以粘蛋白1和生存素為靶點的腫瘤dna疫苗及病毒載體疫苗的製作方法

2023-12-09 02:13:41

以粘蛋白1和生存素為靶點的腫瘤dna疫苗及病毒載體疫苗的製作方法
【專利摘要】本發明涉及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領域。具體地說，本發明涉及重組DNA載體VR-S8和VR-MS、重組腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重組痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒載體疫苗以及病毒載體疫苗之間免疫方式的優化組合在製備抗腫瘤疫苗中的用途。
【專利說明】以粘蛋白1和生存素為靶點的腫瘤DNA疫苗及病毒載體疫苗
[0001]本申請為分案申請，其原申請的申請日為2009年12月4日，申請號為200910252427.X，名稱為「以粘蛋白I和生存素為靶點的腫瘤DNA疫苗及病毒載體疫苗」。
【技術領域】
[0002]本發明涉及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領域。具體地說，本發明涉及重組DNA載體VR-S8和VR-MS、重組腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重組痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒載體疫苗以及病毒載體疫苗之間免疫方式的優化組合在製備抗腫瘤疫苗中的用途。
【背景技術】
[0003]生存素(Survivin)是抑制凋亡蛋白(IAP)家族成員，具有抗凋亡和調控細胞分裂的雙重功能，廣泛表達於各種胚胎組織和癌細胞中，但在正常終末分化細胞中不表達。這些特點使生存素成為腫瘤發生，發展和治療等領域中的一個新靶點。
[0004]目前的研究表明生存素在腫瘤基因治療中具有潛在價值:它的腫瘤特異性表達，及其與預後不良、藥物抗性和病人生存期縮短等呈正相關。針對生存素及其突變體等進行的腫瘤免疫治療已成為人們關注的熱點。目前國內外策略有(參見Li，F.et al.，2006 ;Li, F.，2003 ；Altieri, D.C.，2008): (I)利用生存素啟動子的腫瘤特異性表達進行的腫瘤靶向基因治療；(2)針對生存素本身的治療策略:a)生存素的反義或全長的cDNA或反義核苷酸表達載體策略，比較適合生存素的功能研究和前臨床研究，但用全長的生存素可能有潛在的危險；b)生存素功能陰性突變體(dominant negative mutant, DNM)策略,主要是SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不適用於直接的癌症治療；c)生存素核酶方案，即用生存素mRNA特異性核酶剪切生存素mRNA以降低生存素的表達，此方案也是一種有效的研究工具，但不適用於癌症臨床治療；d)生存素RNAi技術，目前的研究表明:RNAi能有效的使哺乳動物基因表達沉默，可用於基因功能研究，但昂貴的費用限制其臨床應用；e)用小分子有機物或小肽抑制生存素的表達或幹擾其功能；f)用生存素特異性表位的免疫治療，這是一個很吸引人的領域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。
[0005]因為生存素具有抗凋亡的功能，如果用其全長來設計疫苗可能存在安全隱患，根據國內外策略的優點和弊端擬採用生存素抗凋亡功能缺失剪切體來設計疫苗，在保證其抗凋亡功能缺失的情況下儘量保存長度以提高免疫原性。因此本發明採用生存素的抗凋亡功能缺失剪切體來設計疫苗。生存素在體內是以二聚體形式起作用的，它N-端第6、第7和第10位的三個胺基酸是形成二聚體的關鍵胺基酸(參見Shi, Y.et al.，2000);生存素的第5位至第14位胺基酸是HLA-A2的特異性抗原表位(參見Andersen, Μ.H.et al.，2001)，基於這兩點本發明首次設計了剪切體S8(即切去生存素N-端7個胺基酸)，希望可以破環它的二聚體結構，從而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8為靶點來設計疫苗可能會提高疫苗的安全性。
