用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法
2023-12-09 02:15:16
用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法
【專利摘要】一種番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法,由番茄prosystemin基因克隆、構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體、製備含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的根癌農桿菌菌株、製備轉基因丹參植株步驟組成。將番茄prosystemin基因轉入丹參植株,幹涉了丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因,抗蟲性明顯高於野生丹參,生長100天轉基因的丹參根中,迷迭香酸、丹酚酸B、丹參酮IIA含量,分別是同時期非轉化丹參根中迷迭香酸和丹酚酸B和丹參酮IIA的1.31倍、1.69倍、2.62倍。
【專利說明】用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程【技術領域】,具體涉及到在丹參中引入並表達番茄原系統素基因的方法。
【背景技術】
[0002]丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬多年生草本植物,以其根及根莖入藥,為我國常用大宗藥材之一。丹參的主要活性成分為脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類,具有活血化瘀,通經止痛,清心除煩等功能,在臨床上被廣泛用於心腦血管疾病、癌症以及各種炎症的治療。伴隨著丹參原藥材需求量的日益擴大和規範化種植的需求,培育活性成分含量高的優良丹參新品種已成為丹參原藥材生產中亟待解決的關鍵問題之一。最初從丹參中分離出來的水溶性成分是丹參素,它能抗血小板聚集,具有抗血栓形成、促進纖維蛋白降解以及抗心肌缺血的功效。此外,丹酚酸也是丹參水溶性成分裡面重要的一類,總丹酚酸不僅對心、腦、肝、腎等器官的損傷都有保護作用,其中丹酚酸B也作為目前已知抗氧化作用最強的天然產物之一,在體內發揮著清除自由基、提高機體抗氧化能力等重要生理作用。丹酚酸B也是《中華人民共和國藥典》(2010年版)規定的丹參藥材質量控制的水溶性指標性成分之一。
[0003]丹參中代表性成分丹參酮IIA參與了多種生化反應表現出天然抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎等生物活性。通過抑制腫瘤細胞增、誘導腫瘤細胞凋亡等機制實現其抗腫瘤作用;通過擴張血管、改善微循環、抗血栓形成等作用清除氧自由基、改善能量代謝、改善心腦血管功能。所以丹參酮作為抗腫瘤、抗菌抗炎和改善心腦血管功能等方面都具有較好的臨床應用前景。
[0004]隨著丹參有效成分及其藥理活性的深入研究,近年來以丹參為主要原料的藥品、製劑、化妝品和系列保健產品層出不窮,丹參資源供不應求。伴隨著丹參藥材需求的日益擴大和野生資源的逐漸減少,人工種植面積逐年增大。然而作為常異交植物,丹參種內變異較大,性狀複雜。栽培丹參只種不選的狀況使得各產地丹參質量參差不齊,品種退化嚴重,有效成分含量不穩定,成為丹參作為高品質植物藥計入國際市場的最大障礙之一。提高丹參中有效成分,尤其是迷迭香酸和丹酚酸B的含量,培育優異的丹參資源具有重要意義。
[0005]由於人工栽培條件下藥田生態環境中生物多樣性差、物種豐富度低,導致丹參病蟲害優勢種群突出、病蟲害頻發,棉鈴蟲、線蟲以及丹參根腐病等已成為嚴重威脅丹參藥材品質,嚴重影響了藥材的產量和質量,導致丹參減產和市場供求不穩定的現象。目前治理病蟲害仍採用噴灑殺蟲劑,不僅造成了藥材的化學物質殘留也對環境造成了一定程度的影響。這些問題已經突出地暴露在中藥材產業化發展中,成為中藥丹參藥材產業發展的瓶頸。
[0006] 解決丹參病蟲害的問題,人們做出了很多的試探和努力。近年來利用基因工程、細胞工程等現代生物技術手段對丹參進行改良以提高其有效成分的含量愈來愈受到人們的重視。在諸多方法中,利用基因工程技術對藥用植物次生代謝途徑的遺傳特性進行改造,提高藥用植物有效成分含量,培育能夠大量積累目標次生代謝物的新品種,愈來愈受到人們的關注。以轉基因技術為核心的現代分子育種技術在改良藥用植物、豐富中藥資源、提高抗病性和抗逆性、培養高天然藥物含量的新型轉基因藥材有廣泛的應用前景。但目前利用轉基因技術提高丹參抗蟲性的技術未見報導。在已有的採用轉基因方法提高丹參藥用成分的技術中,僅局限在轉入外源基因提高丹參的酚酸類成分含量,而利用基因操作的手段引入外源基因提高代謝源頭物質流合成並同時削弱該物質向其他競爭旁路流失,利用這種「開源節流」的原則對代謝途徑進行調控,從而提高了丹參酚酸類和丹參酮類成分含量的技術方法尚無報導。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題在於克服上述技術的不足,提供一種抗蟲性高、活性成分含量高的用番茄基因和幹涉丹參內源基因提高丹參抗蟲性和活性成分的方法。
[0008]解決上述技術問題所採用的技術方案是由下述步驟組成:
[0009]1、番爺 prosystemin 基因克隆
[0010]利用OMEGA公司E.Z.N.A.? Plant RNA Kit提取試劑盒,按照說明書分離提取番爺總RNA,用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit反轉錄試劑盒,按照說明書將番爺總RNA反轉錄成cDNA備用;採用Primer Premier5.0軟體,設計番爺prosystemin基因編碼框的上遊引物、下遊引物,以番茄cDNA為模板,進行聚合酶鏈式反應,反應體系為:以番茄cDNA為模板,進行聚合酶鏈式反應,反應體系為:取番茄cDNA與DNA聚合酶、DNA聚合酶緩衝液、dNTP、上遊引物、下遊引物、二次蒸餾水的體積比為1:0.5:5:5:1:1:37.5,按照如下條件反應:95°C 3分鐘,95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45秒、循環35次,得到番茄prosystemin基因,並在番爺prosystemin基因的上遊引物前引入Spe I限制性酶切位點和保護鹼基GACTAGT,在下遊引物前引入BstE II限制性酶切位點和保護鹼基CAGGGTAACC,用番爺prosystemin基因引物:
[0011]上遊引物prosystemin-F5' -GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3'、
[0012]下遊引物prosystemin-RS' -CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3'、
