B型肝炎病毒e抗體檢測試劑盒及檢測方法

2023-12-09 04:38:36 3

專利名稱：B型肝炎病毒e抗體檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及B肝的診斷試劑盒，具體涉及基於光激化學發光原理的B型肝炎病毒e抗體檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術：
B肝病毒(HBV)具有地方性，是引發肝臟疾病的主要原因。HBV可通過血液和體液直接傳播。常見的傳播方式包括輸血、注射、開放傷口的直接接觸、性交和嬰兒出生時的母嬰傳播。HBV感染後的潛伏期平均為6到8周(1～6個月)。常見的臨床症狀包括不適、發熱、腸胃炎、黃膽、可導致典型的黃膽肝炎、無症狀肝炎、爆發型肝炎及慢性肝炎。成年人中，有90％至95％的急性HBV感染患者得到康復，清除病毒。大約5～10％的患者轉變成慢性攜帶者。在HBV感染的嬰兒中，大約90％發展成慢性肝炎。估計全世界有超過3億的病毒攜帶者。HBV感染，尤其是慢性感染，易發展成為肝癌。
B肝e抗體在e抗原消失後出現，通常在B肝症狀緩解後持續1年。e抗體的產生通常提示傳染危險性的下降——傳染周圍人群的能力下降。但是，請注意，e抗體陽性患者仍然攜帶HBV，依然具有傳染性。
免疫學檢測是基於抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，由於其可以利用同位素、酶、化學發光物質等對被檢測信號進行放大和顯示，因此常被用於檢測蛋白質，激素等微量生物活性物質。
我國免疫學檢測基本經歷了放射免疫檢測(興起於20世紀70年代，現仍普遍使用於縣級以上醫院)；酶聯免疫檢測(興起於20世紀80年代，各臨床機構普遍使用)；以化學發光為代表的光生物學標記及免疫檢測技術(20世紀90年代開始推廣使用，產品步入成長期)三個階段。這一衍變過程主要是基於對檢測方法的敏感性、準確性、以及操作簡捷性的需求的不斷提高而決定的。
化學發光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay)是近十年來在世界範圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析技術。檢測原理是以發光物質作為信號放大系統並籍助其發光強度直接測定免疫結合。由於其高靈敏度，檢測範圍寬等優點，已成為放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學檢測重要的發展方向。
但目前國內自行研製的化學發光檢測試劑，大多為非均相反應，採用化學底物直接標記，通過化學反應激發。其分析過程與傳統酶標檢測類似，需反覆清洗與分離，檢測耗時長，自動化程度不高。國外廠家檢測試劑隨發光基質與檢測形式而各不相同。以Abbott，Bayer與Chiron等公司為代表的化學激發，即以化學發光底物直接標記抗原或抗體進行免疫測定。最常用的為吖啶酯，在鹼性環境中可被過氧化氫氧化而發光。BD則以AKP，金鋼脘為基質採用酶促化學發光。Roche為則採用電化學發光(electrochemiluminescence，ECL，發光底物二價的三聯吡啶釕及反應參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個H+而成為強還原劑，將氧化型的三價釕還原為激發態的二價釕，隨即釋放光子而恢復為基態的發光底物。這一過程在電極表面周而復始地進行，不斷地發出光子而常保持底物濃度的恆定。因反應過程中牽涉到分離清洗，自動化設計複雜，儀器相當昂貴。此外，發光基質的穩定性也是一大問題。
光激化學發光法通過引入雷射技術與納米微球技術，成功的解決了上述不足。因反應在均相進行，既加快了反應速度，又避免了反覆分離與清洗步驟，能有效降低檢測背景值，減少反應時間，並可實現自動化操作。目前，PE公司推出了針對生物研究用的光激化學發光試劑Alpha-screen。但在臨床檢測領域，還沒有面世的光激化學發光檢測試劑，尤其是用於腫瘤標誌物與肝炎檢測項目。


發明內容
本發明的目的是提供一種可用於定性或定量檢測B型肝炎e抗體(抗-HBe)的檢測試劑盒及相應的檢測方法。
本發明的技術原理 本發明的B型肝炎e抗體(抗-HBe)檢測試劑及試劑盒與光激化學發光檢測技術相關，光激化學發光免疫技術是一種利用化學發光物質發射的光波進行免疫測定的方法。該技術主要整合了高分子微粒技術，有機合成，蛋白質化學與臨床檢測相關領域的研究。
本發明在均相條件下，將B型肝炎e抗原、內部帶有染料的感光微球(納米級)以及包被有B型肝炎e抗體並且內部帶有發光化合物的發光微球(納米級)的混合物作為試劑和檢測樣品混合。此時納米感光微球和包被有B型肝炎e抗體的納米發光微球可迅速有效地捕捉靶分子，在近距離內，三者形成免疫夾心複合物。激發光照射後，納米感光微球中的染料被誘導激活，並釋放高能態的活性氧離子(單線態氧)。該高能態的活性氧離子被近距離的納米發光微球俘獲，從而傳遞能量以激活所述發光微球中的發光化合物。數微秒後，發光微球中的發光化合物將釋放出高能級紅光。用光子計數器測定這些高能級光子，並通過電腦將光子數換算為目標分子濃度，光子數的多少即精確地反映了目標分子的濃度。而當樣本不含靶分子時，無法在近距離形成免疫夾心複合物，活性氧離子也無法傳遞至發光微球表面。活性氧離子在液相中迅速衰減，檢測時則無光能級紅光產生。具體原理參見圖1及圖2。
基於上述原理，本發明第一方面提供了一種用於檢測B型肝炎e抗體(抗-HBe)的檢測試劑盒，包括抗-HBe抗體包被的發光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體以及中和e抗原，其中，中和e抗原為HBeAg。
較佳的，上述抗-HBe抗體包被的發光微粒為鼠單克隆抗-HBe包被的發光微粒。
較佳的，上述試劑盒中還包括親和素包被的感光微粒。
上述作為中和e抗原的HBeAg可以為重組HBeAg。