[0006] 粘蛋白I(MUCl)是粘蛋白家族成員，是跨膜糖蛋白，存在於正常腺管上皮細胞及其來源的腫瘤細胞表面，由多肽核心和側枝糖鏈構成。其核心肽胞外段含有數目不等的串聯重複區(VNTR)。正常組織中MUCl分布於腺管上皮細胞分泌極，與免疫細胞相對隔離，糖基化豐富；而在腫瘤組織，其廣泛分布並異常豐富地表達於細胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細胞攻擊的靶點，並且表達增強，可達正常細胞的100倍以上，因此MUCl是較理想的抗腫瘤靶分子。
[0007]MUC1VNTR中的PDTRP序列是B細胞及T細胞共同識別的表位，可與MUCl特異性抗體及細胞毒性T淋巴細胞(CTL)相結合，故稱這個最具免疫原性的部位為免疫顯性結構域，因此，目前大部分利用MUCl研究免疫治療的都是集中在VNTR區域(參見Singh，R.et al., 2007 ；Persson, J.et al., 2006 ；Xing, P.X.et al., 1992 ；Tang, C.K.et al., 2008 ；Tang, C.K.et al.，2008)。從發現MUCl到現在已用其進行了很多的疫苗研究工作，並有一些疫苗已經進入人類臨床研究階段，但大多數都是傳統的多肽類、蛋白類或樹突狀細胞(DC)類疫苗，這些疫苗大多都存在免疫原性差或製備困難等問題；進入臨床的基因疫苗主要是重組痘病毒疫苗，雖然沒有檢測到毒性，但直接用重組痘病毒疫苗初免-加強還是存在較大的安全隱患，而且產生的臨床效果也不是很理想；DNA載體疫苗由於免疫原性較弱目前還基本處於臨床前研究階段。
[0008]本發明發明人的前期研究表明增加VNTR的數目可在一定程度上增強MUCl的免疫效果(參見Zhang Set al., 2008)，如33個拷貝的MUC1VNTR串聯重複序列引起的免疫應答明顯強於2個拷貝的MUC1VNTR串聯重複序列引起的免疫應答，因此本發明選用含有33個的串聯重複序列MUC1VNTR作為抗原來設計疫苗，並將其與S8融合表達來構建融合表達疫苗以增強疫苗免疫的廣譜性和有效性，目前將生存素和MUC1VNTR聯合應用進行腫瘤治療還未見報導。

【發明內容】

[0009]本發明提供了一種DNA片段S8，所述S8片段的序列為SEQ ID NO:8。 [0010]本發明提供了一種重組質粒VR-S8，其中所述重組質粒的骨架載體為如圖1A的VR1012，在所述VR1012的多克隆位點中所述的S8片段。優選地，所插入的S8片段位於VR1012的多克隆位點SalI和BamHI之間。
[0011]本發明提供了一種SEQ ID NO:9所示的DNA片段MS，所述序列MS包含一個含有33個拷貝的MUC1VNTR的DNA片段33M和所述的S8片段。
[0012]本發明提供了一種重組質粒VR-MS，其特徵在於所述重組質粒的骨架載體為VR1012，在所述VR1012的多克隆位點中插入了所述的MS片段。優選地，所插入的MS片段位於VR1012的多克隆位點SalI和BamHI之間。
[0013]本發明提供了一種重組腺病毒Ad_S8，其特徵在於在腺病毒中插入了所述的S8片段。優選地，所述重組腺病毒的骨架載體為pBHGloxAEl，3Cre，所插入的S8片段位於所述重組腺病毒的多克隆位點EcoRI和BglII之間
[0014]本發明提供了一種重組腺病毒Ad-MS，其特徵在於在腺病毒中插入了所述的MS片段。優選地，所述重組腺病毒的骨架載體為pBHGloxAEl，3Cre，所插入的MS片段位於所述重組腺病毒的多克隆位點BglII處。
[0015]本發明提供了一種重組改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，其特徵在於在所述重組改良安卡拉痘苗病毒中插入了所述的MS片段。優選地，所插入的MS片段位於所述重組改良安卡拉痘苗病毒的多克隆位點SalI和KpnI之間。
[0016]本發明提供了所述的S8片段或所述的MS片段在製備用於進行抗腫瘤免疫的蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗或樹突狀細胞疫苗中的用途。