[0013]以番茄cDNA為模板,按下述反應體系進行混合:番茄cDNA與DNA聚合酶、DNA聚合酶緩衝液、dNTP、prosystemin-F、prosystemin_R、二次蒸懼水的體積比為 2:0.5:5:5:1:1:36.5,並按照95 °C 3分鐘,95°C 30秒、57 °C 30秒、72°C 45秒、循環35次,進行聚合酶鏈式反應擴增,得含有酶切位點的番茄prosystemin基因,獲得的擴增產物進行電泳分離,回收擴增產物與PMD19-T載體(購於寶生物工程大連有限公司)用T4DNA連接酶(購於寶生物工程大連有限公司)按連接酶使用說明書連接,構成prosystemin-pMD19-T載體並採用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5 α感受態細胞中,prosystemin-pMD19-T載體與大腸桿菌DH5 α的體積比為1:9.5~10.5,挑選所得陽性克隆,經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到番爺prosystemin基因序列,該基因序列如下:
[0014]atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga 50
agaaccaaag gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa 100
aaataattga aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc 150
atctcttcat atgttttaag agatgataca caagaaatac caaagatgga 200
acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa aaggagacta 250
tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300
ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga 350
aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaaggagat gatgcacaag 400
aaaaaccaaa ggtggaacat gaggaaggag atgacaaaga gactccatca 450
caagatatca tcaagatgga aggggagggt gcactagaaa taacaaaggt 500
ggtatgtgag aaaattatag tacgagaaga tcttgctgtt caatcaaaac 550
ctccatcaaa gcgtgatcct cccaaaatgc aaacagacaa taataaactc 600
[0015]2、構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體
[0016]用Spe I和BstE II分別雙酶切prosystemin-pMD19_T載體、植物表達載體pCAMBIA-1302,分別回收prosystemin基因片段和pCAMBIA-1302雙酶切後的酶切產物,將片段與產物用T4DNA連接酶連接,篩選,獲得pCAMBIA-1302-prosystemin中間載體;
[0017]選取位於丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因,簡稱C0MT,編碼區3'端345bp的片段作為RNA幹涉的靶片段,在該片段分別引入酶切位點Cla Ι/Κρη I及Xho I/BamH I,應用Primer Prime5.0設計擴增引物:
[0018]i COMT-F: 5' -CCATC GAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3'
[0019]iCOMT-R:5/ -GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3';
[0020]用聚合酶鏈式擴增反應,將該345bp的上遊引入Cla I和Kpn I兩個酶切位點,於其下遊引入Xho I和BamH I兩個酶切位點;經聚合酶鏈式擴增反應擴增,得含有Cla I/KpnI 及 Xho I/BamH I 的產物 COMTi,連接 p_MD19T 載體得 C0MTi_pMD19T 載體;用 Xho I 和 Kpn
I分別酶切 C0MT1-pMD19T 載體、pKannibal 載體,將用 Xho I,KpnI 酶切 C0MTi_pMD19T 載體的片段與經Xho 1、Kpn I酶切pKannibal載體的片段,用DNA連接酶相連成pKannibal+中間載體;用BamH I和Cla I分別酶切C0MTi_pMD19T載體、pKannibal+載體,用含有BamH I和Cla I酶切C0MT1-pMD19T載體的片段與經BamH I和Cla I酶切pKannibal+的片段用DNA連接酶相連,獲得的新載體為pKANNIBAL/COMTi。
[0021]用Sac I 和 Pst I 雙酶切 pKANNIBAL/COMT1、pCAMBIA1302_prosystemin載體,將雙酶切pKANNIBAL/COMTi所獲得的幹涉轉錄框,連接到經雙酶切後的pCAMBIA1302-prosystemin 載體上,得 pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/C0MTi載體,並轉入大腸桿菌DH5ci中進行擴增,提取質粒,用酶切方法進行鑑定,得到含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/C0MTi,命名為 pCPKC 載體。
[0022]3、製備含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的根癌農桿菌菌株
[0023]將pCPKC載體轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞,採用液氮凍融法進行轉化,轉化後的產物於27.5 °C~28.5 °C培養箱中倒置培養36~72小時,挑取抗性單菌落分別用prosystemin基因特異性引物prosystemin-F和prosystemin基因特異性引物prosystemin-R進行聚合酶鏈式反應,篩選,用pCPKC載體上特異性引物,序列為:
[0024]35S-F5' -TACAAAGGCGGCAACAAACG-3'
[0025]35S-R5' -GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3'
[0026]進行聚合酶鏈式反應,篩選,獲得含有pCPKC載體的根癌農桿菌菌株。
[0027]4、製備轉基因丹參植株
