一種肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法

2023-12-08 20:49:26 2

一種肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法
【專利摘要】本申請提供一種肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，該檢測方法包括以下步驟：(1)前處理，將樣品放入前處理液中振蕩，然後離心分離，去清液，得到固體殘渣；(2)所述固體殘渣的處理，樣品固體殘渣提取液中加入衍生化劑，在加熱、酸性、惰性氣體保護條件下進行衍生化處理，所述衍生化處理完成後再冷卻、調節pH至中性，再離心取得上清液，再將所述上清液通過固相萃取柱，然後用淋洗液進行淋洗，再用洗脫液進行洗脫處理，得到洗脫液，所述洗脫液濃縮乾燥，再用復溶液進行復溶，便得樣品溶液。本發明的檢測方法可以適用於各種動物源性樣品，可以將水解衍生化過程縮短至30-60分鐘，整個檢測過程縮短到60-120分鐘。
【專利說明】一種肉品中硝基映喃類藥物代謝物的檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種藥物殘留檢測的監測方法，尤其涉及一種肉品中硝基呋喃類藥物 代謝物的檢測方法。

【背景技術】
[0002] 目前，農業部193號公告明確規定硝基呋喃類藥物嚴禁用於食用動物，但因為其 在治療腸道細菌感染等方面療效明顯，並且價格低廉，在畜禽養殖中還存在非法使用。硝 基呋喃類藥物殘留主要檢測其代謝物：3-氨基-2-唑烷基酮（Α0Ζ)、5_甲基嗎啉-3-氨 基_ 2_唑烷基酮（ΑΜ0Ζ)、氨基脲（SEM)、1-氨基乙內醯脲（AHD)。大部分硝基呋喃代謝物與 蛋白結合緊密，只有小部分以游離態形式存在，其水解衍生化是檢測的關鍵環節。
[0003] 目前檢測硝基呋喃類藥物代謝物殘留的代表性的方法主要有：
[0004] (1) "GB/T 20752-2006豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留 量的測定液相色譜-串聯質譜法"
[0005] (2)酶聯免疫法
[0006] (3)《中華人民共和國國家標準農業部1〇77號公告-2-2008》"水產品中硝基呋喃 類代謝物殘留量-高效液相色譜法"
[0007] 上述方法⑴和⑵的前處理，均需要經過16小時的水解衍生化過程。方法⑶ 只用於檢測水產品中的代謝物，並且試劑較為複雜，不能對雞肉、豬肉，動物肝臟等動物源 性食品中硝基呋喃代謝物進行準確的檢測。


【發明內容】

[0008] 本發明旨在解決現有技術只能檢測水產品中的代謝物，並且試劑較為複雜，不能 對雞肉、豬肉，動物肝臟等動物源性食品中硝基呋喃代謝物進行準確的檢測的問題，進而提 出一種可以快速檢測硝基呋喃類藥物代謝物殘留的檢測方法。
[0009] 本申請提供了一種肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，該檢測方法包括以 下步驟：
[0010] ⑴前處理
[0011]將樣品放入前處理液中振蕩，然後離心分離，去清液，得到固體殘渣；
[0012] ⑵所述固體殘渣的處理
[0013] 樣品固體殘渣提取液中加入衍生化劑，在加熱、酸性條件下進行衍生化處理，衍生 化完成後冷卻、調節pH至中性，再離心取得上清液，再將所述上清液通過固相萃取柱，然後 用淋洗液進行淋洗，再用洗脫液進行洗脫處理，得到洗脫液，所述洗脫液濃縮乾燥，再用^復 溶液進行復溶，便得樣品溶液。
[0014]其中，在進行所述衍生化處理時，所述提取液中所述衍生化劑的濃度為〇. lmm〇1/ L〇
[0015] 其中，所述衍生化劑為2-硝基苯甲醛的二甲基亞碸溶液。
[0016] 其中，所述衍生化處理的條件為：在惰性氣體保護的條件下進行所述衍生化處理， pH為0· 9-L 1，溫度為90-104°C，時間為30-60分鐘。
[0017] 其中，所述冷卻的溫度為0-15°C。
[0018] 其中，在將所述上清液通過固相萃取柱之前還包括以下步驟：使用過濾器對所述 樣品溶液進行過濾。
[0019] 其中，所述萃取液為甲醇的水溶液，甲醇體積含量為50% -90%。
[0020] 其中，所述淋洗液為水，
[0021] 所述洗脫液為乙酸乙酯，
[0022] 所述復溶液為氨水的甲醇溶液。
[0023] 其中，所述固相萃取柱為親脂親水平衡體反相萃取柱。
[0024] 其中，所述硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃西 林代謝物和呋喃妥因代謝物中的一種或幾種。
[0025] 與有關技術相比，本發明實施例的有益效果如下：
[0026] (1)本發明實施例的肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，適用於各種動物 源性樣品，樣品先用甲醇/水洗後，再檢測樣品固體殘渣中結合態的硝基呋喃代謝物，並且 所使用的水解衍生化劑進行衍生化前處理，可以將硝基呋喃類藥物代謝物殘留檢測的水解 衍生化過程縮短至30-60分鐘，整個檢測過程縮短到60-120分鐘。
[0027] (2)本發明實施例的肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，前處理過程適合 於豬、牛、雞等動物的肌肉、肝、腎等組織以及雞蛋、水產品等動物源性食品。
[0028] (3)本發明實施例的肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，試劑和反應條件 相對簡單，使殘留檢測的前處理更為方便、高效、標準。