[0017]在一個優選的實施方中，上述疫苗中包含免疫佐劑和/或化療藥物，其中所述免疫佐劑選自細胞因子白介素2(IL-2)、細胞因子粒-巨細胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列，其中所述化療藥物選自卡鉬、順鉬、奧沙利鉬和紫杉醇。
[0018]本發明首先以S8為靶點進行腫瘤基因疫苗的研究，分別構建DNA載體疫苗(VR-S8)和腺病毒載體疫苗(Ad-S8)，採用DNA初免-重組腺病毒加強免疫(DNA prime-rAdboost)免疫策略，同時採用表達白細胞介素2 (IL2)的質粒(VR-1L2)作為免疫佐劑，通過免疫小鼠檢測S8基因疫苗的免疫原性及抗腫瘤活性，結果表明:小鼠可產生針對S8的特異性抗體(見圖4)和CTL(見圖5);該疫苗具有一定的抗腫瘤活性，在預防性實驗中，與PBS組比較，VR-S8/VR-1L2/Ad-S8疫苗免疫組模型小鼠腫瘤生長抑制率為68.54%，生存期延長了 35.6% (見圖6)。在治療性實驗中，與PBS組比較，VR-S8/VR-1L2/Ad-S8疫苗免疫組模型中小鼠腫瘤生長受到了明顯的抑制(抑制率為23.42%)，但並沒有明顯延長模型小鼠的生存期(見圖7)。
[0019]本發明採用生存素和MUCl為靶點設計融合表達基因疫苗。由於MUCl基因的多態性決定了不同個體間VNTR數目的不同，最常見的為含有30-90個連續重複序列，根據自行構建MUC1VNTR基因的特點選擇以33個重複區序列(簡稱為33M，該序列含有33個VNTR的串聯重複序列，每個重複序列之間有6個由於構建引入的酶切位點的鹼基序列，)來構建MUC1DNA載體疫苗(VR-33M)，同時構建33M與S8融合表達的DNA載體疫苗(VR-MS)。通過免疫模型小鼠檢測融合表達 基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性與二者單獨表達的疫苗相比是否有明顯的提高，結果表明生存素和MUCl融合表達基因疫苗的免疫效果明顯強於二者單獨表達的疫苗的免疫效果，例如:在對腫瘤的預防性研究中，融合表達疫苗免疫組與生存素疫苗單獨免疫組相比抑瘤率提高了 134%，生存期延長了 166%;與MUCl單獨免疫組比較，抑瘤率提高了 25%，生存期延長了 73% (見圖12)。為了進一步加強MS疫苗的免疫效果又構建了其病毒載體疫苗(Ad-MS和MVA-MS)，採用DNA初免-重組腺病毒加強免疫的免疫策略，同時採用表達IL2的質粒作為免疫佐劑，通過免疫模型小鼠檢測融合表達基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性，結果表明DNA初免-重組腺病毒加強的免疫策略能明顯抑制模型小鼠腫瘤的生長，並有效延長小鼠的生存期；IL2也顯示出了明顯的佐劑增強作用(見圖 13)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1.DNA載體及重組DNA載體疫苗圖譜。A為VR1012載體圖譜；B為重組質粒VR-S8圖譜；C為重組質粒VR-33M圖譜；D為重組質粒VR-MS圖譜。
[0021]圖2.重組腺病毒載體圖譜及製備流程。A為AdMax?腺病毒載體及重組病毒製備流程；B為穿梭載體PDC316圖譜；C為重組穿梭載體PDC316-S8圖譜；D為重組穿梭載體PDC316-MS 圖譜。
[0022]圖3.MVA重組原理及相關載體圖譜。A為MVA重組示意圖；B為穿梭載體pSCll圖譜；c為重組穿梭載體PSCll-MS圖譜，MS結構基因表達框架重組到MVA的TK基因中，基因表達的啟動子採用P7.5。
[0023]圖4.小鼠免疫血清抗S8抗體的檢測。C57/BL小鼠經PBS (2)、VR-1L2 (3)、VR-S8 (4)，VR-S8/VR-1L2 (5)，VR-S8/VR-1L2/Ad_S8 (6)免疫後，以小鼠的血清作為一抗，以表達S8的C0S-7細胞裂解上清作為檢測小鼠血清的抗原，以S8單克隆抗體作為陽性對照(I)，進行蛋白質印跡(Western-blot)檢測的結果。
[0024]圖5.以不同形式S8基因疫苗免疫後，小鼠脾淋巴細胞的特異性CTL殺傷活性檢測。從被免疫小鼠脾細胞中分離的淋巴細胞為效應細胞，並用特異性抗原肽(H-2d限制性)標記的小鼠肺癌細胞株B16作為靶細胞，採用非放射性LDH釋放法檢測免疫鼠的CTL應答。
