氧化性應激因子的水平降低的製作方法

2023-12-09 01:17:26

專利名稱：氧化性應激因子的水平降低的製作方法
技術領域：
本發明涉及一或多種細菌菌株在降低哺乳動物包括人體內氧化性應激因子(oxidative stress factors)水平中的應用。
背景技術：
氧化性應激因子是主要導致機體內氧化強化狀態(prooxidant)的多種分子的常用術語。所述分子，如IL-1、IL-6、ROS(反應性氧屬)、IL-8、8-異前列腺素(isoprostaglandin)、VCAM(脈管細胞粘附分子)以及ICAM(細胞內粘附分子)在前炎性和炎性狀態下水平升高。
所述氧化性應激因子也稱為炎性標誌物，但後者還包括所謂的二級分子，其由所述氧化性應激因子啟動，如急性期蛋白。
與其它氧化性應激因子一樣，ROS由單核細胞和淋巴細胞產生。其特有水平的正常產生可以維持體內內環境的自穩。
氧化性應激因子的水平升高是急性和慢性炎症的典型症狀。在慢性炎症中，老化的不斷加深帶來動脈硬化症和癌症的危險。慢性炎性狀態可以由例如吸菸過度或病毒和細菌的慢性感染引起。另一組慢性炎性疾病包括自身免疫病如風溼性疾病和牛皮癬。
慢性炎性病人目前接受抗生素、高劑量維生素或其它藥物的治療。抗生素的使用由於某些原因應予以避免，藥物的使用常常帶來不必要的負作用。風溼性疾病則使用例如有效而昂貴的布洛芬(ibuprofen)治療，它有胃部負作用。對牛皮癬病人而言目前尚無對症藥物。
現有技術以Otsuka製藥有限公司的名義申請的EP 0649603A1涉及一種抗氧化食物，其包括內含天然含鎂物質(如茶葉)之食物經由微生物如植物乳桿菌發酵而產生的產物。選擇上述細菌是由於其催化活性以及超氧化物歧化酶樣活性，它們在機體內產生抗氧化活性，但僅在鎂存在時有作用。
Nenonen,MT.等，英國風溼病學雜誌，1998年3月，37(3)，第274-81頁描述了未煮過的富含乳桿菌的絕對素食食物對類風溼病人的影響。有一半的病人出現諸如噁心和腹瀉等副作用，並因此中止了實驗，但另一半病人的症狀得到不同程度的緩解。據推測每天食用乳桿菌可能還有利於針對性地測定類風溼性關節炎。
Seikenkai的US 4,314,995涉及一種對患有傳染病所致感染或炎症的病人進行治療的方法，其包括給與至少一種乳桿菌，其有不同於已知乳桿菌的營養需求，即它具有在一種特異性低營養培養基中生長的能力。該發明提到了5種不同的乳桿菌菌株。
國際食品微生物學雜誌，42(1998)29-38，公開了每天攝入400ml含燕麥的刺玫果(rose-hip)飲料(由微生態製劑植物乳桿菌發酵產生)達3周後，短鏈脂肪酸(SCFA)乙酸和丙酸的糞便中總濃度有顯著增長。這種據稱與基礎飲食無關的增長可解釋為所攝入的微生態調節菌株導致的SCFA產生，或解釋為該菌株對結腸中其他SCFA生產菌株的刺激或抑制。
發明詳述本發明涉及一種於腸道中產生增加量丙酸之細菌菌株的應用，其用於製備可降低哺乳動物包括人類中氧化性應激反應水平的藥物。
本發明尤其涉及一種於腸道中產生增加量丙酸之細菌菌株的應用，其用於製備可降低哺乳動物包括人類中IL-6、ROS、以及單核細胞對內皮細胞之粘附因子的水平的藥物。
氧化性應激因子，如白細胞介素1和白細胞介素6等細胞因子、ROS、以及單核細胞對內皮細胞之粘附分子的高水平是前炎性和炎性狀態的特徵。
於腸道中產生增加量丙酸之細菌菌株優選乳桿菌屬或丙酸桿菌屬的一種菌株。
根據本發明的一個優選實施方案，所述細菌菌株是植物乳桿菌。植物乳桿菌的優選菌株是植物乳桿菌299v，其已保藏在DSM，德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen von Zellkulturen GmbH,Braunschweig，德國，錄入號DSM9843)。
本發明還涉及一種於腸道中產生增加量丙酸之細菌菌株的應用，其用於製備可預防和/或治療慢性炎性疾病的藥物。可根據本發明治療的慢性炎性或前炎性疾病可由不同細菌如肺炎衣原體和幽門螺桿菌，或毒性物質如菸鹼所誘導。例如已證實，連續1個月每天攝入400ml由植物乳桿菌DSM9843(5×107cfu/ml)發酵產生的含燕麥之刺玫果飲料Pro Viva後，抗幽門螺桿菌的抗體量減少。
根據本發明的一個優選應用是用於預防和/或治療自身免疫病如類風溼性疾病和牛皮癬。
附圖簡述

圖1顯示用發酵的燕麥粥處理後，單核細胞對內皮細胞之粘附的減少。