【具體實施方式】
[0029] 下文中將對本發明的實施例進行詳細說明。需要說明的是，在不衝突的情況下，本 申請中的實施例及實施例中的特徵可以相互任意組合。
[0030] 實施例1
[0031] ⑴前處理
[0032] 稱量2g均質好的樣品（豬肉）在帶蓋的離心管中；加入l〇ml甲醇/水溶液（甲 醇含量70 % )，混勻，離心，棄去上清液，樣品固體殘渣留作下一步處理用。
[0033] (2)衍生化處理
[0034] 樣品固體殘渣提取液中加入2-硝基苯甲醛的二甲基亞碸溶液（在提取液中的濃 度為0. lmraol/L)和鹽酸溶液（在提取液中的濃度為0· 1-〇_ 2mol/L，即pH約為0. 9-1. 1)， 然後充入氮氣，並在氮氣環境中密封蓋好離心管蓋（這樣可以密閉避光，防止2-硝基苯甲 醛和硝基呋喃代謝物的衍生物不被氧化，提高衍生化效率）；在90-99-C水浴或90-1041的 空氣浴中衍生 3〇_60分鐘；冷卻水解衍生液至15°C以下；調節水解衍生液的pH值至中性， 並離心，取得上清液。
[0035] (3)過柱和復溶
[0036]將上清液通過固相萃取小柱（親脂親水平衡體反相萃取柱60mg填料，6mL容積，可 直接上樣），用水淋洗，並抽乾，用乙酸乙醋洗脫；吹乾洗脫液，用復溶液（氨水的甲醇溶液， 其體積比為50/50)進行復溶，得到樣品溶液。
[0037] 樣品溶液可用於液相色譜-紫外、液相色譜串聯質譜、酶聯免疫等方法檢測。
[0038] 實施例2
[0039] (1)前處理
[0040]稱量2g均質好的樣品（雞肝）在帶蓋的離心管中；加入2〇m]_甲醇/水溶液（甲 醇含量50% )，混勻，離心，棄去上清液，樣品固體殘渣留作下一步處理用。
[0041] (2)衍生化處理
[0042]樣品固體殘渣提取液中加入2-硝基苯甲酸的二甲基亞碸溶液（在提取液中的濃 度為0. lmmol/L)和鹽酸溶液（在提取液中的濃度為〇. 1-〇· 2m〇l/L,即pH約為〇· 9-1. 1), 然後充入氮氣，並在氮氣環境中密封蓋好離心管蓋（這樣可以密閉避光，防^t 2_硝基苯甲 醛和硝基呋喃代謝物的衍生物不被氧化，提高衍生化效率）；在99t：水浴中衍生 60分鐘； 冷卻水解衍生液至4°C ;調節水解衍生液的pH值至中性，並離心，取得上清液。
[0043] (3)過柱和復溶
[0044] 將上清液通過固相萃取小柱（親脂親水平衡體反相萃取柱60ing填料，6mL容積，可 直接上樣），用水淋洗，並抽千，用乙酸乙酯洗脫；吹乾洗脫液，用復溶液（氨水的甲醇溶液， 其體積比為 5〇/50)進行復溶，得到樣品溶液。
[0045] 樣品溶液可用於液相色譜-紫外、液相色譜串聯質譜、酶聯免疫等方法檢測。
[0046] 實施例3
[0047] (1)前處理
[0048] 稱量2g均質好的樣品（雞蛋）在帶蓋的離心管中；加入i〇mi甲醇/水溶液（甲 醇含量90% )，混勻，離心，棄去上清液，樣品固體殘渣留作下一步處理用。
[0049] (2)衍生化處理
[0050] 樣品固體殘渣提取液中加入2-硝基苯甲醛的二甲基亞碸溶液（在提取液中的濃 度為0· lmmol/L)和鹽酸溶液（在提取液中的濃度為0. 1-0. 2mol/L，即pH約為0.9-1. 1)， 然後充入氮氣，並在氮氣環境中密封蓋好離心管蓋（這樣可以密閉避光，防止2-硝基苯甲 醛和硝基呋喃代謝物的衍生物不被氧化，提高衍生化效率）；在90-1041：的空氣浴中衍生 30分鐘；冷卻水解衍生液至1°C ;調節水解衍生液的pH值至中性，並離心，取得上清液。
[0051] (3)過柱和復溶
[0052] 將上清液通過固相萃取小柱（親脂親水平衡體反相萃取柱60mg填料,6mL容積，可 直接上樣），用水淋洗，並抽千，用乙酸乙酯洗脫；吹乾洗脫液，用復溶液（氨水的甲醇溶液， 其體積比為50/50)進行復溶，得到樣品溶液。
[0053] 樣品溶液可用於液相色譜-紫外、液相色譜串聯質譜、酶聯免疫等方法檢測。
[0054] 測試例
[0055] (1)對實施例1-3的樣品進行檢測分析，其檢測分析條件如下：
[0056] 分析條件參照：GB/T 21：311-20〇7《動物源性食品中硝基呋喃類藥物藥物殘留量檢 測方法高效液相色譜/串聯質譜法》進行。具體質譜多反應檢測（MRM)參數如下表所示：
[0057] 硝基呋喃類藥物藥物殘留量檢測MRM參數
[0058]