[0025]圖6.不同形式S8基因疫苗對MSf+B16(購自ATCC)腫瘤細胞體內生長的免疫預防作用。C57BL/6 小鼠經 PBS 對照組、VR-1L2、VR-S8、VR-S8/VR-1L2 以及 VR-S8/VR-1L2/Ad_S8在經隔周免疫四次後一周，接種MSf+B16腫瘤細胞，測量腫瘤大小⑷至26天，生存情況觀察至腫瘤接種後50天(B)。
[0026]圖7.不同形式S8基因疫苗對MS/B16腫瘤細胞體內生長的免疫治療作用。在給C57BL/6小鼠皮下接種MSf+B16腫瘤細胞後，分別給予PBS對照組、卡鉬(Carboplatin)、VR-S8/VR-1L2/Ad-S8和VR-S8/VR-1L2/Ad_S8/卡鉬疫苗，測量腫瘤大小(A)至27天，生存情況觀察至腫瘤接種後50天(B)。
[0027]圖8.小鼠免疫血清抗S8、33M及MS抗體的檢測。C57/BL小鼠經PBS (I)、VR_S8⑵、VR-33M(3) ,VR-MS (4)免疫後，以小鼠的血清作為一抗，以表達MS的C0S-7細胞裂解物作為抗原，進行蛋白質印跡檢測的結果。
[0028]圖9.MS疫苗與單獨表達生存素和MUCl的疫苗誘導小鼠產生特異性CTL殺傷活性的比較。從被免疫小鼠脾細胞中分離的淋巴細胞為效應細胞，並用生存素㈧和MUCl (B)特異性抗原肽(H-2d限制性)標記的小鼠肺癌細胞B16作為靶細胞，採用非放射性LDH釋放法檢測免疫鼠的CTL應答。
[0029]圖10.小鼠免疫血清抗MS抗體的檢測。C57/BL小鼠經PBS (I)、VR-1L2 (2)、VR-MS (3)、VR-MS/VR-1L2 (4)、VR-MS/VR-1L2/Ad-MS (5)免疫後，以小鼠的血清作為一抗，以表達MS的C0S-7細胞裂解物作為抗原，進行蛋白質印跡檢測的結果。
[0030]圖11.基於MS基因疫苗不同形式免疫後，小鼠脾淋巴細胞的特異性CTL殺傷活性檢測。從被免疫小鼠脾細胞中分離的淋巴細胞為效應細胞，並用生存素(A)和MUCl (B)特異性抗原肽(H-2d限制性)標記的小鼠肺癌細胞B16作為靶細胞，採用非放射性LDH釋放法檢測免疫鼠的CTL應答。
[0031]圖12.MS疫苗與單獨表達生存素和MUCl的疫苗對模型小鼠免疫預防效果比較。C57BL/6小鼠經PBS對照組、VR-S8、VR-33M以及VR-MS在經隔周免疫三次後一周，接種MSf+B16腫瘤細胞，測量腫瘤大小(A)至26天，生存情況觀察至腫瘤接種後50天(B)。
[0032]圖13.不同形式MS基因疫苗對MS/B16腫瘤細胞體內生長的免疫治療作用。在給C57BL/6小鼠皮下接種MSf+B16腫瘤細胞後，分別給予PBS對照組、卡鉬、VR-MS/VR-1L2/Ad-MS、VR-MS/VR-1L2/MVA-MS 以及 VR-MS/VR-1L2/Ad_MS/ 卡鉬組，測量腫瘤大小(A)至 27天，生存情況觀察至腫瘤接種後50天(B)。【具體實施方式】
[0033]一.上述片段33M和S8的製備方法和條件
[0034]1.33M 的製備
[0035]MUC1VNTR為一個含有60個鹼基的重複片段，GenBank號為NM_002456 (SEQ IDNO:1)。根據一個VNTR的鹼基序列設計了兩對引物，採用重疊延伸PCR技術(SOE PCR)合成I個VNTR(Im)重複區片段，然後利用限制性內切酶SalI和XhoI酶切產生相同粘性末端的特性，依次進行連接，構建33M基因片段。具體方法如下:
[0036]I)重疊延伸PCR技術
[0037]PCR 反應條件為:95°C 20s、55°C 20s、72°C 30s，進行 30 個循環，利用引物 Pl (SEQID NO: 2)和 P2(SEQ ID NO: 3)擴增出無 ATG 的 I 拷貝 MUC1VNTR(簡寫為 m)，以 P2 和 P3 (SEQID NO:4)為引物擴增出含ATG的I拷貝 MUC1VNTR(簡寫為Am)片段。
[0038]2)pGEM-T-33M的構建、酶切鑑定及序列分析