在試劑盒中，上述抗-HBe抗體包被的發光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體、親和素包被的感光微粒或中和e抗原分別以溶液的形式置於各自獨立的容器中。上述含有抗-HBe抗體包被的發光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體、親和素包被的感光微粒或中和e抗原的溶液的溶劑可以是常規的適合抗原抗體反應的溶劑體系，如HEPES緩衝體系、Tris緩衝體系。抗-HBe抗體包被的發光微粒的溶劑優選pH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES緩衝液，生物素標記的抗-HBe抗體的溶劑優選pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris緩衝液，親和素包被的感光微粒的溶劑優選HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES緩衝液，中和e抗原的溶劑優選pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris緩衝液。上述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護作用的物質如BSA以及防止微粒聚集的穩定試劑如Tween20，出於對試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優選100U/ml慶大黴素和質量百分比為萬分之五的Proclin 300作為防腐劑。
在用於定量檢測B型肝炎e抗體時，上述試劑盒中還包括抗-HBe定標品。
抗-HBe定標品即為含有已知確定濃度B型肝炎e抗體的溶液。不同濃度的抗-HBe定標品分別獨立包裝。較佳的，上述抗-HBe定標品中的B型肝炎e抗體為單克隆抗體。
較佳的，在用於定量檢測B型肝炎e抗體時，試劑盒中還包括質控品。
質控品包括高水平質控品和低水平質控品。高水平質控品和低水平質控品均為含有已知確定濃度B型肝炎e抗體的溶液，高水平質控品中抗-HBe濃度較高達到陽性水平，低水平質控品中抗-HBe濃度較低為陰性水平。
在用於定性檢測B型肝炎e抗體時，前述試劑盒中還可包括陽性對照、陰性對照，以及參考樣品。上述參考樣品為含有確定濃度B型肝炎e抗體的溶液，該確定濃度B型肝炎e抗體的溶液中，B型肝炎e抗體的濃度為B型肝炎e抗體臨床cutoff點對應的濃度。上述陽性對照、陰性對照，以及參考樣品分別獨立包裝。
前述發光微粒是指填充有發光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發光化合物可以是Dioxene(二氧雜環己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen等，該微粒可由市場上購得。
研究發現，由於最終的檢測反應是均相反應，發光微粒的粒徑(微粒的平均直徑)太大(＞400nm)會自然沉降，影響檢測效果，微粒的粒徑太小(＜50nm)，會使製備過程中的清洗工作比較困難，對抗體連接工作不利，因此發光微粒的粒徑範圍應在50-400nm之間，較好為100-300nm之間，優選250nm。
發光微粒的表面官能團可以是任何能聯接蛋白質的基團，如羧基，醛基，胺基，環氧乙基或滷代烷基等各種已知的可連接蛋白質的官能團，最優化的微粒表面官能團為羧基表面官能團的微粒或醛基表面官能團的微粒。使用不同的微粒表面官能團，連接抗體的反應方式和條件也不相同。
A)羧基微粒和抗體連接方法羧基表面官能團的微粒親水性好，顆粒均勻穩定。根據表面羧基含量的不同，一般可分為低，中和高羧基微粒。低羧基微粒一般採用物理吸附法連接抗體。但物理吸附的抗體會逐漸由微粒表面釋放，造成溶液中的游離抗體濃度增加，從而降低了檢測靈敏度。並且試劑保存的穩定性也不夠。高羧基微粒一般採用化學方法連接抗體。化學法連接的微粒與抗體結合比較牢固，在檢測靈敏度及試劑的穩定性方面要優於物理吸附。化學法連接微粒與抗體一般採用EDAC和NHS活化微粒，然後活化得微粒與抗體羧合的反應。可以一步反應(活化和羧合同時進行)也可兩步反應(活化和羧合分步進行)。一步反應較兩步反應簡單，但反應的重現性不好，抗體容易失活。兩步法連接抗體雖然避免了抗體失活，但仍沒有完全解決抗體連接的重現性問題。
B)醛基微粒和抗體連接方法醛基表面的微粒也有很好親水性，顆粒均勻穩定，微粒表面容易修飾，並且與蛋白的反應比較容易。一般採用NaBH3CN進行還原胺化反應，反應生成的碳氮鍵很穩定，抗體連接的效率也很高，重複性也很好。
鑑於獲得更好的抗-HBe抗體連接效率，試劑穩定性和連接重複性，經試驗優選醛基表面官能團的微粒，並應用了NaBH3CN的還原胺化反應作為抗體的連接方法。
發光微粒的發光量會直接影響最終檢測的發光效果。市場提供的發光微粒發光量一般會在50,000-10,000,000光子數/100ug發光微粒範圍內，優選150,000-350,000光子數/100ug發光微粒，最佳為25,000-35,000光子數/100ug。
上述抗-HBe抗體包被的發光微粒中，發光微粒與抗-HBe抗體的質量比例較佳為10∶(0.2-10)，優選10∶(1-4)，最佳為5∶1。
上述生物素標記的抗-HBe抗體中，生物素與抗體的分子比例較佳為(5-50)∶1，優選30∶1。
上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670~690nm光激發下，可以產生單線態氧離子，當其與發光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發光微粒，與發光微粒中的發光化合物反應，產生紫外光，紫外光再進一步激發鑭系元素化合物，產生520~620nm波長光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場上購得。
上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質量比例無特殊限制，較佳為1∶(3-10)，優選1∶5。
市售感光微粒均適用於本發明，微粒粒徑較佳為180-260nm，優選220nm。
本發明的試劑盒中的各種試劑，可採用下列方法製備 1.抗-HBe抗體包被的發光微粒採用NaBH3CN的還原胺化反應法製備，反應步驟如下 1)混合將發光微粒與抗-HBe抗體按質量比例為10∶(1-4)混合於緩衝液中； 2)反應加入緩衝液配製的NaBH3CN溶液混合併反應； 3)封閉加入緩衝液配製的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應後，再加入BSA溶液封閉； 4)清洗產物，獲得抗-HBe抗體包被的發光微粒。