[0028]採用常規組織培養方法獲得無菌丹參試管苗,採用葉盤轉化法,將含有pCPKC載體的根癌農桿菌與無菌丹參試管苗進行浸染,獲得含有番茄prosystemin基因並且幹涉丹參內源咖啡醯-O-甲基轉移酶基因的丹參植株。
[0029]在本發明的構建含有番爺prosystemin基因和丹參咖啡醯_0_甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟2中,所述的用Spe I和BstE II雙酶切prosystemin-pMD19_T 載體、植物表達載體pCAMBIA-1302 為:取含有 prosystemin-pMD19-T載體、IOXM Buffer、限制性內切酶Spe 1、限制性內切酶BstE I1、二次蒸餾水於37 °C反應2小時20分鐘,限制性內切酶Spe I與限制性內切酶BstE IIUOXM Buffer、含有prosystemin-pMD19-T載體、二次蒸懼水的體積比為1:1:2:6:10 ;取植物表達載體PCAMBIA-1302U0XM Buffer、限制性內切酶Spe 1、限制性內切酶BstE I1、二次蒸餾水於37°C反應3小時,限制性內切酶Spe I與限制性內切酶BstE IIUOXM Buffer、植物表達載體pCAMBIA-1302、二次蒸餾水的體積比為I:1:2:6:10。
[0030]在本發明的構建含有番爺prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟2中,所述的用Xho I和Kpn I分別酶切C0MT1-pMD19T載體、pKannibal載體為:取C0MT1-pMD19_T載體、10XM Buffer、限制性內切酶Xho 1、限制性內切酶Kpn 1、二次蒸餾水,37°C反應2小時40分鐘,限制性內切酶Xho I與限制性內切酶Kpn
1、10XMBuffer、C0MT1-pMD19-T 載體、二次蒸餾水的體積比為 I:1:2:6:10 ;取 pKannibal載體、IOXM Buffer、限制性內切酶Xho 1、限制性內切酶Kpn 1、二次蒸餾水,37°C反應2小時40分鐘,限制性內切酶Xho I與限制性內切酶Kpn IUOXM Buffer、pKannibal載體、二次蒸餾水的體積比為1:1:2:6 =IO0
[0031]在本發明的構建含有番爺prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟2中,所述的用BamH I和Cla I分別酶切C0MTi_pMD19T載體、pKannibal+載體為:取含有C0MTi_pMD19T載體、10XK Buffer、限制性內切酶Cla 1、限制性內切酶BamH 1、二次蒸餾水,37°C反應2小時30分鐘,限制性內切酶Cla I與限制性內切酶BamH IUOXK Buffer、C0MT1-pMD19_T載體、二次蒸餾水的體積比為I:1:2:6:10 ;取pKannibal+載體、10XK Buffer、限制性內切酶Cla 1、限制性內切酶BamH 1、二次蒸餾水,37°C反應2小時30分鐘,限制性內切酶Cla I與限制性內切酶BamH IUOXK Buffer、pKannibal+載體、二次蒸懼水的體積比為1:1:2:6:10。
[0032] 在本發明的構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯_0_甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟2中,所述的用Sac I和Pst I雙酶切pKANNIBAL/COMT1、pCAMBIA1302-prosystemin 載體為:取 pKANNIBAL/COMTi 載體、10XM Buffer、限制性內切酶Sac 1、限制性內切酶Pst 1、二次蒸餾水,37°C反應3小時,限制性內切酶Sac 1、限制性內切酶Pst 1、10XMBuffer、pKANNIBAL/C0MTi 載體、二次蒸餾水的體積比為 I:1:2:6:10 ;取pCAMBIA-1302-prosystemin載體、10XM Buffer、限制性內切酶Sac 1、限制性內切酶Pst 1、二次蒸餾水於37°C反應3小時,限制性內切酶Sac I與限制性內切酶Pst 1、10XM Buffer、pCAMBIA1302_prosystemin 載體、二次蒸懼水的體積比為 1:1:2:6:10。
[0033]本發明將番茄prosystemin基因轉入丹參植株,幹涉了丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因,篩選獲得了抗蟲性明顯高於野生丹參,轉基因丹參酚酸類含量顯著提高。在生長100天的轉基因的丹參乾燥根中,迷迭香酸的含量為16.96±0.90mg/g、丹酹酸B的含量達57.64±1.94mg/g、丹參酮IIA含量為2.04±0.19mg/g,分別是同時期非轉化普通丹參乾燥根中迷迭香酸(12.90±0.48mg/g)、丹酚酸B(34.04±0.89mg/g)、丹參酮ΙΙΑ(0.78±0.llmg/g)的1.31倍、1.69倍、2.62倍。為提高丹參中各類有效成分含量提供了一種新方法,可在丹參的培育中推廣使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1是檢測轉基因丹參植株中番茄prosystemin基因表達量圖。
[0035]圖2是檢測轉基因丹參植株中丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因表達量圖。
[0036]圖3是棉鈴蟲噬咬3天後轉基因丹參株系2與野生丹參葉片受損程度的實驗照片。
[0037]圖4是高效液相色譜測定野生丹參和轉基因丹參株系2中活性成分含量的色譜圖。
[0038]圖5是野生丹參和轉基因丹參株系2中活性成分含量圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明,但本發明不限於這些實施例。
[0040]實施例1
[0041]本實施例用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法步驟如下:
[0042]1、番爺 prosystemin 基因克隆
[0043]利用OMEGA公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit提取試劑盒,按照說明書分離提取番爺總RNA,用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit反轉錄試劑盒,按照說明書將番爺總RNA反轉錄成cDNA備用;採用Primer Premier5.0軟體,設計番爺prosystemin基因編碼框的上遊引物、下遊引物,以番茄cDNA為模板,進行聚合酶鏈式反應。反應體系為:番茄cDNAly 1、DNA聚合酶0.5μ 1、DNA聚合酶緩衝液5μ l、dNTP5y 1、上遊引物1μ 1、下遊引物I μ 1、二次蒸餾水37.5 μ 1,按照如下條件反應:95°C 3分鐘,95°C 30秒、57。。30秒、72。。45秒、循環35次,得到番爺prosystemin基因,並在番爺prosystemin基因的上遊引物前引入Spe I限制性酶切位點和保護鹼基GACTAGT,在下遊引物前引入BstE II限制性酶切位點和保護鹼基CAGGGTAACC,用番茄prosystemin基因引物:
[0044]上遊引物prosystemin-F5' -GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3'
[0045]下遊引物prosystemin-RS' -CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3'
[0046]以番茄cDNA為模板,按下述反應體系進行混合:番茄cDNA2y 1、DNA聚合酶
0.5 μ 1、DNA 聚合酶緩衝液 5 μ 1、dNTP5 μ 1、prosystemin-Fl μ 1、prosystemin-Rl μ 1、二次蒸餾水36.5 μ 1,並按照95°C 3分鐘,95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45秒、循環35次,進行聚合酶鏈式反應擴增,得含有酶切位點的番茄prosystemin基因,獲得的擴增產物進行電泳分離,用OMEGA公司E.Z.N.A.TM GelExtraction Kit試劑盒回收擴增產物與pMD19_T載體(購於寶生物工程大連有限公司)用T4DNA連接酶(購於寶生物工程大連有限公司)按連接酶使用說明書連接,構成prosystemin-pMD19-T載體並採用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5a感受態細胞中,取prosystemin-pMD19_T載體10 μ 1、大腸桿菌DH5 a感受態細胞100 μ l,prosystemin-pMD19_T載體與大腸桿菌DH5 a的體積比為1:10,挑選所得陽性克隆10個,經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到番茄piOsystemin基因序列,該基因序列
如下:
[0047]
atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga 50
agaaccaaag gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa 100
aaataattga aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc 150
atctcttcat atgttttaag agatgataca caagaaatac caaagatgga 200
acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa aaggagacta 250
tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300
ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga 350
aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaaggagat gatgcacaag 400
aaaaaccaaa ggtggaacat gaggaaggag atgacaaaga gactccatca 450
caagatatca tcaagatgga aggggagggt gcactagaaa taacaaaggt 500
ggtatgtgag aaaattatag tacgagaaga tcttgctgtt caatcaaaac 550
ctccatcaaa gcg tgatcct cccaaaatgc aaacagacaa taataaactc 600
[0048]2、構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體
[0049]用Spe I和BstE II分別雙酶切prosystemin-pMD19_T載體、植物表達載體pCAMBIA-1302,雙酶切的方法為:取 prosystemin-pMD19_T 載體 6 μ 1,Spe Il μ 1、BstEΙΙΙμ 1、10XM Buffer2y I, 二次蒸餾水10μ 1,混合均勻,於37°C反應2小時20分鐘,電泳分離,用OMEGA公司E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit試劑盒回收酶切片段,得到prosystemin 基因回收片段。取植物表達載體 pCAMBIA-13026 μ I, Spe Il μ l.BstE III μ 1、10XMBuffer2y 1,二次蒸餾水10 μ 1,混合均勻,於37°C反應3小時,電泳分離,用OMEGA公司E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit試劑盒回收酶切片段,得到pCAMBIA-1302回收片段。將prosystemin基因回收片段與pCAMBIA-1302回收片段按照摩爾比為1:7用T4DNA連接酶連接,取連接產物10 μ I用熱激轉化法轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞100 μ 1,挑取單克隆10個,37°C 180rpm振蕩培養16~18小時,用prosystemin特異引物prosystemin-F和prosystemin-R經菌落聚合酶鏈式反應檢測,反應條件為95°C、10分鐘;然後94°C、30秒,60°C、30秒,72°C、40秒,35個循環,得到陽性菌株;用鹼裂解法提取陽性菌株質粒,用Spe I和BstE II雙酶切方法進行酶切反應,篩選,獲得pCAMBIA-1302-prosystemin中間載體。
[0050]選取位於丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因,簡稱C0MT,編碼區3 ^端345bp的片段作為RNA幹涉的靶片段,在該片段分別引入酶切位點Cla Ι/Κρη I及Xho I/BamH I,應用Primer Prime5.0軟體設計擴增引物:
[0051 ] i COMT-F: 5' -CCATCGAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3'
[0052] iCOMT-R:5/ -GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3';[0053]將該345bp的上遊引入Cla I和Kpn I兩個酶切位點,於其下遊引入Xho I和BamHI兩個酶切位點;經聚合酶鏈式擴增反應擴增丹參cDNA,反應條件為95°C、3分鐘;然後940C >30 秒,58。。、30 秒,72。。、25 秒,35 個循環,得含有 Cla I/Kpn I 和 Xho I/BamH I 的咖啡醯-O-甲基轉移酶,命名為COMTi,經電泳分離後按照試劑盒說明書回收COMTi片段,以P-MD19T載體與COMTi片段的體積比1:9連接,得C0MTi_pMD19T載體。