圖2顯示用發酵的燕麥粥處理後，單核細胞對受刺激的內皮細胞的粘附的減少。
圖3顯示用發酵的燕麥粥處理之前和之後，單核細胞中ROS的產生。
實驗以下實驗旨在測定給與能在腸道中產生增加量丙酸之微生態調節菌株對已有上述因子之水平升高的受試者血液中氧化性應激因子水平的影響。連續3周或6周每人每天給與25ml濃燕麥粥，其用植物乳桿菌DSM9843(含1×109cfu/ml)發酵產生。
方法外周血單核細胞(PBMC)PBMC經密度梯度離心從加了肝素的血液中分離。所述血液用PBS稀釋。將25ml稀釋的血液迅速加在15ml Ficoll-Paque液面上，離心(1900rpm,40分鐘，22℃)。將混合的單核細胞層吸出並用PBS洗滌。計數分離出的PBMC，並分為兩部分。其一用於測定細胞內ROS的產生，另一用於粘附試驗。單核細胞製劑由約30％單核細胞和70％淋巴細胞組成。
內皮細胞的分離和培養人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)用膠原酶消化臍帶而得到，如Jaffe,E.A.等，來源於臍靜脈的人內皮細胞的培養，臨床研究雜誌，1973；52:2745-2756所述。簡言之，用PBS灌注臍帶靜脈以除去血細胞，充之以0.1％膠原酶(Ⅰa型)，於37℃C靜置10分鐘。在內皮細胞(EC)懸浮液中添加FBS，胎牛血清，並於1200rpm離心10分鐘。於37℃,5％CO2的一定溼度空氣環境中，在M-199培養基中培養EC。該培養基還包含100U/ml青黴素，100μg/ml鏈黴素，2.5μg/ml兩性黴素B,20mM HEPES,20％FBS和50μg/ml內皮細胞生長添加劑(ECGS)。HUVEC在包被了明膠的25cm2燒瓶中培養。每2天更換一次培養基，直至細胞融合(3-5天)。HUVEC純度用coble-stone形態學(常用於靜息態EC和Ⅷ因子的染色)評估。用0.01％胰酶/EDTA使融合的HUVEC脫壁，所述胰酶/EDTA用FBS拮抗。
試驗1．對ROS產生的影響在該試驗中，向6名因吸菸過度而具有高水平反應性氧屬ROS的健康志願者給與由植物乳桿菌DSM9843發酵產生的濃燕麥粥，評估該給藥的影響。平均年齡是32歲，體重指數為26.6kg/m2。每人每天給與25ml，共3周。
收集6個志願者的血液。如上述經Gradisol L密度梯度離心分離外周血單核細胞(PBMC)。
對細胞氧化的分析是基於反應性氧屬(ROS)介導的轉化反應，該轉化反應將以2,7』-二氯螢光素二乙酸酯的形式裝載於細胞中的非螢光性2,7』-二氯螢光素(DCFH)轉化為螢光性DCF，其中該DCF的螢光發射能力增強，反映出氧化壓力增加。將新鮮分離的、包含約30％單核細胞和70％淋巴細胞的PBMC重新懸浮於磷酸鹽緩衝液(PBS)，然後與20μM2』,7-二氯螢光素在37℃避光保溫30分鐘。然後用PBS洗滌細胞。螢光基團2』,7-二氯螢光素(由其非螢光性前體通過過氧化物氧化反應生成)的相對螢光強度在細胞螢光測定試驗(FACScan,Becton Dickinson)中檢測。在流式細胞分析期間，單核細胞和淋巴細胞憑藉前向散射(FCS)和側向散射(SCC)分辨。結果以平均螢光強度表示，見下表1。
表1受試者用植物乳桿菌299v處理之前和之後，其分離的單核細胞和淋巴細胞的反應性氧屬(ROS)的產生。
平均螢光強度(計數)單核細胞 淋巴細胞
上述數據顯示，除了2號以外的其他受試者ROS的產生均下降，其中2號為無反應者。
試驗2．布洛芬對ROS產生的影響，一項對比研究為了研究布洛芬使ROS降低的機制，對參與試驗1的6位受試者每天給與500mg的一種丙酸衍生物和一種已知抗炎藥布洛芬，共3周。初步數據表明，單核細胞和淋巴細胞以完全相同於上述研究中對植物乳桿菌299v的方式應答。
試驗3．對ROS產生的影響在另一組10位健康志願者(過度吸菸者)中重複試驗1，他們在6周內給與濃燕麥粥。以平均螢光強度表示的給與濃縮燕麥粥之前和之後的結果示於圖3，圖中顯示了給與乳桿菌299v株之前和之後正常靜息態單核細胞中ROS的產生。
試驗4．粘附試驗如下檢驗試驗3中10位健康志願者的PBMC的粘附。
