一種銀‑溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜的製作方法
2023-12-09 02:08:31
本發明涉及一種銀-溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜，屬於抗菌材料領域。
背景技術：
隨著科技的發展和社會的進步，人們越來越關注自身生存環境的健康狀況，而由病原微生物所致的傳染病一直是人類健康的主要威脅之一。抗菌薄膜材料是指在包裝材料的內部或者表面組裝不同的抗菌劑，從而使材料自身具有抑制微生物生長繁殖的性能。它不但具有衛生自潔功能，而且能夠有效防止細菌交叉感染，因此，抗菌薄膜在食品包裝、容器內表面、抗菌貼膜以及生物材料、醫療器材表面等包裝行業中具有廣泛的開發應用前景，可極大降低人們感染細菌的機率，提高生存環境的質量。
抗菌薄膜不僅要具備良好的穩定性、力學強度和加工性能等，也要有良好的抗菌功能。按加入抗菌劑的不同，抗菌薄膜可以分為無機抗菌薄膜、有機抗菌薄膜、天然抗菌薄膜、高分子抗菌薄膜。與有機抗菌材料相比，無機抗菌材料具有光譜、耐久、安全的特點，其中銀系抗菌材料已成為目前研究最為廣泛的無機抗菌材料。
銀納米簇是指由幾個到幾十個銀原子所組成的團簇，其粒徑一般為幾納米，尺寸接近銀電子的費米波長，被認為是連接金屬原子和納米粒子(2～100nm)的橋梁。由於銀納米簇的表面效應和量子尺寸效應，其抗菌作用具有強度大、速度快和滲透力強等特點，且銀納米簇的滲透力很強，具有普通銀系抗菌材料無法比擬的效果。銀納米簇可在幾分鐘內迅速消滅與它接觸的650多種細菌，在超低濃度下也能有效的殺死細菌。銀納米簇通常以蛋白質作為穩定劑，在抗菌材料領域具有非常廣闊的應用前景。溶菌酶是一種常見的蛋白質，在醫學上可作為一種天然抗感染物質，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。溶菌酶主要通過破壞細胞壁上的β-1,4-糖苷鍵，使細胞壁水解可起到強力的殺菌作用。此外，溶菌酶還可以直接與帶負電荷的病毒蛋白直接進行結合，從而使病毒失活。因此，溶菌酶能有效地治療並且預防炎症的發生，對人體的健康發揮著很大作用。
目前，基於銀納米簇的抗菌薄膜材料的製備形式主要有以下兩種方法：一種是將納米銀抗菌劑與樹脂一起，經過塑料的成型工藝而成型，此種方法存在對抗菌劑的熱穩定性要求較高，且抗菌劑用量較大的缺點，特別是對於銀抗菌劑來說，需要考慮其成本問題；另外一種是採用塗覆、噴塗等方法在已經成型的薄膜上固定一層銀抗菌層，此種方法需要解決的主要問題是抗菌劑和基體材料的親合力較低，從而會造成抗菌劑的吸附效率低，易從載體表面脫落等問題。多巴胺是一種生物神經遞質，在水溶液中，它可以在溶解氧存在的條件下發生氧化交聯反應，從而形成聚多巴胺複合薄層緊緊附著在材料表面。聚多巴胺表面攜帶豐富的氨基基團，從而可以通過交聯劑實現與抗菌材料的交聯，形成單層的抗菌薄膜，可極大的提高抗菌劑和載體材料的親和力，並有效降低抗菌薄膜成本。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是提供一種銀-溶菌酶納米簇，並按如下方法製備：以溶菌酶作為穩定劑，以agno3作為銀源，以nabh4作為還原劑，在室溫下反應一定時間獲得。
在本發明的一種實施方式中，所述銀-溶菌酶納米簇按如下方法製備：每20～100mg的溶菌酶溶液中加入0.01～0.1mmolagno3，邊攪拌邊調節溶液ph至8～12，加入與agno3摩爾比為0.005～0.15：1的nabh4溶液50～200μl，室溫反應1～5h。