[0039]將上述PCR產物m和Am分別和pGEM-T-easy (Promega公司)載體進行連接，分別獲得含有所述m和Am片段的pGEM-T-m和pGEM-T_Am兩個質粒，然後利用限制性內切酶SalI和XhoI酶切產生相同粘性末端的特性，依次進行連接獲得含有所述33M片段的PGEM-T-33M質粒，經SalI和XhoI酶切鑑定後進行序列分析，測序結果正確。具體過程即先將pGEM-T-m用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷m，然後再將其插入pGEM-T-m的XhoI位點，即得到pGEM-T-2m。然後再將pGEM-T_2m用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷2m，然後再將其插入pGEM-T-2m的XhoI位點，即得到pGEM-T_4m，同理得pGEM-T_32m，然後再將pGEM-T-Am用SalI和XhoI雙酶切得目的片斷Am，然後再將其插入pGEM-T-32m的SalI位點，即得到了質粒 pGEM-T-33m。
[0040]2.S8 的製備
[0041]生存素，GenBank號為NM_001168，根據生存素的序列設計了兩對引物，採用RT-PCR技術從293細胞的總RNA中擴增出了 S8的基因片段，序列為SEQ NO:8所示的鹼基序列。具體方法如下:
[0042]I) RT-PCR 技術
[0043]採用TRIzol RNA提取試劑盒(Gibco公司)提取293細胞的總RNA，採用Super-Script反轉錄酶試劑盒(Gibco公司)從中獲得293細胞的cDNA，然後以其為模板，以 P4(SEQ ID NO:5)和 P5 (SEQ ID NO:6)為引物進行 PCR(反應條件為:95°C 30s,55°C 30s、72°C lmin，進行30個循環)擴增生存素cDNA。
[0044]2)pGEM-T-S8的構建、酶切鑑定及序列分析
[0045]將生存素cDNA的PCR產物與pGEM-T-easy載體進行連接得到含有生存素cDNA的pGEM-T-Surv質粒。經序列分析證實正確後，以pGEM_T_Surv為模板，以P6 (SEQ ID NO: 7)和P5為引物通過PCR擴增S8片段(SEQ ID NO:8)，正向引物P6引入EcoR1、XbaI和SalI的酶切位點，反向引物P5引入了 BamHI的酶切位點。將S8PCR產物連入pGEM-T-easy載體獲得含有所述S8片段的pGEM-T-S8質粒，經SalI和BamHI酶切鑑定後進行序列分析，測序結果正確。
[0046]二.重組疫苗的獲得方法及相應的條件
[0047]1.DNA載體疫苗[0048]1)VR_33M 的構建
[0049]VR1012載體(VR1012是Vical公司開發的經美國FDA正式批准的可以用於人體基因疫苗臨床試驗的載體，已經完成的臨床試驗表明其在人體的應用是安全的，該載體的構建過程參見文獻(Human Gene Therapyl996, 7:1205-1217))含有CMV啟動子，卡那黴素抗性基因，內含子A和BGH PolyA翻譯終止信號等常規部件組成，共4913bp，圖譜見圖1A。
[0050]將上述製得的pGEM-T-33M質粒經Sall/Xhol雙酶切後用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收33M基因片段，將真核表達載體VR1012載體經SalI單酶切後用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收載體片段，利用經SalI和XhoI酶切後具有相同粘性末端這一性質將所回收的目的基因片段和載體片段，以T4DNA連接酶，在16°C下連接3h。用所得連接產物轉化感受態大腸桿菌ToplO (invitrogen公司)，塗布卡那黴素抗性的LB平板，並於37°C下培養過夜，挑選陽性菌落於5mlLB培養基中37°C下培養16h，l，2000rpm離心收穫菌體，用質粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質粒，用Sall/BamHI進行雙酶切和測序鑑定，結果正確，即得到了重組質粒VR-33M，圖譜見圖1C。
[0051]2)VR_S8 的構建