[0054]用Xho I 和 Kpn I 分別酶切 C0MTi_pMD19T 載體、pKannibal 載體,取 C0MT1-pMD19_T載體6 μ 1、10XM Buffer2 μ 1、限制性內切酶Xho Il μ 1、限制性內切酶Kpn Il μ 1、二次蒸餾水10μ I於37°C反應2小時40分鐘;取pKannibal載體6 μ IUOXM Buf f er2 μ 1、限制性內切酶Xho Il μ 1、限制性內切酶Kpn Il μ 1、二次蒸餾水10μ I於37 °C反應2小時40分鐘;將這兩者的酶切產物進行電泳分離,按照試劑盒說明書回收COMTi基因片段和pKannibal載體片段,取COMTi基因回收片段I μ l、pKannibal中間載體回收片段7 μ 1、T4DNA連接酶
Iμ 1、IOX T4DNA連接酶Buffer I μ I,16°C反應3小時,獲得pKannibal+中間載體。
[0055]用BamH I 和 Cla I 分別酶切 C0MTi_pMD19T 載體、pKannibal+ 載體,取(:0皿11-?]\?191'載體6 4 IUOXK Buffer2 μ 1、限制性內切酶Cla Il μ 1、限制性內切酶BamH
IIμ 1、二次蒸餾水10 μ 1,混合均勻於37°C反應2小時30分鐘;取pKannibal+中間載體
6μ 1、10XK Buffer2 μ 1、限制性內切酶Cla Il μ 1、限制性內切酶BamH Il μ 1、二次蒸餾水10 μ 1,混合均勻於37 V反應2小時30分鐘,將這兩種酶切產物進行電泳分離,按照試劑盒說明書回收COMTi基因片段與pKannibal+中間載體片段,取COMTi基因回收片段1.5 μ 1、pKannibal+ 中間載體回收片段 6.5 μ 1、T4DNA 連接酶 I μ 1、10XT4DNA 連接酶 Bufferl μ 1,16°C反應3小時,獲得的新載體為pKANNIBAL/COMTi。
[0056]用Sac I和Pst I雙酶上一步獲得的新pKANNIBAL/COMTi和pCAMBIA1302-prosystemin 載體,取 pKANNIBAL/C0MTi6 μ 1、Sac 11 μ 1、PstΙ?μ 1、10XM Buffer2y 1、二次蒸餾水10 μ 1,混合均勻,於37 °C反應3小時;取pCAMBIA-1302-prosystemin 載體 6 μ 1、Sac Il μ 1、Pst Il μ 1、10XM Buffer2 μ 1、二次蒸餾水10 μ 1,37°C反應3小時;電泳分離,按照OMEGA公司E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit試劑盒說明書回收pKANNIBAL/COMTi酶切產物和pCAMBIA-1302-prosystemin載體酶切產物,取 pKANNIBAL/COMTi 酶切產物 2 μ 1、pCAMBIA-1302-prosystemin 載體回收片段 6 μ 1、T4DNA 連接酶 I μ 1、10XT4DNA 連接酶 Bufferl μ 1,16 °C 反應 3 小時,得 pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi載體。將該載體轉入大腸桿菌DH5 α中進行擴增,用鹼裂解法提取質粒,用Sac I和Pst I雙酶切的方法進行鑑定,得到含有番爺prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體ρ CAMBIA13 O 2 /prosystemin+pKANNIBAL/COMTi,命名為 pCPKC 載體。
[0057]3、製備含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的根癌農桿菌菌株
[0058] 將pCPKC載體轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞,採用液氮凍融法進行轉化,轉化後的產物於28±0.5°C培養箱中倒置培養48小時,挑取抗性單菌落20個,28±0.5°C,160rpm震蕩培養中24小時,分別用prosystemin基因特異性引物prosystemin-F和prosystemin基因特異性引物prosystemin-R進行聚合酶鏈式反應,反應條件為95°C、10分鐘;然後94°C、30秒,60°C、30秒,72°C、40秒,35個循環,得到陽性菌株;再用pCPKC載體上特異性引物:
[0059]35S-F5' -TACAAAGGCGGCAACAAACG-3'
[0060]35S-R5' -GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3'
[0061]對陽性菌株進行聚合酶鏈式反應,反應條件為94°C、3分鐘;94°C、30秒,59°C、30秒,72 0C >50秒,35個循環,篩選,最終獲得含有pCPKC載體的根癌農桿菌菌株。
[0062]4、製備轉基因丹參植株
[0063]無菌丹參試管苗的獲得可採用常規組織培養方法,具體方法如下:
[0064]丹參種子用流水衝洗,用體積分數為75%乙醇水溶液表面滅菌20秒,二次蒸餾水衝洗2次,每次4分鐘,用質量分數為0.1 %的氯化汞水溶液表面滅菌10分鐘,二次蒸餾水衝洗5次,丹參種子用濾紙吸乾表面殘存的水分,置於MS基本培養基上萌發,25°C,16小時光照,光照強度為3000LuX,8小時黑暗培養箱內培養2周,獲得無菌試管苗。
[0065]將含有pCPKC載體的根癌農桿菌與無菌丹參試管苗進行浸染的具體方法如下:
[0066]選取生長30天的丹參無菌試管苗,將其葉片切成0.5釐米X0.5釐米的小塊,轉入預培養培養基中(預培養基為每ILMS培養基含有IOmL濃度為1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、ImL濃度為1.0mg/mL的a_萘乙酸的培養基),在正常培養條件下預培養I天,將預培養過的一部分葉片轉入稀釋好的含有PCPKC載體根癌農桿菌菌液中,28°C恆溫100轉/分鐘浸染25~30分鐘,取出葉片,用無菌濾紙吸乾,轉移到預培養培養基上暗培養2~3天;另一部分預培養的葉片不進行農桿菌的浸染,直接在預培養培養基上培養至生芽後,將芽剝落,置於1/2MS培養基上生根,作為實驗未轉化的空白對照植株;暗培養2~3天後,將葉片從原培養基上取出,轉接到選擇培養基上(選擇培養基為ILMS培養基中含有IOmL濃度為3mg/mL的潮黴素和IOmL濃度為200mg/mL的頭孢黴素的培養基),每10~15天更換一次選擇培養基;待抗性芽長到約0.5~I釐米左右時,將抗性芽切下,轉入1/2MS培養基上生根。在1/2MS培養基(每IL含有IOmL濃度為200mg/mL的頭孢黴素、IOmL濃度為3mg/mL的潮黴素)篩選培養3~4次,每10~15天更換一次培養基,能正常生根的植株從節間切斷,帶有2個腋芽的莖段扦插於MS培養基上繼代培養,4~6周左右更換一次培養基,篩選的陽性轉化株系和對照株系移栽至科研溫室中同等條件培養,移栽培養250天的轉基因丹參植株用於迷迭香酸和丹酚酸B含量的測定。
