檢測呋喃西林代謝物的磁顆粒化學發光試劑盒及其應用的製作方法
2023-12-08 20:49:51 1
專利名稱：檢測呋喃西林代謝物的磁顆粒化學發光試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種直接化學發光檢測試劑盒及其檢測方法。特別是檢測動物組織、水產、蜂蜜等樣本呋喃西林代謝物藥物殘留的磁顆粒競爭直接化學發光檢測試劑盒。
背景技術：
硝基呋喃類藥物因為有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛應用，並作為禽類、水產和豬的促生長添加劑。但在長時間的實驗研究過程中發現，因此此類藥物和代謝物均可以使實驗動物發生癌變和基因突變，因此此類藥物禁止在治療和飼料中使用。呋喃西林在1995年被禁用。目前用來檢測呋喃西林代謝物的常用方法是液相色譜-質譜法(LC-MS)和酶聯免 疫吸附法(ELISA)等方法。I、液相色譜-質譜法(LC-MS)，樣品不需要衍生化處理，可對尿液、血液、肝臟、毛髮和眼球樣品進行檢測。LC-MS/MS聯用，可進一步提高信噪比，所以可用於對陽性結果的確認手段。但是，無論LC-MS還是LC-MS/MS，並未能解決儀器造價昂貴，操作步驟繁瑣，樣本前處理複雜，對操作人員專業素養要求高等問題。2、酶聯免疫法(ELISA)是20世紀70年代出現，用於微量物質的檢測，最早應用於傳染病、腫瘤標誌物、激素水平等臨床檢測，90年代開始在我國食品安全檢測領域推廣應用，目前依託ELISA技術的試劑盒、試紙條已經成為食品安全快速檢測領域的主導產品，同時也是我公司研發和銷售的主要產品類型。酶聯免疫檢測法基於抗原-抗體的特異性反應，檢測靈敏度較高、特異性較好，技術操作簡易，容易掌握，確實解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質如抗生素、激素、農藥殘留等的定性、定量分析工作，對食品安全快速檢測技術的發展起到了積極的促進作用。但是，ELISA方法存在許多自身無法克服的缺陷，主要表現在I)非均相反應檢測過程中為分離游離物與結合物，需要多步洗板過程，耗時費力，難以提高操作的自動化程度。2)酶催化反應藉助酶催化底物顯色，測定反應液吸光度值。反應的時間與溫度對酶活力存在較大影響，試劑穩定性差。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於提供一種檢測呋喃西林代謝物的化學發光試劑盒，採用該試劑盒進行呋喃西林代謝物的檢測時不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應速度。本發明的另一個目的在於提供一種呋喃西林代謝物的測試方法，該方法操作簡單，靈敏度高，特異性好。實現上述目的，本發明提供一種呋喃西林代謝物檢測試劑盒，其包含的主要試劑有發光標記物、突光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。
所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團的微珠，用於包被羊抗FITC單克隆抗體，其內芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。所述的發光標記物是異魯米諾衍生物標記的呋喃西林代謝物半抗原。所述的異魯米諾衍生物是ABEI、AHEI或ABEN。所述的試劑盒還包括標準品,質控品和濃縮洗液。所述的螢光素標記物是FITC標記呋喃西林代謝物單克隆抗體。本發明還提供一種利用試劑盒檢測呋喃西林代謝物的方法，包括下列步驟I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然後加入20 μ 1-100 μ I發光標記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻後,37°C溫育15min ；
2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻後在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清後用清洗液300-500 μ I衝洗複合物沉澱；4)上述清洗步驟重複2-4次；5)所得分離好的複合物直接放入測量暗箱，加入激發底物I和激發底物2，延遲3-5s後檢測發出的相對光強度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關係，可以通過RLU集合標準曲線法計算呋喃西林代謝物的濃度。所述的發光底物的主要成分是NaOH和Η202。本發明中分析測試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動注射泵I和2、測量室、發光室、光電倍增管計數器和輸出系統，同時還配置有計算機與中文界面的Windows控制軟體，可進行資料錄入、結果匯總、質量控制、結果儲存和結果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報告結果，自動生成並儲存、更新功能，兩點自動修正標準曲線，所採用的系統是CI-2008系統。本發明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團的含量是O. 1-0. 3eqm/g，其保存於含有 1_3%牛血清白蛋白，O. 1-0. 3% Tween-20,0. 02%NaN3,pH7. 2的PBS緩衝液中。所述的FITC是異硫氰酸螢光素。所述百分含量為質量百分含量。所述的發光標記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標記的呋喃西林代謝物半抗原，其保存於含pH7. 2,0. 1-0. 3% Tween-20,0. 02% NaN3的PBS緩衝液中。所述百分含量是質量百分含量。所述的螢光素標記物是FITC標記的呋喃西林代謝物單克隆抗體，其保存於PH7. 2，含5-8%牛血清白蛋白，O. 02-0. 04% NaN3的PBS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。呋喃西林代謝物標準品溶液(0ng/ml,0.01ng/ml,0. 03ng/ml,0. lng/ml,0. 3ng/ml, I. Ong/ml)，標準品稀釋液為ρΗ7· 4,0. 03% NaN3,0. 05mol/L tris緩衝液。所述百分含