[0052]將pGEM-T-S8和真核表達載體VR1012載體分別經Sall/BamHI雙酶切，用膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收目的基因片段S8和VR1012載體片段，用T4DNA連接酶，16°C連接3h。用所得連接產物轉化感受態大腸桿菌ToplO (invitrogen公司)，塗布卡那黴素抗性的LB平板，並於37°C下培養過夜，挑選陽性菌落於5mlLB培養基中37°C下培養16h，I, 2000rpm離心收穫菌體，用質粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質粒，用 Sall/BamHI進行雙酶切和測序鑑定，結果正確，即得到了重組質粒VR-33M，圖譜見圖1B0
[0053]3) VR-MS 的構建
[0054]將pGEM-T-33M經Sall/Xhol雙酶切後回收目的基因片段33M，將VR-S8載體經SalI單酶切後回收載體片段，利用經SalI和XhoI酶切後具有相同粘性末端這一性質將回收目的基因片段和載體片段用T4DNA連接酶，16°C連接3h。獲得VR-33M-S8，簡稱VR-MS質粒，用Sall/BamHI進行雙酶切和測序鑑定，結果正確，即得到了重組質粒VR-MS，圖譜見圖1D0
[0055]MS序列為如SEQ ID NO:9所示的鹼基序列。
[0056]2.重組腺病毒疫苗(Ad_S8、Ad-MS)的獲得
[0057]腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒,基因組長約36kb,衣殼呈規則的20面體結構,直徑約80-110nm。腺病毒基因組的兩端各有一段IOObp的反向末端重複序列(ITR)，是複製的起始位點。在左端ITR的3'側有一段長約300bp的包裝信號(Ψ)介導腺病毒基因組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(Ψ)的約0.5kb的序列是順式作用元件，即必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30餘種蛋白都可以通過輔助病毒(或細胞)反式補足。
[0058]本實驗中米用的腺病毒系統是AdMax? Adenovirus載體系統(Microbix公司)，該系統是位點特異性重組系統，位點特異性重組是發生在兩條DNA鏈特異位點上的重組，重組的發生需一段同源序列即特異性位點和位點特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶只能催化特異性位點間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。據此，位點特異性重組又稱保守重組，該重組過程不需RecA酶參與。目前應用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統，其中Cre、FLP和BP均為特異性重組酶，屬重組酶λ整合酶家族，它們催化的反應類型、靶位點及重組機制十分相似，1xP, FRT和attBP為特異性位點，也有相似的結構。AdMaxTM Adenovirus載體應用的是Cre/loxP系統，Cre基因表達產物為343個胺基酸的單聚體蛋白，分子量為38kDa，它是位點特異性重組發生所需的特異性重組酶，其識別位點被稱為loxPdocus ofcrossing-over PI),為一段34bp的DNA序列，由兩個13bp的反向重複序列和一個8bp的不對稱間隔序列(又稱為核心序列)組成5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。1xP位點鹼基重排後形成十字形的結構，核心序列形成一單鏈環，它為Cre重組酶切割的底物，也是DNA識別與重組的位點，對稱的13bp反向重複序列是Cre重組酶結合的序列。