[0067]實施例2
[0068]在本實施例的番爺prosystemin基因克隆步驟I中,取prosystemin-pMD19_T載體10 μ 1、大腸桿菌DH5a感受態細胞95 μ l,prosystemin-pMD19_T載體與大腸桿菌DH5 a的體積比為1:9.5,挑選所得陽性克隆10個,經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到番爺prosystemin基因序列。該步驟中的其它步驟與實施例1相同。其它步驟與實施例1相同。
[0069]實施例3
[0070]在本實施例的番爺prosystemin基因克隆步驟I中,取prosystemin-pMD19_T載體10 μ 1、大腸桿菌DH5 α感受態細胞10.5 μ I, prosystemin-pMD19_T載體與大腸桿菌DH5a的體積比為1:10.5,挑選所得陽性克隆10個,經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到番爺prosystemin基因序列。該步驟中的其它步驟與實施例1相同。其它步驟與實施例I相同。[0071]實施例4
[0072]在以上實施例1~3的製備含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯_0_甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的根癌農桿菌菌株步驟3中,將pCPKC載體轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞,採用液氮凍融法進行轉化,轉化後的產物於27.5°C培養箱中倒置培養72小時,挑取抗性單菌落分別用prosystemin基因特異性引物prosystemin-F和prosystemin基因特異性引物prosystemin-R進行聚合酶鏈式反應,該步驟中的其它步驟與實施例1相同。它步驟與實施例1相同。
[0073]實施例5
[0074]在以上實施例1~3的製備含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯_0_甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的根癌農桿菌菌株步驟3中,將pCPKC載體轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞,採用液氮凍融法進行轉化,轉化後的產物於28.5°C培養箱中倒置培養36小時,挑取抗性單菌落分別用prosystemin基因特異性引物prosystemin-F和prosystemin基因特異性引物prosystemin-R進行聚合酶鏈式反應,該步驟中的其它步驟與實施例1相同。它步驟與實施例1相同。
[0075]為了驗證本發明的有益效果,發明人採用本發明實施例1製備的轉基因丹參植株進行了番茄基因和丹參內源基因的表達量、轉基因丹參植株的抗蟲性以及活性成分的含量,進行了大量的實驗,各種實驗情況如下:
[0076]1、檢測轉基因丹參植株中prosystemin和咖啡醯_0_甲基轉移酶基因的表達量
[0077]用PremierPrimer5.0軟體,設計合成適合實時突光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應擴增所需的番茄prosystemin基因、丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因以及丹參管家基因肌動蛋白-β 基因的引物,分別標記為 qProsystemin_F、qProsystemin-R ;qC0MT-F>qC0MT-R ;qSmACT-F、qSmACT-R。引物序列分別為:
[0078]qProsystemin-F5/ -TAGTTGAAAAAGAGACTCCATCCCA-3'
[0079]qProsystemin-R5/ -ACGACAAGTTAGTTTTGGAGGT-3'
[0080]qC0MT-F5' -TCCAGGTGTGGAGCATGTGG-3'
[0081]qC0MT-R5; -GTGTTTTACCCTTCCACTA-3'
[0082]qSmACT-F:5,-AGGAACCACCGATCCAGACA-3』
[0083]qSmACT-R:5,-GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3,
[0084]按照OMEGA公司E.Z.N.A.? Plant RNA Kit提取試劑盒的說明書提取生長30天的丹參總RNA,並用Takara公司PrimeScript RT reagent Kit反轉錄試劑盒合成丹參cDNA第
一鏈,保存備用。
[0085] 以非轉化丹參株系cDNA為空白對照,以轉化pCPKC載體的丹參植株為實驗組,用實時突光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應法測定番爺prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因的表達量。實時螢光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應擴增條件是:94°C預變性、I分鐘;40個循環(94°C變性、10秒,60°C退火併收集螢光信號,25秒),95°C、I分鐘,60°C、I分鐘,60~95°C、每30秒升高0.5°C,收集一次螢光。反應結束後螢光信號值採用「比較Ct值的相對定量法」進行基因表達的分析。具體處理方法按照「iQ?5多重實時螢光定量PCR儀說明書」進行。檢測結果見圖1、2。在圖1、2中,橫坐標為不同的轉基因株系,縱坐標為相對表達量,CK代表非轉化丹參株系,*表示實驗組與對照組比較具有顯著差異性(P〈0.05)。由圖1可見,與對照植株相比,外源目的基因番爺prosystemin基因在轉化株系2、3、8、13中都具有不同程度的表達,並與對照相比具有顯著性差異(P〈0.5),表明番茄prosystemin基因已在丹參中過量表達。在圖2中,株系2、3、8、13、15、16中的咖啡醯-O-甲基轉移酶表達量較對照有明顯下調(P〈0.05),說明對丹參內源基因咖啡醯-O-甲基轉移酶的幹涉是成功的。綜合番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因表達量的檢測結果,選取轉基因丹參株系2、13兩個株系進行後續試驗。
[0086]2、轉基因丹參株系抗蟲實驗