量為質量百分含量。呋喃西林代謝物質控品溶液濃度分別為O. 02ng/ml，O. 5ng/ml，質控品稀釋液PH7. 4,0. 03% NaN3,0. 05mol/L tris緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。所述的濃縮洗液為pH7. 2-7. 8,0. 2-0. 4 % Tween-20,0. 02-0. 04 % NaN3,O. l-o. 2mol/L PBS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。
本發明的有益效果如下I)本發明試劑盒可特異性檢測呋喃西林代謝物藥物。2)本發明試劑盒的靈敏度較高，對呋喃西林代謝物的檢測靈敏度可達O. Olng/ml ο3)本發明試劑盒的檢測快捷，檢測時間低於20min。
具體實施例方式實施例一試劑盒具體組分的製備I)呋喃西林代謝物半抗原的合成
將呋喃西林代謝物與間硝基苯甲醛反應得到呋喃西林代謝物衍生物，再通過化學反應，合成具有-COOH的呋喃西林代謝物半抗原。2)呋喃西林代謝物人工抗原的製備將呋喃西林代謝物半抗原與牛血清白蛋白(BSA)採用混合酸酐法進行偶聯得到免疫原。3)單克隆抗體的製備動物免疫以免疫原對Balb/c小鼠進行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產生抗血清。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細胞株。細胞凍存和復甦將雜交瘤細胞用凍存液製成IX IO9個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。單克隆抗體的製備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天後腹腔注射雜交瘤細胞5X IO7個/只，7天後採集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，得到單克隆抗體。4)發光標記物的製備取4. 5mmol/L ABEI,溶於4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-輕基琥拍醯亞胺溶於O. 5mlN，N-二甲基甲醯胺中，二者充分混勻後室溫反應3-4h。取上述製備的呋喃西林代謝物半抗原15mg，用pH7. 4 PBS調節體積到I. 5ml，然後加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻後室溫反應過夜，過G-25凝膠柱純化。5)螢光標記物製備用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸鹽緩衝液將呋喃西林代謝物單克隆抗體稀釋成1.0%質量百分比濃度；根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加O. Olmg FITC，用分析天平準確稱取所需的FITC粉末。用同一緩衝液將FITC配成O. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、標記30-48h ;將標記溶液3000r/min,室溫離心20min,除去其中少量的沉澱物,裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS緩衝液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標記物,通過S印hadexG-25或G-50柱，分離游離螢光素，收集標記的螢光標記物進行鑑定，分裝，貯存於4°C冰箱中。
6)分離試劑製備a)磁珠活化表面-COOH基團的磁珠(購於DYNAL，粒徑為2. 8 μ m)，其含量是O. 15eq/g;取100 μ I 磁珠,用 100 μ I 25mmol/L, pH5. 0,0. 05% Tween-20 MES 溶液洗漆兩次,磁分離後移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ I新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ；離心管置於磁分離架上磁分離4min,移除上清,加入100 μ I, 25mmol/L,pH5. O,MES清洗2_3次後即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯羊抗FITC單克隆抗體將50-100μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60μ l，25mmol/L，pH5. O MES中，用所述 MES溶液調節總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與抗體；室溫條件下至少偶聯30min或4V偶聯2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態；離心管置於磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應15min或100μ 1，ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, O. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3-5次；最後將磁珠復溶於含O. 1-0. 5% BSA, O. 01-0. I %Tween-20,0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩衝液中，2_8°C保藏。實施例二試劑盒的組建組建檢測呋喃西林代謝物的磁顆粒直接競爭化學發光檢測試劑盒，使其含有下列組分FITC標記的呋喃西林代謝物單克隆抗體的螢光標記物ABEI標記的呋喃西林代謝物半抗原的發光標記物表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑呋喃西林代謝物標準品溶液(Ong/ml,O.01ng/ml,0. 03ng/ml,0. lng/ml,0. 3ng/ml, I. Ong/ml)，標準品稀釋液為ρΗ7· 4,0. 03% NaN3,0. 05mol/L tris緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。呋喃西林代謝物質控品溶液濃度分別為O. 02ng/ml，O. 5ng/ml，質控品稀釋液PH7. 4,0. 03% NaN3,0. 05mol/L tris緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。濃縮洗液為pH7. 2-7. 8,0. 2-0. 4 % Tween-20,0. 02-0. 04 % NaN3,0. I-O. 2mol/LPBS緩衝液。所述百分含量為質量百分含量。 實施例三實際樣品中呋喃西林代謝物的檢測I、樣本前處理(一 )肌肉、肝臟等組織前處理方法用均質器均質樣本取I. 0±0. 05g的均質物。加入5ml甲醇-水溶液，用振蕩器振蕩5min，3000g以上，室溫(20_25°C )離心lOmin，去除全部上清液；(本步驟可降低樣本基質幹擾)，加入4ml去離子水，用渦旋儀渦動溶解，加入O. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ I衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；在37°C過夜孵育(大約16h);分別加入5ml O. IM磷酸氫二鉀溶液、O. 4ml IM氫氧化鈉溶液和IOml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫(20-250C )離心IOmin ;取5ml乙酸乙酯相至IOml乾燥玻璃試管中，於50 60°C水浴氮氣流下吹乾；用Iml的正己烷(或正庚烷)用渦旋儀渦動30s，再加入O. 5ml復溶工作液，用渦旋儀渦動Imin充分混勻；(魚類樣本加入復溶液後，渦動時間可以縮短至20S，防止乳化現象出現)3000g以上，室溫(20-25°C )離心IOmin ;除去上層有機相，取下層水相50 μ I用於分析，樣本稀釋倍數1。(二)水產(魚蝦等)組織前處理方法用均質器均質樣本；取I. 0±0. 05g的均質物；加入5ml甲醇-水溶液(見配液5)，用振蕩器振蕩5min，3000g以上，室溫(20_25°C )離心lOmin，去除全部上清液；(本步驟可降低樣本基質幹擾)，加入4ml去離子水，用渦旋儀渦動溶解，加入O. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ I衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；在37°C過夜孵育(大約16h);分別加入5ml O. IM磷酸氫二鉀溶液、O. 4ml IM氫氧化鈉溶液和IOml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫(20-25°C)離心IOmin ;取51111乙酸乙酯相至IOml乾燥玻璃試管中，於50 60°C水浴氮氣流下吹乾；用Iml的正己烷(或正庚烷)用渦旋儀渦動30s，再加入O. 5ml復溶工 作液，用渦旋儀渦動Imin充分混勻；3000g以上，室溫(20_25°C )離心IOmin ;除去上層有機相，取下層水相50μ I用於分析，樣本稀釋倍數1。(三)蜂蜜前處理方法稱取I. 0±0. 05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；加入4ml去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；加入O. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ I衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；在37°C過夜孵育(大約16h);分別加入5ml O. IM磷酸氫二鉀溶液、O. 4ml IM氫氧化鈉溶液(見配液4)和5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫(20_25°C )離心IOmin ;取2. 5ml上層(乙酸乙酯相)至IOml乾燥玻璃試管中，於50 60°C水浴氮氣流下吹乾；加入Iml正己烷(或正庚烷)，用渦旋儀渦動30s，再加入O. 5ml復溶工作液，用渦旋儀渦動Imin充分混勻；3000g以上，室溫(20_25°C )離心IOmin ;除去上層有機相，取下層水相50μ I用於分析，樣本稀釋倍數1。