[0059]AdMaxTM Adenovirus載體系統是由穿梭載體和骨架載體(pBHGlox Δ El, 3Cre)構成，各含有一個同向排列的LoxP位點，其中骨架載體還含有由CMV啟動子調控的Cre基因。將穿梭載體與骨架載體共轉染包裝細胞株293，骨架載體所攜帶的Cre基因開始表達，介導兩個LoxP位點之間的重組，剪切掉骨架載體上的細菌內複製元件、抗性基因以及Cre基因，同時完成目的基因的插入。由於骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少形成有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號(Ψ)，而穿梭載體則含有Ψ，因此只有在兩個載體之間發生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒；另外，骨架載體缺失El基因，因此需要轉染組成型表達El蛋白的293細胞。將骨架載體和穿梭載體(本研究選用的穿梭載體為pDC316，圖譜見圖2B)共轉染293細胞，利用293細胞中的El蛋白，10左右天就可以產生出含有外源基因的重組腺病毒噬斑(見圖2A)，挑取噬斑，進行PCR(反應條件為:95°C 30s,53°C 30s,72°C lmin，進行30個循環)鑑定，選取正確的克隆進行大量擴增、純化和滴度測定。
[0060]I)穿梭重組質粒pDC316-S8和pDC316_MS的獲得
[0061]將pGEM-T-S8用EcoRI/BamHI雙酶切後回收得到S8目的片段，將pDC316用EcoRI/Bgin雙酶切後回收作為載體，利用BamHI和Bgin具有相同粘性末端的性質，將回收目的基因片段和載體片段用T4DNA連接酶，16°C連接3h。用所得連接產物轉化感受態大腸桿菌ToplO (Invitrogen公司),塗布卡那黴素抗性的LB平板,並於37°C下培養過夜,挑選陽性菌落於5mlLB培養基中37°C下培養16h，I, 2000rpm離心收穫菌體，用質粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質粒，用EcoRI/Bgin進行雙酶切和測序鑑定，結果正確，即得到了重組質粒pDC316-S8(圖譜見圖2C)質粒。將VR-MS用Bgin單酶切後回收得到MS目的片段，將PDC316用Bgl Π單酶切後回收作為載體，將回收目的基因片段和載體片段進行連接，經雙酶切和測序鑑定結果正確，即獲得pDC316-MS(圖譜見圖2D)質粒。
[0062]2) Ad-S8和AchMS重組病毒的獲得
[0063]將pBHGlox Λ El, 3Cre 和 pDC316_S8 或 pDC316_MS 共轉染 293 細胞後，經過篩選、擴增、純化後，獲得分別含有S8和MS片段的重組腺病毒Ad-S8或Ad-MS。
[0064]3.重組MVA疫苗(MVA-MS)的獲得
[0065]改良安卡拉痘苗(MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量大等優點使其得以廣泛應用於腫瘤免疫治療中。MVA含有胸苷激酶基因(TK)(參見圖3A)；pSCll(參見圖3B)是它的穿梭質粒，具有多克隆酶切位點可以插入外源基因、具有胸苷激酶的左臂和右臂(TKL、TKR)可以與MVA進行同源重組，同時含有IacZ基因，可以用於重組MVA(rMVA)的藍斑篩選。所述MVA系統(含穿梭質粒pSCll)購自ATCC。
[0066]I)穿梭重組質粒pSCll-MS的獲得
[0067]將VR-MS和pSCll經Sall/Kpnl雙酶切後回收，將回收目的基因片段MS和PSCll載體片段用T4DNA連接酶，16 °C連接3h。用所得連接產物轉化感受態大腸桿菌ToplO (invitrogen公司),塗布卡那黴素抗性的LB平板,並於37°C下培養過夜,挑選陽性菌落於5mlLB培養基中37°C下培養16h，12000rpm離心收穫菌體，用質粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質粒，用Sall/Kpnl進行雙酶切和測序鑑定，結果正確，即得到了重組質粒PSCll-MS (見圖3C)。
[0068]2) MVA-MS重組病毒的獲得