其中，混合步驟中，發光微粒與抗HBe抗體的質量比例為10∶(1-4)優選5∶1。反應緩衝液可為MES緩衝液、磷酸緩衝液，優選MES緩衝液，濃度優選0.05M，反應步驟中，反應溶液中發光微粒的濃度可為10-40mg/ml，優選25mg/ml。清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。
透析法清洗步驟採用反應緩衝液透析，每次4-5小時，更換緩衝液4次。透析清洗操作時間較長，且微粒損失較多，造成收率降低。
離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應緩衝液洗滌，超聲處理打開沉澱，如此反覆3-5次。離心法清洗時離心力會使發光微粒暫時聚集在一起，但經過超聲處理可以很容易再次分散打開，此法操作時間短，且收率較高。因此優選採用此種清洗方式。
2.生物素標記抗體可採用常規的方法進行。
3.親和素包被的感光微粒可採用NaBH3CN的還原胺化反應法製備。
本發明第二方面，公開了一種利用光激化學發光原理，採用雙抗體夾心法，定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，包括將待測樣品與抗-HBe抗體包被的發光微粒、中和e抗體、生物素標記的抗-HBe抗體以及親和素包被的感光微粒混合反應，而後用激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值。
其中，光激化學發光法檢測的激發光光源波長範圍為600-700nm，優選640-680nm；反應孔發光的發射光光源波長範圍為600-680nm，優選610-620nm；發射光延遲時間範圍為100ms-1000ms；激發光光源的功率範圍為5-100mw，優選40-60w。
定量檢測B型肝炎e抗體的方法，包括下列步驟 1)在反應孔中，將待測樣品和中和e抗原混合反應獲得反應溶液1； 2)在反應溶液1中加入抗-HBe抗體包被的發光微粒和生物素標記的抗-HBe抗體混合反應，獲得反應溶液2； 3)在反應溶液2中再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液； 4)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值； 5)根據標準曲線計算待測樣品抗-HBe抗體含量。
定性檢測B型肝炎e抗體的方法，包括下列步驟 1)在反應孔中，將待測樣品或參考樣品與中和e抗原混合反應獲得反應溶液1； 2)在反應溶液1中加入抗-HBe抗體包被的發光微粒和生物素標記的抗-HBe抗體混合反應，獲得反應溶液2； 3)在反應溶液2中再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液； 4)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值； 5)計算待測樣品光信號值與抗-HBe抗體參考樣品光信號的比值，即S/CO值，當S/CO≤1時待測樣品被判定為陽性，當S/CO＞1時待測樣品被判定為陰性。
上述參考樣品中，抗-HBe抗體的濃度與B型肝炎e抗體臨床cutoff點對應。
在定性或定量檢測B型肝炎e抗原的方法中 步驟2)的反應條件為37℃溫育10-120分鐘，較佳為10-30分鐘，優選20分鐘，步驟3)的反應條件也為37℃溫育10-30分鐘，優選15分鐘。
反應溶液1中，中和e抗原的濃度可以為0.5-2ug/ml，最佳為1ug/ml。
反應溶液2中，抗-HBe抗體包被的發光微粒的濃度無特殊限制，可以為40-300ug/ml，優選40ug/ml-160ug/ml，最佳60ug/ml。
反應溶液2中，生物素標記的抗-HBe抗體的濃度無特殊限制，可以為0.5-10ug/ml，較佳為0.5ug/ml-1.5ug/ml，優選1ug/ml。
在最終反應溶液中，親和素包被的感光微粒的濃度一般控制在30-100ug/ml，優選60ug/ml。
上述方法中，反應溶液2的體積無特殊限制，可以為50-125ul，優選125ul；最終反應溶液的體積也無特殊限制，可以為120-300ul，優選300ul。
上述待測樣品包括血清、血漿和全血。
本發明是採用光激化學發光檢測技術，測定人血清樣品中B型肝炎e抗體(抗-HBe)的定量及定性體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯合用於診斷個體發生急性或慢性B型肝炎感染的情況，也可用於對圍產期女性B型肝炎的篩選，以判斷新生兒感染B型肝炎的危險性。本發明的試劑盒採用光激化學發光法測定標本中的抗HBe抗體，具有靈敏度高、檢測範圍寬等特點，在方法學上較酶免法能達到更高的靈敏度和更優的檢測範圍。



圖1光激化學發光免疫技術原理圖微粒結合形成二聚體，產生光子信號 圖2光激化學發光免疫技術原理圖未結合微粒，無光子信號產生 圖3單線態氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒有單線氧的存在，因此也不發光 附圖標記 FG BEAD發光微粒，內含發光分子； GG BEAD感光微粒，內含感光分子； Singlet Oxygen單線態氧，活性氧離子； A/B兩者可直接或間接特異結合的活性分子。如在雙抗夾心檢測中，A，B為針對靶分子C不同的表位的單克隆抗體
具體實施例方式 下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而非限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件或者製造商建議的條件進行或配置。
實驗中儀器原料來源及試劑配方


本發明中所提及的PEIU/ml單位，是指向Paul-Ehrlich-Institute(PEI)出品的B型肝炎抗-HBe定量標準品Anti-HBe IgGVirological standards(10/2001)溯源所產生的標準單位。
實施例1抗-HBe抗體包被的發光微粒的製備 製備方法 1)發光微粒混懸液處理吸取一定量的發光微粒(粒徑250±20nm)於高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩衝液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩衝液調節發光微粒濃度至100mg/ml。