[0087]分別從生長30天的轉基因丹參株系2、13和相同生長狀態的野生丹參的不同3個植株上摘取頂葉I片,置於鋪有潮溼脫脂棉的培養皿上,每個培養皿中放I片丹參頂葉。另外在每個培養皿中接種3頭處於三齡幼蟲期的棉鈴蟲幼蟲(為實驗室保留)。將培養皿置於25°C光照培養箱中培養,3天後觀察葉片損害程度,結果見圖3,從圖3中可以看出,左圖為實驗3天後轉基因丹參株系2的葉片,葉片幾乎沒有被咬噬,而且棉鈴蟲也因沒有食物而死亡;右圖為野生型丹參葉片,從圖中可看出葉片被咬噬嚴重,邊緣褐化、壞死。並統計棉鈴蟲的死亡率,見表1。
[0088]表1噬咬3天後接種於轉基因丹參株系2與野生丹參葉片的棉鈴蟲死亡率
[0089]
【權利要求】
1.一種用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法,由下述步驟組成: (1)番爺prosystemin基因克隆 用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit提取試劑盒,按照說明書分離提取番茄總RNA,用PrimeScript RT reagent Kit反轉錄試劑盒,按照說明書將番爺總RNA反轉錄成cDNA備用;採用Primer Premier5.0軟體,設計番爺prosystemin基因編碼框的上遊引物、下遊引物,以番茄cDNA為模板,進行聚合酶鏈式反應,反應體系為:取番茄cDNA與DNA聚合酶、DNA聚合酶緩衝液、dNTP、上遊引物、下遊引物、二次蒸餾水的體積比為1:0.5:5:5:1:1:37.5,按照如下條件反應:95°C 3分鐘,95°C 30秒、57°C 30秒、72°C 45秒、循環35次,得到番茄prosystemin基因,並在番爺prosystemin基因的上遊引物前引入Spe I限制性酶切位點和保護鹼基GACTAGT,在下遊引物前引入BstE II限制性酶切位點和保護鹼基CAGGGTAACC,用番爺prosystemin基因引物:
上遊引物 prosystemin-F5' -GACTAGTATGGGAACTCCTTCATATGATATC-3'
下遊引物 prosystemin-RS' -CAGGGTAACCCGTTTGTCTGTTATTATTTGAG-3' 以番茄cDNA為模板,按下述反應體系進行混合:番茄cDNA與DNA聚合酶、DNA聚合酶緩衝液、dNTP、prosystemin-F、prosystemin-R、二次蒸懼水的體積比為 2:0.5:5:5:1:1:36.5,並按照 95 °C 3 分鐘,95°C 30 秒、57°C 30 秒、72°C 45 秒、循環 35 次,進行聚合酶鏈式反應擴增,得含有酶切位點的番茄P r O S y S t e m i η基因,獲得的擴增產物進行電泳分離,回收擴增產物與PMD19-T載體用T4DNA連接酶按連接酶使用說明書連接,構成prosystemin-pMD19-T載體,並採用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5 α感受態細胞中,prosystemin-pMD19-T載體與大腸桿菌DH5 α的體積比為1:9.5~10.5,挑選所得陽性克隆,經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到番茄prosystemin基因序列,該基因序列如下:
atgggaactc cttcatatga tatcaaaaac aaaggagatg acatgcaaga 50
agaaccaaag gtgaaacttc accatgagaa gggaggagat gaaaaggaaa 100
aaataattga aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaagatacc 150
atctcttcat atgttttaag agatgataca caagaaatac caaagatgga 200
acatgaggag ggaggatatg taaaggagaa aattgttgaa aaggagacta 250
tatcccaata tatcatcaag attgaaggag atgatgatgc acaagaaaaa 300
ctaaaggttg agtatgagga ggaagaatat gaaaaagaga aaatagttga 350
aaaagagact ccatcccaag atatcaacaa caaaggagat gatgcacaag 400
aaaaaccaaa ggtggaacat gaggaaggag atgacaaaga gactccatca 450
caagatatca tcaagatgga aggggagggt gcactagaaa taacaaaggt 500
ggtatgtgag aaaattatag tacgagaaga tcttgGtgtt caatcaaaac 550
ctccatcaaa gcgtgatcct cccaaaatgc aaacagacaa taataaactc 600 (2)構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體 用Spe I和BstE II分別雙酶切prosystemin-pMD19_T載體、植物表達載體pCAMBIA-1302,分別回收prosystemin基因片段和pCAMBIA_1302雙酶切後的酶切產物,將片段與產物用T4DNA連接酶連接,篩選,獲得pCAMBIA-1302-prosystemin中間載體; 選取位於丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因,簡稱C0MT,編碼區3'端345bp的片段作為RNA幹涉的靶片段,在該片段分別引入酶切位點Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I,應用PrimerPrime5.0設計擴增引物:
i COMT-F: 5' -CCATCGAT GGTACCACCCTCCCCGACGGCGGCGTCCA-3'
i COMT-R: 5' -GCTCTAGACTCGAG GGATCCCACACCACCTACAACCACCTCCT-3'; 用聚合酶鏈式擴增反應,將該345bp的上遊引入Cla I和Kpn I兩個酶切位點,於其下遊引入Xho I和BamH I兩個酶切位點;經聚合酶鏈式擴增反應擴增,得含有Cla I/Kpn I及Xho I/BamH I 的產物 COMTi,連接 p_MD19T 載體得 C0MTi_pMD19T 載體;用 Xho I 和 Kpn I 分別酶切 C0MT1-pMD19T 載體、pKannibal 載體,將用 Xho 1、KpnI 酶切 C0MTi_pMD19T 載體的片段與經Xho 1、Kpn I酶切pKannibal載體的片段,用DNA連接酶相連成pKannibal+中間載體;用BamH I和Cla I分別酶切C0MTi_pMD19T載體、pKannibal+載體,用含有BamH I和Cla I酶切C0MT1-pMD19T載體的片段與經BamH I和Cla