本發明的第二個目的是提供一種銀-溶菌酶納米簇的製備方法，所述方法是向溶菌酶溶液中加入agno3，調節溶液ph，隨後加入nabh4溶液，室溫反應一定時間。
在本發明的一種實施方式中，所述方法以10～100:0.5～9的質量比向溶菌酶溶液中加入agno3，邊攪拌邊加入naoh調節溶液ph至8～12，再逐滴加入nabh4(0.01mol/l)溶液50～200μl，室溫反應1～5h。
在本發明的一種實施方式中，所述方法是向10ml2～10g/l溶菌酶中加入0.01～0.1mmolagno3，在500～1000rpm攪拌條件下加入naoh溶液調節溶液ph值為8.0～12.0，隨後逐滴加入nabh4(0.01mol/l)溶液50～200μl，在室溫下反應1～5小時。
本發明的第三個目的是提供一種銀-溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜，是按如下步驟製備獲得：(1)將基底材料浸泡於多巴胺的緩衝液中反應一定時間得到多巴胺修飾的薄膜材料；(2)將經步驟(1)處理後的薄膜材料浸泡於戊二醛溶液中反應一定時間，得到戊二醛修飾的薄膜材料；(3)將戊二醛修飾的納米薄膜所述浸入銀-溶菌酶納米簇溶液中吸附一定時間。
在本發明的一種實施方式中，所述基底材料包括食品包裝材料。
在本發明的一種實施方式中，所述基底材料包括聚乙烯pe、聚苯乙烯ps、聚乳酸pla。
本發明的第四個目的是克服現有抗菌薄膜製備技術的不足，提供所述銀-溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜的製備方法，包括如下步驟：
(1)將基底材料用乙醇清洗乾淨後吹乾，浸泡於含0.1～10mg/ml多巴胺的tris-hcl緩衝溶液中，攪拌1～20小時，取出後用去離子水衝洗後烘乾，得到聚多巴胺修飾的納米薄膜；
(2)將聚多巴胺修飾的基底材料浸泡於1～50g/l的戊二醛溶液中，攪拌1～10小時，使戊二醛其中一個羰基與多巴胺的氨基相結合，取出後用去離子水衝洗後烘乾，得到戊二醛修飾的薄膜材料；
(3)將戊二醛修飾的納米薄膜浸入銀-溶菌酶納米簇溶液中，吸附1～5小時後取出，用去離子水衝洗後烘乾，得到銀/溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料。
在本發明的一種實施方式中，tris-hcl緩衝溶液濃度為0.01～0.5mol/l，ph值為8.0～10.0。
本發明還提供所述銀-溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜的應用，所述應用包括：用於抗菌食品包裝，容器內表面、生物材料表面、醫療器材表面材料的製備及抗菌貼膜方面的應用。
有益效果：本發明所製備的銀/溶菌酶納米簇修飾的高效廣譜抗菌薄膜相比於單獨使用銀或溶菌酶修飾的抗菌薄膜，能夠產生協同作用，抑菌性能顯著提高，沙門氏菌的抑菌率在51.7～100.0％；金黃色葡萄球菌的抑菌率在69.5～100.0％。
附圖說明
圖1為銀-溶菌酶納米簇的螢光光譜測定結果；自下向上依次為添加50μl，75μl，100μl，125μl，150μlnabh4對應的螢光光譜測定結果；
圖2為不同抗菌膜在抑菌時間24小時下抑制沙門氏菌生長的效果；
圖3為不同抗菌膜在抑菌時間24小時下抑制金黃色葡萄球菌生長的效果；
圖4為不同抗菌膜在抑菌時間24小時下抑制沙門氏菌生長的效果；
圖5為不同抗菌膜在抑菌時間24小時下抑制金黃色葡萄球菌生長的效果。
圖6為不同抗菌膜在抑菌時間24小時下抑制沙門氏菌生長的效果；
圖7為不同抗菌膜在抑菌時間24小時下抑制金黃色葡萄球菌生長的效果。