2)抗體處理抗-HBe於0.05M pH6.0的MES緩衝液(以下簡稱MES緩衝液)透析，透析完成後測定濃度，並調節濃度至8mg/ml。
3)MES緩衝液、100mg/ml的發光微粒混懸液(MES緩衝液)和8mg/ml的抗-HBe(MES緩衝液)以及，以1∶2∶5的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。
4)用MES緩衝液配製25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液1∶25的體積比加入，迅速混勻，37℃旋轉反應48小時。
5)MES緩衝液配製75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液2∶1∶10的體積比加入上述溶液中，混勻，37℃旋轉反應2小時。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩衝液)，其與反應液體積比為5∶8，迅速混勻，37℃旋轉反應16小時。
6)用MES緩衝液離心清洗三次，最後用發光試劑緩衝液進行懸浮，測定粒徑和固含量，調節濃度至10mg/ml。
參照上述製備方法製備抗-HBe抗體包被的發光微粒，並通過各項性能測試比較從以下幾方面進行了具體工藝條件的選擇研究 研究中涉及的各個參數的檢測方法如下 1.光信號檢測方法 在反應孔中分別加入25μl樣品，再依次加入50μl中和e抗原試劑(1ug/ml)、25μl發光試劑(60ug/ml)和25μl生物素化抗體試劑(按實施例4的方法製備，1ug/ml)。然後放入儀器(光激化學發光分析系統)，由儀器自動按以下步驟操作振動，37℃溫育15分鐘，再自動加入175μl親和素包被的感光微粒試劑(按實施例4的方法製備，60ug/ml)後37℃溫育15分鐘。儀器自動產生雷射照射微孔計算每孔發光光子量。
2.靈敏度檢測方法檢測靈敏度參考品(編號L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3)光信號，均需檢出所要求的企業靈敏度參考品(需檢出L1-2；L2-2；L3-2)。
L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3配方選取3份不同來源的血清標本，經檢測HCV、HIV均為陰性，抗-HBe經Abbott公司試劑盒檢測確認為陽性，分別按照比例稀釋後得到3個標本系列。
結果表明按上述比例稀釋後組成的3個標本系列為弱陽性標本，可用於試劑盒靈敏度的考核。以1#標本的11024-1256、2#標本的1512-1128、3#標本的11024-1256組成的3個標本系列作為公司內部靈敏度參考品(編號L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3)。
3.特異性檢測方法檢測20份特異性參考品光信號，不得檢出假陽性，無假陽性則記為20/20。
特異性參考品配方從收集的HBeAg陰性標本中選取20份，組成特異性參考品，編號N-01～N-20。標本選擇時既包括了健康人標本，也包括了的較易引起假陽性的特殊人群標本。其具體組成如下 4.精密性檢測方法 檢測抗-HBe濃度分別為0.5PEIU/ml和4.6PEIU/ml的質控品光信號，每個濃度做10孔重複測定，代入公式，計算CV值。低濃度的精密性測定表示為QC L，高濃度的精密性測定表示為QC H。
工藝條件選擇 a.反應pH值 其它反應條件25mg/ml的發光微粒反應濃度，10∶2的FG-bead與抗-HBe質量比，離心法清洗 pH5.00.1M MES緩衝反應體系中有明顯的微粒聚集現象，故不採用此反應條件。pH6.00.1M MES緩衝體系反應基本正常，抗體連接率及抗-HBe檢測比pH7.0的0.1M磷酸緩衝體系稍差。pH7.0的0.1M磷酸緩衝體系反應基本正常，抗體連接率及抗-HBe檢測比pH6MES緩衝體系稍好，且考慮到一般購買的抗體均保存在PB buffer中，在抗體的前處理過程中會避免因抗體緩衝液的改變帶來的抗體的損失。故選擇pH7.0的0.1M PB buffer作為反應緩衝液。


b.發光微粒在反應液中的濃度 其它反應條件0.05M pH6.0的MES buffer作為反應緩衝液，10∶2的FG-bead與抗-HBe的質量比，離心法清洗 1
10mg/ml反應濃度時，抗體連接率及靈敏度均不佳。反應濃度升高有利於抗體的連接，當發光微粒濃度為20mg/ml時，抗體連接率基本達到平臺，濃度再高，達到40mg/ml時，由於溶液濃度較大在37℃反應時間較長的情況下黏附損失較嚴重，故選擇20mg/ml的發光微粒反應濃度為宜。
c.發光微粒與抗體的反應比例 其它反應條件0.05M pH6.0的MES buffer作為反應緩衝液，25mg/ml的發光微粒反應濃度，離心法清洗。

抗體加入量與發光微粒上包被的抗體量基本呈正比關係，但抗體繼續增加時包被上的抗體達到飽和。綜合考慮QC結果及成本問題，選擇10mg FG-bead與2mg抗-HBe反應條件。
d.清洗方式 其它反應條件0.05M pH6.0的MES buffer作為反應緩衝液，25mg/ml的發光微粒反應濃度，5∶1的FG-bead與抗-HBe比例。
透析法清洗步驟100倍體積透析，每次4-5小時，更換緩衝液4次。透析清洗操作時間較長，透析過程中微粒損失較多。
離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗4次。離心法清洗的離心力會使發光微粒暫時聚集，但經過超聲處理很容易可再次分散打開。且操作時間短，收率較高。考慮到生產周期以及生產成本，決定採用此種清洗方式。
最終選擇250nm的粒徑，發光量為≥250,000光子數/100ug的發光微粒，0.05M pH6.0的MES buffer作為反應緩衝液，25mg/ml的發光微粒反應濃度，5∶1的FG-bead與抗-HBe比例，離心法清洗作為最優製備條件。
實施例2生物素標記抗體的製備 製備方法 1)抗體處理將抗-HBe透析於0.1M NaHCO3溶液，測定抗體濃度並調節至1mg/ml。
2)用DMSO配製16.17mg/ml的Biotin溶液。
3)標記取處理好的1mg/ml抗-HBe標記抗體與配製好的Biotin溶液，二者按照10000∶54的體積比進行混合，迅速混勻。2～8℃靜置反應12～16小時。