將傳至第3代的HUVEC培養於明膠包被的24孔板中。單核細胞融合後，在實驗前18小時的時候用含抗生素、20％FBS和20mM HEPES而無ECGS的培養基199更換培養液。部分細胞用TNFα(500μ/ml)預處理18小時。新鮮分離的PBMC以3-9×105/ml重新懸浮於含有20mM HEPES的培養基199。用PBS洗滌HUVEC，然後加入PBMC(每孔0.5ml)，一起保溫30分鐘。移出PBMC懸浮液。用PBS洗滌HUVEC，將孔中填滿福馬林，根據Pappenheim用May-Grunwald和Giemsa溶液染色，在10個不同的區域計數粘附的單核細胞。數據表示為所加的單核細胞的百分率。所有試驗均做雙份。
結果示於圖1和圖2，圖1顯示給與乳桿菌299v株之前和之後單核細胞對未刺激的HUVEC的粘附，圖2顯示給與乳桿菌299v株之前和之後正常靜息態單核細胞對TNFα刺激的HUVEC的粘附。
試驗5．對白細胞介素6(IL-6)的影響檢驗試驗3之10位健康志願者的PBMC中濃縮燕麥粥對IL-6水平的影響。
IL-6水平用Boehringer Mannheim的h-白細胞介素-6 ELISA試劑盒測定，其為一個光度測定型酶免疫試驗，用於體外定量測定鏈親和素包被的微滴板中的人白細胞介素-6(hlL-6)。結果見下表2。
表2
試驗6．丙酸誘導的氧化性應激反應的降低如上述分離人單核巨噬細胞，在直徑35mm的平皿中的2ml RPMI-1640(10％胎牛血清，50mg/ml青黴素/鏈黴素，2mM穀氨醯胺)中預培養6×106個細胞。然後加入10μM丙酸，將細胞於37℃培養4小時。然後將培養基更換為新鮮培養基，用1.0ng/ml LPS(脂多糖)刺激細胞，以激發氧化強化性應激反應。24小時後，移出培養液，經蒸發濃縮10倍。有丙酸和沒有丙酸(對照細胞)的氧化應激反應用Cayman Chemical的8-Isoprostane EIA試劑盒評估。
3次8-isoprostane水平降低的實驗中，表示為平均值的氧化應激反應的降低為47％。
試驗7．牛皮癬病人中氧化應激因子的降低6位牛皮癬復發病人志願參與研究。病人至少6周不接受藥物治療，然後開始給與以植物乳桿菌DSM9843發酵產生的濃縮燕麥粥(含1×109cfu/ml)，每位病人每天25ml，共6周。
如上述，分離上述病人在給與乳桿菌之前，以及剛剛完成乳桿菌給藥之後的外周血單核細胞(PBMC)。測定以下氧化應激因子ROS，以PMA，佛波醇miristate乙酸酯，(100ng/ml)(其刺激細胞進行氧化應激反應)刺激之前和之後的值；粘附因子，單核細胞對內皮細胞的粘附；以及IL-6。以如上述相同的方法獲得的結果見下表3。
表3牛皮癬病人給與乳桿菌299v株之前和之後氧化性應激因子的降低
*mfi=平均螢光強度對接受6周治療的6位病人中的5位進行臨床評估顯示，發癢顯著減少。除了皮膚患處被分為更小的區域；患處內的降低也有10％-27％的水平差異。
結論本文說明，由結腸微生物發酵而在大腸部位產生的丙酸酯可能具有抗炎作用。因此認為，可在腸道中產生更多量丙酸的細菌菌株將緩解與機體內不同慢性炎性疾病相關的前炎性狀態。
權利要求
1．一種應用，其為能在腸道中產生增加量丙酸之細菌菌株在製備能降低哺乳動物包括人之氧化性應激因子水平的藥物中的應用。
2．權利要求1的應用，其中所述細菌菌株是乳桿菌屬或丙酸桿菌屬的菌株。
3．權利要求1或2的應用，其中所述細菌菌株是植物乳桿菌。
4．植物乳桿菌299v，保藏號DSM9843，的權利要求1至3中任一項的應用。
5．權利要求1至4中任一項的應用，其用於降低血液中的IL-6水平。
6．權利要求1至4中任一項的應用，其用於降低血液中的反應性氧屬的水平。
7．權利要求1至4中任一項的應用，其用於降低單核細胞對內皮細胞的粘附。
8．權利要求1至4中任一項的應用，其用於製備預防和/或治療慢性炎性疾病的藥物。
9．權利要求8的應用，其用於預防和/或治療風溼性疾病。
10．權利要求8的應用，其用於預防和/或治療牛皮癬。
全文摘要
本發明涉及一種細菌菌株在生產用於使氧化應激因子水平降低的藥物中的應用,所述菌株優選乳桿菌屬或丙酸桿菌屬中可在腸道中產生增加量的丙酸的菌種,所述因子如哺乳動物包括人體內的IL－6、反應性氧屬(ROS)、以及粘附分子。所述藥物可用於預防和/或治療慢性炎性疾病如風溼性疾病和牛皮癬。
文檔編號A61P43/00GK1320039SQ99811528
公開日2001年10月31日 申請日期1999年10月1日 優先權日1998年10月1日
發明者馬雷克·納魯澤威茨 申請人:普羅比公司