【權利要求】
1. 一種肉品中硝基呋喃類藥物代謝物的檢測方法，其特徵在於，該檢測方法包括以下 步驟： (1) 前處理 將樣品放入前處理液中振蕩，然後離心分離，去清液，得到固體殘渣； (2) 所述固體殘渣的處理 樣品固體殘渣提取液中加入衍生化劑，在加熱、酸性條件下進行衍生化處理，衍生化完 成後冷卻、調節pH至中性，再離心取得上清液，再將所述上清液通過固相萃取柱，然後用淋 洗液進行淋洗，再用洗脫液進行洗脫處理，得到洗脫液，所述洗脫液濃縮乾燥，再用復溶液 進行復溶，便得樣品溶液。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其中，在進行所述衍生化處理時，所述提取液中所 述衍生化劑的濃度為0. lmm〇l/L。
3. 根據權利要求1或2所述的檢測方法，其中，所述衍生化劑為2-硝基苯甲醛的二甲 基亞碸溶液。
4. 根據權利要求1或2所述的檢測方法，其中，所述衍生化處理的條件為：在惰性氣體 保護的條件下進行所述衍生化處理，pH為0. 9-1. 1，溫度為90-104°C，時間為30-60分鐘。
5. 根據權利要求1或2所述的檢測方法，其中，所述冷卻的溫度為0-15°C。
6. 根據權利要求1或2所述的檢測方法，其中，在將所述上清液通過固相萃取柱之前還 包括以下步驟：使用過濾器對所述樣品溶液進行過濾。
7. 根據權利要求1或2所述的檢測方法，其中，所述萃取液為甲醇的水溶液，甲醇體積 含量為50% -90%。
8. 根據權利要求1所述的檢測方法，其中，所述淋洗液為水， 所述洗脫液為乙酸乙酯， 所述復溶液為氨水的甲醇溶液。
9. 根據權利要求1所述的檢測方法，其中，所述固相萃取柱為親脂親水平衡體反相萃 取柱。
10. 根據權利要求1所述的檢測方法，其中，所述硝基呋喃類藥物代謝物為呋喃唑酮代 謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物和呋喃妥因代謝物中的一種或幾種。
【文檔編號】G01N30/06GK104297384SQ201410453684
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月5日 優先權日:2014年9月5日
【發明者】郭黎明, 王宏衛, 饒欽雄, 張寶 申請人:北京華都肉雞公司