4)透析將反應好的生物素標記抗體透析於生物素標記透析緩衝液(pH8.00)。
5)將透析好的生物素化抗體吸出轉移至乾淨離心管中，取樣測定抗體濃度。將質檢合格的生物素標記抗體濃度調節至0.5mg/ml。
按上述製備方法，改變抗體與Biotin的分子比例進行反應並進行檢測 光信號檢測方法 在反應孔中分別加入25μl樣品，再依次加入50μl中和e抗原試劑(1ug/ml濃度)，25μl發光試劑(按實施例1的方法製備，60ug/ml濃度)和25μl生物素化抗體試劑(1ug/ml濃度)。然後放入儀器(光激化學發光分析系統)，由儀器自動按以下步驟操作振動，37℃溫育15分鐘，再自動加入175μl親和素包被的感光微粒試劑(按實施例3的方法製備，60ug/ml濃度)後37℃溫育15分鐘。儀器自動產生雷射照射微孔計算每孔發光光子量。

從靈敏度等方面進行考慮，認為優選30∶1的比例。
實施例3親和素包被的感光微粒的製備 感光微粒採用粒徑為220±40nm的感光微粒(美國PentaTek公司) 製備方法 a、感光微粒混懸液處理吸取一定量的感光微粒於高速冷凍離心機中離心，棄去上清，加入一定量MES緩衝液，超聲細胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩衝液調節感光微粒濃度至100mg/ml。
b、親和素溶液配製稱量一定量Avidin，加MES緩衝液溶解至8mg/ml。
c、混合將處理好的感光微粒混懸液、8mg/ml的Avidin以及MES緩衝液，以2∶5∶1的體積比進行混合，迅速混勻，得到反應液。
d、反應MES緩衝液配製25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液1∶25的體積比加入，迅速混勻。37℃旋轉反應48小時。
e、封閉MES緩衝液配製75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應液2∶1∶10的體積比加入上述溶液中，混勻，37℃旋轉反應2小時。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩衝液)，其與反應液體積比為5∶8，迅速混勻，37℃旋轉反應16小時。
f、清洗向反應好的溶液中加入MES緩衝液，高速冷凍離心機離心，棄上清，加入新鮮MES緩衝液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最後用少量的感光試劑緩衝液進行懸浮，測定固含量，用感光試劑緩衝液調節濃度至10mg/ml。
實施例4臨床cutoff點確定 試劑配製 1.發光抗體緩衝液pH8.0成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H2O的HEPES緩衝液，添加BSA及100U/ml慶大黴素和質量百分比為萬分之五Proclin 300。
2.生物素標記抗體緩衝液pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris緩衝液，添加BSA及100U/ml慶大黴素和質量百分比為萬分之五Proclin 300。
3.中和抗原稀釋液pH8.0的成分為Tris、NaCl和EDTA-Na-2H2O的Tris緩衝液，添加BSA及100U/ml慶大黴素和質量百分比為萬分之五Proclin 300。
4.抗-HBe抗體包被的發光微粒試劑採用實施例1的方法，選擇250nm的粒徑，發光量為≥250,000光子數/100ug的發光微粒，0.05M pH6.0的MES buffer作為反應緩衝液，25mg/ml的發光微粒反應濃度，5∶1的FG-bead與抗-HBe比例，離心法清洗製得抗-HBe抗體包被的發光微粒。將抗體包被的發光微粒用發光抗體緩衝液調節濃度至10mg/ml。
5.生物素標記抗體試劑採用實施例2的方法，抗體與Biotin按照30∶1的比例製得生物素標記抗體。將生物素標記抗體用生物素標記抗體緩衝液調節濃度至0.5mg/ml。
6.親和素包被的感光微粒試劑由實施例3的方法製得親和素包被的感光微粒，將親和素包被的感光微粒用感光試劑緩衝液調節濃度至10mg/ml。
7.中和e抗原試劑將重組HBeAg用中和抗原稀釋液稀釋至1μg/ml。
光信號檢測方法 在反應孔中分別加入25μl樣品和50μl中和e抗原試劑，再依次加入25μl發光試劑和25μl生物素化抗體試劑混合。然後放入儀器(光激化學發光分析系統)，由儀器自動按以下步驟操作振動，37℃溫育15分鐘，再自動加入175μl親和素包被的感光微粒試劑後37℃溫育15分鐘。儀器自動產生雷射照射微孔計算每孔發光光子量。
根據對1042個正常非B型肝炎患者的血樣進行檢測的結果，99％的樣品抗-HBe水平小於0.5PEIU/ml，所以我們可以認為0.5PEIU/ml是本試劑的臨床cutoff點。
實施例5陰性、陽性對照、參考樣、定標品及質控品的製備 1.HBeAg陰性對照新生牛血清。
2.HBeAg陽性對照使用Paul-Ehrlich-Institute(Virological standards 10/2001)出品的B型肝炎抗-HBe定量參考品以新生牛血清為稀釋液配製濃度為3.50PEIU/ml的溶液作為陽性對照。
3.參考樣品 根據實施例4對臨床cutoff點的研究，使用Paul-Ehrlich-Institute(Virologicalstandards 10/2001)出品的B型肝炎抗-HBe定量參考品以新生牛血清為稀釋液配製濃度為0.6PEIU/ml的樣品作為參考樣。
4.定標品 使用Paul-Ehrlich-Institute(Virological standards 10/2001)出品的B型肝炎抗-HBe定量標準品以新生牛血清為稀釋液，按照濃度0PEIU/ml，0.5PEIU/ml，2.0PEIU/ml，4.0PEIU/ml，12PEIU/ml，20PEIU/ml配製6個定標品。
5.質控品使用Paul-Ehrlich-Institute(Virological standards 10/2001)出品的B型肝炎抗-HBe定量參考品以新生牛血清為稀釋液配製濃度為4.6PEIU/ml的溶液作為QC H，濃度為0.5PEIU/ml的溶液作為QC L。