I酶切pKannibal+的片段用DNA連接酶相連,獲得的新載體為pKANNIBAL/COMTi ; 用 Sac I 和 Pst I 雙酶切 pKANNIBAL/C0MT1、pCAMBIA1302-prosystemin 載體,將雙酶切pKANNIBAL/COMTi所獲得的幹涉轉錄框,連接到經雙酶切後的pCAMBIA1302-prosystemin載體上,得 pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/C0MTi 載體,並轉入大腸桿菌 DH5 α 中進行擴增,提取質粒,用酶切方法進行鑑定,得到含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體pCAMBIA1302/prosystemin+pKANNIBAL/COMTi,命名為pCPKC載體; (3)製備含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的根癌農桿菌菌株 將pCPKC載體轉化根癌農桿菌EHA105感受態細胞,採用液氮凍融法進行轉化,轉化後的產物於27.5 °C~28.5 °C培養箱中倒置培養36~72小時,挑取抗性單菌落分別用prosystemin基因特異性引物prosystemin-F和prosystemin基因特異性引物prosystemin-R進行聚合酶鏈式反應,篩選,用pCPKC載體上特異性引物,序列為:
35S-F5' -TACAAAGGCGGCAACAAACG-3'
35S-R5' -GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3' 進行聚合酶鏈式反應,篩選,獲得含有PCPKC載體的根癌農桿菌菌株; (4)製備轉基因丹參植株 採用常規組織培養方法獲得無菌丹參試管苗,採用葉盤轉化法,將含有PCPKC載體的根癌農桿菌與無菌丹參試管苗進行浸染,獲得含有番茄prosystemin基因並且幹涉丹參內源咖啡醯-O-甲基轉移酶基因的丹參植株。
2.根據權利要求1所述的用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法,其特徵在於在本發明的構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟(2)中,所述的用Spe I和BstE II雙酶切prosystemin-pMD19_T載體、植物表達載體pCAMBIA-1302 為:取含有 prosystemin-pMD19-T載體、10 XM Buffer、限制性內切酶Spe 1、限制性內切酶BstE I1、二次蒸餾水於37 °C反應2小時20分鐘,限制性內切酶Spe I與限制性內切酶BstE IIUOXM Buffer、含有prosystemin-pMD19-T載體、二次蒸懼水的體積比為1:1:2:6:10 ;取植物表達載體PCAMBIA-1302U0XM Buffer、限制性內切酶Spe 1、限制性內切酶BstE I1、二次蒸餾水於37°C反應3小時,限制性內切酶Spe I與限制性內切酶BstE IIUOXM Buffer、植物表達載體pCAMBIA-1302、二次蒸餾水的體積比為I:1:2:6:10。
3.根據權利要求1所述的用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法,其特徵在於在本發明的構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯-O-甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟(2)中,所述的用Xho I和Kpn I分別酶切C0MT1-pMD19T 載體、pKannibal 載體為:取 C0MT1-pMD19_T 載體、10 XM Buffer、限制性內切酶Xho 1、限制性內切酶Kpn 1、二次蒸餾水,37°C反應2小時40分鐘,限制性內切酶Xho I與限制性內切酶Kpn IUOXM Buffer、C0MT1-pMD19_T載體、二次蒸餾水的體積比為I:1:2:6:10 ;取pKannibal載體、10XM Buffer、限制性內切酶Xho 1、限制性內切酶Kpn 1、二次蒸餾水,37°C反應2小時40分鐘,限制性內切酶Xho I與限制性內切酶Kpn 1、10XM Buffer、pKannibal載體、二次蒸懼水的體積比為1:1:2:6:10。
4.根據權利要求1所述的用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法,其特徵在於在本發明的構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯_0_甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟(2)中,所述的用BamH I和Cla I分別酶切C0MT1-pMD19T 載體、pKannibal+ 載體為:取含有 C0MTi_pMD19T 載體、IOXK Buffer、限制性內切酶Cla 1、限制性內切酶BamH 1、二次蒸餾水,37°C反應2小時30分鐘,限制性內切酶Cla I與限制性內切酶BamH 1、10XK Buffer、C0MT1-pMD19_T載體、二次蒸餾水的體積比為I:1:2:6:10 ;取pKannibal+載體、10XK Buffer、限制性內切酶Cla 1、限制性內切酶BamH1、二次蒸餾水,37°C反應2小時30分鐘,限制性內切酶Cla I與限制性內切酶BamH IUOXKBuffer、pKannibal+載體、二次蒸懼水的體積比為I:1:2:6:10。
5.根據權利要求1 所述的用番茄基因和丹參內源基因提高丹參抗蟲和活性成分的方法,其特徵在於在本發明的構建含有番茄prosystemin基因和丹參咖啡醯_0_甲基轉移酶基因幹涉片段的植物表達載體的步驟⑵中,所述的用Sac I和Pst I雙酶切pKANNIBAL/COMTi, pCAMBIA1302-prosystemin 載體為:取 pKANNIBAL/COMTi 載體、IOXM Buffer、限制性內切酶Sac 1、限制性內切酶Pst 1、二次蒸餾水,37°C反應3小時,限制性內切酶Sac 1、限制性內切酶Pst IUOXM Buffer、pKANNIBAL/COMTi載體、二次蒸餾水的體積比為I:1:2:6:10 ;取口0六1^從-1302-口1'0878七611^11載體、10\]\^1^€61'、限制性內切酶530 1、限制性內切酶Pst 1、二次蒸餾水於37°C反應3小時,限制性內切酶Sac I與限制性內切酶Pst IUOXMBuffer、pCAMBIA1302_prosystemin 載體、二次蒸懼水的體積比為 1:1:2:6:10。
【文檔編號】C12N15/82GK104004747SQ201410234203
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】王喆之, 陳塵, 張璇 申請人:陝西師範大學