具體實施方式
沙門氏菌抑菌效果檢測：
取bpy液體培養基，活化沙門氏菌(10小時)。活化完成後，將菌懸液生理鹽水進行稀釋，得到10-1-10-8濃度的菌懸液，將一定濃度的菌懸液加入一次性培養皿(本實驗中所有培養皿均在無菌條件下進行處理)中，每個培養皿傾倒10ml左右固體培養基，等培養基冷卻凝固後，放入培養箱儲藏。24小時後進行平板計數，比較不同條件製備材料的抗菌能力。
抑菌率的計算公式為：
金黃色葡萄球菌抑菌效果檢測：
取7.5％肉湯培養基，活化金黃色葡萄球菌(20小時)。活化完成後，將菌懸液用生理鹽水進行稀釋，得到10-1-10-8濃度的菌懸液，將一定濃度的菌懸液加入一次性培養皿(本實驗中所有培養皿均在無菌條件下進行處理)中，每個培養皿傾倒10ml左右固體培養基，等培養基冷卻凝固後，放入培養箱儲藏。24小時後進行平板計數，比較不同條件製備材料的抗菌能力。
抑菌率的計算公式為：
實施例1
銀-溶菌酶納米簇的製備方法步驟如下：將溶菌酶溶解於10ml水中，濃度為2～10mg/ml,隨後加入0.01～0.1mmolagno3，在500～1000rpm攪拌條件下加入naoh溶液調節溶液ph值為8.0～12.0，再分別加入0.01mol/l的nabh4溶液50μl、75μl、100μl、125μl及150μl，於相同條件下室溫反應1小時。選定波長為450nm作為激發光來研究溶菌酶包覆的銀納米簇的螢光特性，發射波長從500nm到700nm，激發和發射狹縫為5nm，電壓為高壓。銀納米簇的螢光光譜測定結果如圖1所示，反應1小時後，樣品螢光發射峰位於650nm，表明了銀納米簇的生成。隨著nabh4加入量的增加，樣品螢光強度逐漸增強，且逐滴加入更適宜納米簇的穩定生成。
實施例2
一種高效廣譜銀/溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜製備方法，具體實施的步驟如下：
(1)將聚偏二氯乙烯保鮮膜材料用乙醇清洗乾淨後吹乾，浸泡於含有1mg/ml多巴胺的ph＝8.5的0.05mtris-hcl緩衝溶液中，攪拌18小時，取出後用去離子水衝洗2分鐘後烘乾，得到聚多巴胺修飾的納米薄膜。
(2)將聚多巴胺修飾的基底材料浸泡於10g/l的戊二醛溶液中，攪拌2小時，使戊二醛其中一個羰基與聚多巴胺的氨基相結合，取出後用去離子水衝洗2分鐘後烘乾，得到戊二醛修飾的薄膜材料。
(3)將戊二醛修飾的納米薄膜浸入實施例1製備的銀/溶菌酶納米簇溶液中，吸附1小時後取出，用去離子水衝洗2分鐘後烘乾，得到銀/溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料。
對製備獲得的銀-溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料抑菌效果進行檢測，結果如圖2～3所示，抑菌24小時,本發明的抗菌薄膜對沙門氏菌抑菌率達到56.7％(圖2)，相對於單獨納米銀抗菌薄膜的抑菌率提高了82.9％。對金黃色葡萄球菌抑菌率達到89.1％，相當於單獨的納米銀抗菌薄膜的抑菌率提高了176.7％(圖3)。表明銀-溶菌酶納米簇相比於單獨使用銀或溶菌酶能夠產生協同作用，當多巴胺濃度控制在1mg/ml時應用銀-溶菌酶納米簇製備的抗菌薄膜製備的抗菌薄膜表現出較好的抗菌效果。
實施例3
一種高效廣譜銀/溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜製備方法，具體實施的步驟如下：
(1)將聚偏二氯乙烯保鮮膜材料用乙醇清洗乾淨後吹乾，浸泡於含有5mg/ml多巴胺的ph＝8.5的0.05mtris-hcl緩衝溶液中，攪拌18小時，取出後用去離子水衝洗5分鐘，得到聚多巴胺修飾的納米薄膜。