實施例6B型肝炎e抗體定性及定量檢測 1.基本檢測模式 首先向反應孔中分別加入樣品和中和e抗原試劑，再依次加入發光試劑(抗體包被的發光微粒)和生物素標記抗體。然後放入儀器(光激化學發光分析系統)，由儀器自動按以下步驟操作振動，37℃溫育。再自動加入感光試劑(含親和素包被的感光微粒)後37℃再次溫育。溫育結束後儀器自動產生雷射照射微孔計算每孔發光光子量。
2.標準曲線的獲得 按上述方法檢測各個定標品的發光光子量，將測得的光信號值與相應的定標品濃度採用cubic spline擬和作圖即得，標準曲線呈線性。
3.定量檢測 在定量測定中，根據標準曲線，按樣本實測光信號值計算每一個樣本的抗-HBe含量，單位是PEIU/ml。
4.定性檢測 在定性測定中，檢測參考樣品的光信號值計，計算每一個樣本的S/CO(即待測樣品光信號值與抗HBe參考樣品光信號的比值)，當S/CO≤1時待測樣品被判定為陽性，當S/CO＞1時待測樣品被判定為陰性。檢測陰陽對照的光信號，如檢測結果出錯，則檢測無效，需重新檢測。
5.檢測條件的優化試驗 5.1溫育時間的確定 試驗材料採用實施例4的方法製備抗體包被的60ug/ml的發光微粒試劑(下簡稱發光抗體試劑)、1ug/ml中和e抗原試劑、1ug/ml的生物素標記抗體試劑，及60ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑 檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。
初始反應條件加樣量為樣品25ul，中和e抗原試劑50ul，發光微粒試劑25ul，生物素標記抗體試劑25ul，親和素包被的感光微粒試劑為175ul，兩步溫浴。
5.1.1第一步溫育時間的確定 第一步溫育時間分別為10min、15min、20min、30min，第二步溫育時間為20min對檢驗樣本進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表
對上述結果進行分析比較，在初始條件下，第一步溫育時間為10-30min均可，根據結果當第一溫浴時間大於15min後，結果已經趨於穩定。
5.1.2第二步溫育時間的確定 第一步溫育時間為15min，第二步溫育時間分別為10min、15min、20min、30min對檢驗樣本進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表
根據上述結果，當第二步溫浴時間為15min時結果已經趨於穩定，因此確定第二溫浴時間為15min。
5.2加樣模式的考察 試驗材料採用實施例4的方法製備抗體包被的60ug/ml的發光微粒試劑(下簡稱發光抗體試劑)、1ug/ml中和e抗原試劑、1ug/ml的生物素標記抗體試劑，及60ug/ml的親和素包被的感光微粒試劑 檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。
初始反應條件依次添加樣品、中和e抗原試劑、發光微粒試劑、生物素標記抗體試劑、親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時間為15min，第二溫浴時間為15min。
設計了三種加樣模式進行考察。
模式110ul樣品+20ul中和e抗原試劑+10ul發光抗體試劑+10ul生物素標記抗體試劑+70ul親和素包被的感光微粒試劑； 模式215ul樣品+30ul中和e抗原試劑+15ul發光抗體試劑+15ul生物素標記抗體試劑+105ul親和素包被的感光微粒試劑； 模式325ul樣品+50ul中和e抗原試劑+25ul發光抗體試劑+25ul生物素標記抗體試劑+175ul親和素包被的感光微粒試劑。
按照以上三種加樣模式對檢測樣本進行檢測，分別考察靈敏度、特異性、準確性、精密度等指標。結果見下表
對上述結果進行分析比較，在其餘條件相同的情況下，並考慮到手工加樣樣品量過小會造成不便於操作的影響以及更容易產生誤差，所以我們選擇模式3。
5.3發光抗體、生物素化抗體、親和素包被的感光微粒濃度的篩選 試驗材料採用實施例4的方法製備抗體包被的發光微粒試劑(下簡稱發光抗體試劑)、中和e抗原試劑、生物素標記抗體試劑，及親和素包被的感光微粒試劑 檢驗樣本靈敏度參考品和質控品QcL，QcH。
初始反應條件25ul樣品+50ul中和e抗原試劑+25ul發光抗體試劑+25ul生物素標記抗體試劑+175ul親和素包被的感光微粒試劑，兩步溫浴，其中第一溫浴時間為15min，第二溫浴時間為15min。
5.3.1發光抗體和生物素化抗體濃度的初篩 中和e抗原試劑採用1ug/ml的濃度，親和素包被的感光微粒採用60ug/m1的濃度，分別配製濃度為40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml的發光抗體試劑以及濃度為0.5ug/ml、1.5ug/ml、4.5ug/ml的生物素標記抗體試劑交叉配對進行檢測，在初始反應條件下結果分別如下 40ug/ml發光抗體
80ug/ml發光抗體
160ug/ml發光抗體

對上述結果進行分析比較，發光抗體的濃度在40ug/ml-80ug/ml之間，生物素化抗體的濃度在0.5ug/ml-1.5ug/ml之間結果較為理想。
5.3.2發光抗體和生物素化抗體濃度的精篩 根據初篩的結果分別配製濃度為40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml的發光抗體以及濃度為0.5ug/ml、1ug/ml、1.5ug/ml的生物素化抗體交叉配對進行檢測，中和e抗原濃度為1ug/ml(廠商建議)，結果分別如下 40ug/ml發光抗體
60ug/ml發光抗體
80ug/ml發光抗體

對上述結果進行分析比較，發光抗體的濃度在60ug/ml，生物素化抗體的濃度在1ug/ml時結果最為理想。
5.3.3中和e抗原濃度的選擇 結合本方法的特點，採用發光抗體的濃度在60ug/ml，生物素化抗體的濃度在1ug/ml，分別配製濃度為0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml中和e抗原試劑的進行檢測，結果分別如下
對上述結果進行分析比較，中和抗原的濃度在1ug/ml時結果最為理想。
實施例7評價試驗 試劑採用實施例4的方法製備發光抗體試劑(濃度60ug/ml)、中和e抗原試劑(濃度為1ug/ml)、生物素標記抗體試劑(濃度為1ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(濃度為60ug/ml)。