2、用試劑盒檢測與結果分析分別吸取20 μ 1-100 μ I標準品或樣本，然後加入20 μ 1-100 μ I發光標記物，再加20 μ 1-100 μ I螢光素標記物，充分混勻後，37°C溫育15min ;加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ I，混勻後在37°C溫育5min ;用磁分離架分離5min，棄上清後用清洗液300-500 μ I衝洗複合物沉澱；所得分離好的複合物直接放入測量暗箱，加入激發底物I和激發底物2，延遲3-5s後檢測發出的相對光強度(RLU)，樣本中呋喃西林代謝物的含量與RLU成一定比例關係，可以通過RLU結合標準曲線法計算呋喃西林代謝物的濃度。激發底物I是NaOH，激發底物2是H2O2。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10_20遍，排空管道內殘存的水跡後，再將相應的底物直接放入儀器內，將泵管插入底物瓶中；用底物衝洗管道5次，並測定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對管道和底物泵進行更多次清洗，直至空白值降至合理範圍內。若超過三天不做實驗，需卸載底物瓶，並蓋上蓋子，以防蒸發。隨後用蒸餾水清洗管道，並排空，以免強鹼溶液腐蝕底物泵。本發明採用6個呋喃西林代謝物標準品(Ong/ml,O. 01ng/ml,0. 03ng/ml,0. lng/ml,O. 3ng/ml, I. Ong/ml)進行曲線測繪。儀器根據所述方法檢測得到一條RLU值與呋喃西林代謝物濃度相關的定標曲線，此後測量中，每一個樣本中的呋喃西林代謝物濃度與標準曲線相比較得出樣本中的呋喃西林代謝物含量。
實施例四試劑盒質量的測定I、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測定20次零標準品，測定的平均值加上3倍標準差。該試劑盒的靈敏度為O. 01ng/ml。2、樣本的準確度和精密度準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒準確度常用回收率表示。精密度又稱可重複性，常用變異係數表示。按照實施例三的樣本提取方法，以O. 02ng/g(ml)、0· 04ng/g(ml)兩個濃度的呋喃西林代謝物分別對雞肉、水產、蜂蜜樣本進行添加回收，每種樣本每個濃度各4個平行，用三批試劑盒進行測定，計算樣本的平均回收率及精密度。實驗結果見下表。
表I準確度和精密度測定ng/g (ml)
權利要求
1.一種檢測呋喃西林代謝物的磁顆粒化學發光試劑盒，包括的試劑有發光標記物、 突光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特徵在於所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述的順磁性納米微珠是裡面包覆有 Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團的微珠。
4.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特徵在於所述的發光標記物是異魯米諾衍生物標記的呋喃西林代謝物半抗原。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述的異魯米諾發光標記物是ABEI、 AHEI 或 AffiN。
6.根據權利要求1-3任一項所述的試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒還包括標準液、 質控品和濃縮洗液。
7.根據權利要求1-3之一所述的試劑盒，其特徵在於所述的螢光素標記物是FITC標記的呋喃西林代謝物單克隆抗體。
8.一種利用權利要求1-7任一項所述的試劑盒檢測呋喃西林代謝物的方法，包括下列步驟1)分別吸取20μ 1-100 μ I標準品或樣本，然後加入20 μ 1-100 μ I發光標記物，再加 20 μ 1-100 μ I突光素標記物,充分混勻後,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ 1，混勻後在37°C溫育 5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清後用清洗液300-500μ I衝洗複合物沉澱；4)上述清洗步驟重複2-4次；5)4)所得分離好的複合物直接放入測量暗箱，加入激發底物I和激發底物2，延遲3-5s 後檢測發出的相對光強度(RLU)，樣本中呋喃西林代謝物的含量與RLU成一定比例關係，可以通過RLU集合標準曲線法計算呋喃西林代謝物的濃度。
全文摘要
本發明涉及檢測呋喃西林代謝物的磁顆粒化學發光試劑盒，包括的試劑有發光標記物、螢光素標記物、標準品、質控品、分離試劑。發光標記物是異魯米諾發光標記物標記的呋喃西林代謝物半抗原，螢光標記物是指螢光素或其衍生物標記的呋喃西林代謝物單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發明還涉及一種採用所述的試劑盒檢測動物源性食品中呋喃西林代謝物的方法，本方法對呋喃西林代謝物檢測具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測速度。
文檔編號G01N33/577GK102928408SQ20111022690
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優先權日2011年8月9日
發明者萬宇平, 何方洋, 周德剛, 韓銳, 馬孝斌, 崔海峰 申請人:北京勤邦生物技術有限公司