載體或宿主細胞。
11.如權利要求1或2所述的方法，其包括權利要求3到9任一項的多核苷酸、抗體或抗體片段的應用。
12.權利要求10的轉基因非人動物在篩選用於確定患有或易患包括骨折的骨損傷的男性或女性個體的藥劑中的應用。
13.篩選藥劑的方法，所述藥劑用於確定患有或易患骨損傷的男性或女性個體，所述方法包括使假定藥劑與權利要求3到6任一項的多核苷酸接觸，並監控它們之間的反應。
14.多核苷酸，其包括至少18個鹼基的核酸序列，該核酸序列通過PCR可用於擴增含39位的INHBA基因的一部分。
15.試劑盒，用於診斷患有或易患骨損傷的男性或女性個體，所述試劑盒包括用於確定至少一個等位基因在39位的多態性的存在或缺失的藥劑。
16.如權利要求15所述的試劑盒，其中的藥劑包括權利要求3到6任一項的多核苷酸，權利要求9的抗體，用於消化權利要求3到6任一項的多核苷酸的限制酶，或權利要求14的多核苷酸引物。
17.如權利要求15或16所述的試劑盒，其中的藥劑是通過權利要求13的方法鑑定的。
18.診斷和預防和/或治療骨損傷的方法，該方法包括1)確定男性或女性個體中INHBA基因的至少一個等位基因在第39位多態性的存在；和2)給個體施用預防和/或治療骨損傷的藥劑。
全文摘要
本發明涉及β－A(INHBA)抑制素基因中新型核苷酸多態性的鑑定，以及該核苷酸多態性在診斷骨損傷易感性，特別是骨折易感性中的應用。本發明還提供了含本發明的多核苷酸的轉基因非人動物，以及用於診斷和/或確定骨損傷易感性的方法和試劑盒。
文檔編號C12N15/63GK1813071SQ200480018514
公開日2006年8月2日 申請日期2004年4月29日 優先權日2003年4月29日
發明者西蒙·託馬斯·班尼特, 馬克·愛德華茲 申請人:奧克薩根有限公司