檢測方法在反應孔中分別加入25μl樣品，再依次加入50μl中和e抗原試劑、25μl發光試劑和25μl生物素化抗體試劑。然後放入儀器，由儀器自動按以下步驟操作振動，37℃溫育15分鐘，再自動加入親和素包被的感光微粒試劑175μl後37℃溫育15分鐘。儀器自動產生雷射照射微孔計算每孔發光光子量，根據標準曲線可以推算樣品抗-HBe濃度，單位是PEIU/ml，也可以根據S/CO值判斷樣品的陰陽性，最後列印試驗報告。
1.定量模式性能評價 1.1檢測範圍 在3個臨床試驗點對1042個正常非B型肝炎患者的樣品進行檢測，99％的樣品抗-HBe水平小於0.50PEIU/ml。在本測定方法中，設定檢測範圍為0.3-10.0PEIU/ml。
1.2靈敏度的檢測 企業靈敏度參考品(編號L1-1～3、L2-1～3、L3-1～3)，均需檢出所要求的企業靈敏度參考品。1#需檢出L1-2；2#需檢出L2-2；3#需檢出L3-2。結果如下 1.3特異性的檢測 檢測20份特異性參考品，不得檢出假陽性。
1.4線性的檢測 對除0值外其他5點定標品(實施例5製備)做線性分析，計算線性相關係數r(r應大於0.99)，r＝0.9994。
1.5精密性的檢測 分別採用2個批號的抗-HBe試劑盒對高、低2個水平的B肝e抗體質控品進行檢測，重複10孔，將結果數值代入公式，計算CV值
1.6幹擾性試驗 在一份已知濃度的臨床標本中添加血紅蛋白、甘油三酯及膽紅素製成250mg/dL血紅蛋白的溶血標本、500mg/dL甘油三酯的脂血標本及10mg/dL膽紅素的黃疸標本進行檢測，測定值與原濃度的偏差不得超過15％。
2.定性模式檢測 使用靈敏度參考品、特異性參考品以及陰陽性對照對定性模式下的試劑進行檢測
由上述結果確定本產品在定性模式下靈敏度、特異性、精密性等指標均能達到要求。
實施例8比較試驗 試劑採用實施例4的方法製備發光抗體試劑(60ug/ml)、中和e抗原(1ug/ml)、生物素標記抗體試劑(1ug/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(60ug/ml)。
以美國Abbott公司Anti-HBe試劑盒為參照進行了質量水平比較，所用標本為前述靈敏度參考品，結果如下
根據以上結果，本發明試劑盒的最低檢出率與特異性已和Abbott公司的產品基本相當。
國內目前尚無經國家食品藥品監督管理局批准的同類方法試劑盒上市，故未進行比較。
與本產品檢測對象相近的B型肝炎e抗體(Anti-HBe)酶免法試劑盒在方法學上比較，酶免法以OD值體現樣本檢測值，OD值可檢測範圍窄，僅可做定性檢測，且靈敏度低。本試劑盒採用光激化學發光法測定標本中的Anti-HBe，具有靈敏度高、檢測範圍寬等特點，在方法學上較酶免法能達到更高的靈敏度和更優的檢測範圍。
實施例9試劑盒的組配 將實施例1和2中按照各種方法製備的兩種試劑分別獨立包裝，與按照實施例4的方法配置的中和e抗原試劑的獨立包裝組配後獲得基本試劑盒。可用於檢測待測樣本的光激化學反應光信號。按照實施例3製備的親和素包被的感光微粒試劑即可獨立包裝後組配入上述試劑盒，也可自行獨立包裝，與上訴試劑盒配合使用。
在上述試劑盒中加入分別獨立包裝的實施例5配製的陰性、陽性對照及參考樣後獲得定性檢測試劑盒。可用於定性檢測B型肝炎e抗原。
在上述試劑盒中加入獨立包裝的實施例5配製的定標品後獲得定量檢測試劑盒。可用於定量檢測B型肝炎e抗原。
實施例10臨床試驗 試劑盒中，各種試劑的濃度取值 發光抗體試劑含發光抗體60ug/ml 中和e抗原試劑含中和抗原1ug/ml 生物素標記抗體試劑含生物素標記抗體1ug/ml 親和素包被的感光微粒試劑含親和素包被的感光微粒(60ug/ml) 樣品來源臨床標本選擇為B型肝炎患者標本、門診及體檢標本和完成B型肝炎疫苗接種後一年的人群標本。本次臨床試驗中，B型肝炎患者標本共367例，門診及體檢標本共280例，完成B型肝炎疫苗接種後一年的人群標本共377例。合計1024例。
試驗結果 檢測中，採用Abbott AxSymB型肝炎e抗體檢測試劑盒做平行比較，計算兩者的陰陽性符合率。結果如下
陽性符合177/179*100％為98.9％ 陰性符合率845/845*100％為100％ 結論 本發明的B型肝炎e抗體(抗-HBe)檢測試劑盒(光激化學發光法)與Abbott試劑的陽性符合率為98.0％陰性符合率為100％。
通過臨床測試證明本發明試劑盒用於B型肝炎e抗體的檢測與國外產品相近，可用於臨床B型肝炎的輔助診斷及血液篩選使用。
權利要求
1.一種B型肝炎e抗體檢測試劑盒，包括抗-HBe抗體包被的發光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體以及中和e抗原，其中，中和e抗原為HBeAg。
2.如權利要求1所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述發光微粒粒徑為150-300nm。
3.如權利要求1所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述發光微粒的表面官能團選自羧基、醛基、胺基、環氧乙基或滷代烷基。
4.如權利要求3所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述發光微粒表面官能團選自羧基或醛基。
5.如權利要求1所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒中，發光微粒與抗-HBe抗體的質量比例為10∶(0.2-10)。
6.如權利要求5所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒中，發光微粒與抗-HBe抗體的質量比例為10∶(1-4)。
7.如權利要求6所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒中，發光微粒與抗-HBe抗體的質量比例為5∶1。
8.如權利要求1所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗-HBe抗體為鼠單克隆抗-HBe抗體。
9.如權利要求1所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述生物素標記的抗-HBe抗體中，生物素與抗體的分子比例為(5-50)∶1.