[0069]首先以滴度0.05pfu/cell 的 MVA 感染 tk_tsl3 細胞(購自 ATCC，ATCC號為CRL-1632?，是不含有TK基因的BHK-21的突變株)。感染2小時後，利用Lipofection2000 (INVITROGEN)的方法將 pSCll-MS 轉染到感染了 MVA 的 tk_tsl3 細胞中。MVA在tk-tsl3細胞內複製的過程中，由於pSCll-MS具有與MVA的TK基因同源的TKL和TKR,所以有一定比例的MVA病毒與pSCl 1-MS發生重組，結果MS和LacZ閱讀框架被重組到MVA病毒 基因組中。形成如圖3C所示的MVA-MS重組病毒。
[0070]以上被感染細胞培養三天後，收集細胞，裂解細胞，超聲波處理，2000rpm離心IOmin除去細胞殘渣保留上清。取一定量上清，作為種毒，在6孔板中將病毒依次稀釋成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6，感染tk-tsl3細胞2h。將等體積的在45°C下預溫的2%低熔點瓊脂糖和2 X DMEM-10/BrdU (BrdU, 5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸化的BrdU可摻入到野生型MVA中，產生致死性突變，從而可以使野生型MVA逐漸減少)培養基混勻，每孔加入3ml培養基，在室溫下凝固，在37°C下於含5% CO2的培養箱中培養48h。鋪上層選擇性培養基，成分比下層瓊脂多了 1/120體積的4%X-gal。培養過夜，挑選藍色單斑，反覆凍融三次裂解釋放病毒，進行下一輪的篩選，步驟相同，如此進行6輪以上篩選，最後直至得到只含重組病毒MVA-MS的克隆株。
[0071]三.疫苗免疫效果
[0072]1.S8疫苗免疫效果
[0073]1.1S8疫苗的免疫原性
[0074]本部分實驗從體液免疫和細胞免疫兩個方面探討生存素DNA疫苗和重組腺病毒疫苗，以及其與IL-2質粒共免疫誘導小鼠的免疫應答。實驗將C57/BL/6小鼠按表1進行分組，I組在第0、2、4、6周注射PBS ；2-4組在第0、2、4、6周注射VR-S8疫苗及VR-1L2佐劑；5組在第0、2、4周注射VR-S8DNA疫苗及VR-1L2佐劑，在第6周注射重組腺病毒疫苗。考察生存素DNA單獨免疫的免疫效果、IL-2質粒的佐劑效果，以及重組腺病毒的免疫增強作用。
[0075]表1S8疫苗免疫原性
[0076]
【權利要求】
1.一種序列為SEQ ID NO:8的DNA片段S8片段在製備用於進行抗腫瘤免疫的蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗或樹突狀細胞疫苗中的用途。
2.—種重組質粒VR-S8在製備用於進行抗腫瘤免疫的DNA疫苗中的用途，其中所述重組質粒的骨架載體為如圖1A的VR1012，在所述VR1012的多克隆位點中插入一種序列為SEQID NO:8的DNA片段S8片段。
3.權利要求2所述的用途，其中所插入的S8片段位於所述VR1012的多克隆位點SalI和BamHI之間。
4.權利要求2或3中所述的用途，其中所述疫苗中還包含重組腺病毒Ad-S8，並且其中以VR-S8進行初免，以Ad-S8進行加強免疫，其中所述重組腺病毒Ad-S8是在腺病毒中插入一種序列為SEQ ID NO:8的DNA片段S8片段。
5.權利要求4中所述的用途，其中所述重組腺病毒的骨架載體為pBHGloxAEl,3Cre,所插入的S8片段位於所述重組腺病毒的多克隆位點EcoRI和BglII之間。
6.權利要求2-5中任一項所述的用途，其中所述疫苗中還包含免疫佐劑，並且其中所述免疫佐劑與所述VR-S8 —同給予。
7.權利要求6中所述的用途，其中所述免疫佐劑選自細胞因子白介素2(IL-2)、細胞因子粒-巨細胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲基化的CpG基序免疫刺激DNA序列。
8.權利要求2-7中任一項所述的用途，其中所述疫苗中還包含化療藥物。
9.權利要求8中所述的用途，其中所述化療藥物選自卡鉬、順鉬、奧沙利鉬和紫杉醇。
【文檔編號】A61K39/00GK104013973SQ201410189139
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2009年12月4日 優先權日:2009年12月4日
【發明者】孔維, 張海紅, 於湘暉, 於永慧 申請人:長春百克生物科技股份公司