(2)將聚多巴胺修飾的基底材料浸泡於10g/l的戊二醛溶液中，攪拌2小時，使戊二醛其中一個羰基與聚多巴胺的氨基相結合，取出後用去離子水衝洗5分鐘，得到戊二醛修飾的薄膜材料。
(3)將戊二醛修飾的納米薄膜浸入銀/溶菌酶納米簇溶液中，吸附1小時後取出，用去離子水衝洗5分鐘，得到銀/溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料。
對製備獲得的銀-溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料抑菌效果進行檢測，結果如圖4～5所示，抑菌24小時,本發明的抗菌薄膜對沙門氏菌抑菌率達到62.7％(圖4)，相對於單獨納米銀抗菌薄膜的抑菌率提高了79.1％。對金黃色葡萄球菌抑菌率達到87.6％(圖5)，相當於單獨的納米銀抗菌薄膜的抑菌率提高了184.4％。表明多巴胺濃度控制在5mg/ml時製備的抗菌薄膜表現出較好的抗菌效果。
實施例4
一種銀/溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜製備方法，具體實施的步驟如下：
(1)將聚偏二氯乙烯保鮮膜材料用乙醇清洗乾淨後吹乾，浸泡於含有0.05mg/ml多巴胺的ph＝8.5的0.05mtris-hcl緩衝溶液中，攪拌18小時，取出後用去離子水衝洗5分鐘，得到聚多巴胺修飾的納米薄膜。
(2)將聚多巴胺修飾的基底材料浸泡於10g/l的戊二醛溶液中，攪拌2小時，使戊二醛其中一個羰基與聚多巴胺的氨基相結合，取出後用去離子水衝洗5分鐘，得到戊二醛修飾的薄膜材料。
(3)將戊二醛修飾的納米薄膜浸入銀/溶菌酶納米簇溶液中，吸附1小時後取出，用去離子水衝洗5分鐘，得到銀/溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料。
對製備獲得的銀-溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料抑菌效果進行檢測，結果如圖6-7所示，本發明的抗菌薄膜對沙門氏菌抑菌率僅達到24.2％(圖6)，對金黃色葡萄球菌抑菌率僅達到22.6％(圖7)，表明多巴胺濃度在本發明的參數條件之外的0.5mg/ml時，製備出的抗菌膜抗菌效果不好。
實施例5
一種銀/溶菌酶納米簇修飾的抗菌薄膜製備方法，具體實施的步驟如下：
(1)將聚偏二氯乙烯保鮮膜材料用乙醇清洗乾淨後吹乾，浸泡於含有5mg/ml多巴胺的ph＝8.5的0.05mtris-hcl緩衝溶液中，攪拌18小時，取出後用去離子水衝洗5分鐘，得到聚多巴胺修飾的納米薄膜。
(2)將聚多巴胺修飾的基底材料浸泡於0.5g/l的戊二醛溶液中，攪拌2小時，使戊二醛其中一個羰基與聚多巴胺的氨基相結合，取出後用去離子水衝洗5分鐘，得到戊二醛修飾的薄膜材料。
(3)將戊二醛修飾的納米薄膜浸入銀/溶菌酶納米簇溶液中，吸附1小時後取出，用去離子水衝洗5分鐘，得到銀/溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料。
對製備獲得的銀-溶菌酶納米簇修飾的薄膜材料抑菌效果進行檢測，製備的抗菌薄膜對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均達不到較好的抗菌效果，表明戊二醛濃度在本發明的參數條件之外的0.5g/l時，製備出的抗菌膜抗菌效果不佳。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。