10.如權利要求9所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述生物素標記的抗-HBe抗體中，生物素與抗體的分子比例為30∶1。
11.如權利要求1所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒中還包括親和素包被的感光微粒。
12.如權利要求11所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質量比例為1∶5。
13.如權利要求1-12中任一權利要求所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體和中和e抗原分別獨立包裝。
14.如權利要求13所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體和中和e抗原均為混懸液。
15.如權利要求14所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括獨立包裝的親和素包被的感光微粒，且親和素包被的感光微粒為混懸液。
16.如權利要求14或15所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述混懸液的溶劑選自HEPES緩衝體系或Tris緩衝體系。
17.如權利要求16所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述混懸液的溶劑中含有蛋白保護劑、防止微粒聚集的穩定試劑或防腐劑中的一種或多種。
18.如權利要求13所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括獨立包裝的定標品或質控品，所述定標品或質控品為含有確定濃度B型肝炎e抗體的溶液。
19.如權利要求13所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括獨立包裝的陽性對照和陰性對照。
20.如權利要求13所述B型肝炎e抗體檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括獨立包裝的參考樣品，所述參考樣品為含有確定濃度B型肝炎e抗體的溶液，該確定濃度為B型肝炎e抗體臨床cutoff點對應的B型肝炎e抗體濃度。
21.一種定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，包括將待測樣品與抗-HBe抗體包被的發光微粒、中和e抗體、生物素標記的抗-HBe抗體以及親和素包被的感光微粒混合反應，而後用激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值，其中，中和e抗體為HBeAg。
22.如權利要求21所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，包括下列步驟
1)在反應孔中，將待測樣品和中和e抗原混合反應獲得反應溶液1；
2)在反應溶液1中加入抗-HBe抗體包被的發光微粒和生物素標記的抗-HBe抗體混合反應，獲得反應溶液2；
3)在反應溶液2中再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應溶液進行反應；
4)激發光照射反應孔，測量每個反應孔發光光子量獲得光信號值。
23.如權利要求22所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，所述步驟2和3的反應條件為37℃溫育10-30分鐘。
24.如權利要求23所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，所述步驟2和3的反應條件為37℃溫育15分鐘。
25.如權利要求22所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒為混懸液，混懸液中抗-HBe抗體包被的發光微粒濃度為40-300ug/ml，所述生物素標記的抗-HBe抗體為混懸液，混懸液中生物素標記的抗-HBe抗體濃度為0.5-10ug/ml，所述親和素包被的感光微粒為混懸液，混懸液中親和素包被的感光微粒濃度為30-100ug/ml。
26.如權利要求25所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒混懸液中，抗-HBe抗體包被的發光微粒濃度為40ug/ml-160ug/ml，所述生物素標記的抗-HBe抗體混懸液中，生物素標記的抗-HBe抗體濃度為0.5ug/ml-1.5ug/ml，所述中和e抗體為混懸液，混懸液中HBeAg的濃度為0.5-2ug/ml。
27.如權利要求26所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，所述抗-HBe抗體包被的發光微粒混懸液中，抗-HBe抗體包被的發光微粒濃度為60ug/ml，所述生物素標記的抗-HBe抗體混懸液中，生物素標記的抗-HBe抗體濃度為1ug/ml，所述親和素包被的感光微粒混懸液中，親和素包被的感光微粒濃度為60ug/ml，所述中和e抗體混懸液中，HBeAg的濃度為1ug/ml。
28.如權利要求22所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，所述反應溶液2的體積為50-125ul，最終反應溶液的體積為120-300ul。
29.如權利要求28所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，所述反應溶液2的體積為125ul，最終反應溶液的體積為300ul。
30.如權利要求22-29中任一權利要求所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，當定性檢測B型肝炎e抗體時，步驟1中所述待測樣品為待測血樣或抗-HBe抗體參考樣品，步驟4後還包括計算待測血樣與抗-HBe抗體參考樣品光信號的比值，即S/CO值，其中，參考樣品為含有確定濃度B型肝炎e抗體的溶液，該確定濃度為B型肝炎e抗體臨床cutoff點對應的B型肝炎e抗體濃度。
31.如權利要求22-29中任一權利要求所述定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法，其特徵在於，當定量檢測B型肝炎e抗體時，步驟4後還包括根據標準曲線計算待測樣品抗-HBe抗體含量。
全文摘要
本發明涉及B肝的診斷試劑，公開了B型肝炎病毒e抗體檢測試劑盒及檢測方法。本發明採用光激化學發光檢測技術，公開了一種B型肝炎e抗體檢測試劑盒，包括抗-HBe抗體包被的發光微粒、生物素標記的抗-HBe抗體以及中和e抗原。本發明還進一步公開了利用光激化學發光檢測技術定性或定量檢測B型肝炎e抗體的方法。本發明的檢測試劑盒可以與其它血清和臨床信息聯合用於診斷個體發生急性或慢性B型肝炎感染的情況，也可用於對圍產期女性B型肝炎的篩選，以判斷新生兒感染B型肝炎的危險性。此外，本發明的試劑盒具有靈敏度高、檢測範圍寬等特點，在方法學上較酶免法能達到更高的靈敏度和更優的檢測範圍。
文檔編號G01N33/576GK101620229SQ200810040118
公開日2010年1月6日 申請日期2008年7月2日 優先權日2008年7月2日
發明者王海蛟, 趙衛國 申請人:博陽生物科技(上海)有限公司