一種檢測糖鏈異常IgA腎病的裝置及應用此裝置的試劑盒的製作方法

2023-12-09 04:02:31

專利名稱：一種檢測糖鏈異常IgA腎病的裝置及應用此裝置的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及了一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱及應用此裝置的試劑盒，屬於生物技術領域，用於對IgA腎病發生進行診斷。
背景技術：
IgA腎病(IgAN)是一組多病因引起的具有相同免疫病理學特徵的慢性腎小球疾病。臨床上約40％-45％的患者表現為肉眼或顯微鏡下血尿，35％-40％的患者表現為顯微鏡下血尿伴蛋白尿，其餘表現為腎病症候群和腎功能衰竭。IgA腎病是世界範圍內一種常見的腎小球疾病，它的流行在不同洲、不同國家或在一個國家不同地區的差異很大，如亞洲的日本、新加坡，IgA腎病的發病率佔原發性腎小球疾病的50％，而美國西部的印第安人低發區只佔2％。一般而言，白人、黃種人明顯高於黑人的發病率。我國IgA腎病的發病率佔原發性腎小球疾病的26％～34％。男女之比大約是2∶1。以血尿為主的IgA腎病目前尚無特效的治療。
目前診斷依據1.肉眼血尿或顯微鏡下血尿或無症狀性蛋白尿(尤其男性青年)；2.血尿為腎小球性(畸形紅細胞為主)，蛋白尿為高、中分子或混合性蛋白尿，血清IgA可能升高；3.腎活檢免疫病理檢查腎小球繫膜區可見到顆粒狀IgA為主的免疫螢光；4.除外鏈球菌感染後急性腎小球腎炎、非IgA繫膜增生性腎炎、薄基底膜腎病、狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、肝硬化及酒精性肝病的腎損害等。本病診斷依靠腎活檢標本的免疫病理學檢查，臨床缺乏簡便的免疫學檢測方法。
IgA分IgA1和IgA2兩個亞型。正常人血清中IgA1約佔80％～90％。IgA1與IgA2亞型的重要區別之一就是IgA1分子的絞鏈上有O-連接寡糖鏈，其結構式為Ser(Thr)-GalNAc-Gal-NA，而IgA2及其它免疫球蛋白則無此糖鏈結構。因此通常所說的糖鏈異常IgA既指糖鏈異常IgA1。
蛋白質糖基化的方式有兩種N-連接方式和O-連接方式。N-連接糖基與肽鏈上的天冬醯胺殘基相連，其糖基鏈較長且結構複雜；O-連接糖基與肽鏈上的絲氨酸或蘇氨酸殘基相連，其糖基鏈較短且結構簡單。大多數的血清糖蛋白僅含有N-連接糖基而無O-連接糖基，膜上的糖蛋白的糖基則多為O-連接糖基。
所有的免疫球蛋白均為糖蛋白，其中IgA糖基化程度很高，分子中含有8％的糖，而且它為少見的幾種既含N-連接糖基又含O-連接糖基的血清蛋白之一，其分子每側重鏈中含有2個或多於2個的N-連接糖基和3-5個O-連接糖基。目前已知的含有O-連接糖基的血清蛋白有IgD、C1抑制物、纖溶酶原、白介素-2、白介素-6、載脂蛋白CIII、載脂蛋白E和促紅細胞生成素，但這些糖蛋白在血清中的含量遠小於IgA1。
IgA1分子O-連接糖基最基本的結構是N一乙醯乳糖胺(GalNAc)以O-連接方式與肽骨架上的絲氨酸或蘇氨酸殘基相連。在此基礎上N一乙醯半乳糖胺可通過β1、3半乳糖基轉移酶在其末端連上半乳糖基。
目前研究表明，IgA腎病與IgA糖鏈上半乳糖狀態相關。IgA腎病其典型的病理改變為腎小球基底膜上IgA1單體及聚合IgA1複合物的大量沉積。研究發現該沉澱實際上是包含IgA1的免疫複合物，而導致此免疫複合物的產生原因是IgA1由於異常糖鏈變化即半乳糖缺失而產生自身抗原性。
IgA1的寡糖鏈半乳糖基缺失，導致其末端糖基N一乙醯乳糖胺GalNAc處於暴露狀態。病人IgA1較正常IgA1與凝集素HAA(Helix aspersa agglutin)，結合率明顯增加。
IgA1半乳糖基化缺失的致病原因與肝細胞對其代謝性清除減少有關。肝細胞膜上含有非唾液酸糖蛋白受體，該受體通過IgA1寡糖鏈上的半乳糖Gal與IgA1特異識別，而去半乳糖型IgA1失去與此受體結合能力，因此，導致循環中去半乳糖基IgA1含量增加，並沉積到基底膜上。此外，去半乳糖基IgA1還易與IgG形成較大複合物，也阻礙了肝細胞對其攝取和處理的效能。IgA1寡糖鏈的末端半乳糖是由β1，3-半乳糖苷轉移酶(β1，3-GTase)催化的，IgAN病人也伴有此酶的活性降低。用去半乳糖處理後的絞鏈區IgA1與T細胞、B細胞和單核細胞共培養，以觀察受體細胞對其重新半乳糖基化的轉化能力實驗表明；病人與正常人T細胞和單核細胞的轉化率無差別，而B細胞轉化率在病人則明顯降低，提示B細胞中β1，3-Gtase酶量及活性的變化。
因此IgA腎病中IgA1糖鏈異常變化後會影響其與相應受體或其它蛋白的相互作用，從而更易於與繫膜基質成份結合和形成免疫複合物，沉積於腎小球，這是導致IgA腎病的分子機理。
因此，檢測血清中糖鏈異常IgA1是早期診斷IgA腎病的關鍵。
目前國內外尚缺乏對靈敏、特異診斷的實驗室檢查方法，金標準只能依靠腎活檢穿刺術取腎組織，通過免疫螢光等病理分析來確診。由於腎活檢是一種創傷性手術，有一定的危險性，可引起血尿等併發症，同時手術費用昂貴，所以常不被病人所接受。
臨床需要一種能夠快速高效檢測糖鏈異常IgA的試劑盒，但是一直沒有進展。造成此困難的原因是正常IgA與糖鏈異常IgA1的差異只存在於糖鏈，既其只有質的細微改變而無明顯量的變化，以往手段無法進行二者的有效區分。
凝集素是一類廣泛存在於自然界的一大類非免疫來源的蛋白質或糖蛋白，它能與糖專一性地、非共價地可逆結合，並且有凝集血細胞的作用，故稱為凝集素。
Sumner和Howell於1936年首先從刀豆(jackbean，Canavalia ensiformis)種子純化了伴刀豆凝集素-ConA。ConA能凝集溶液中的糖元和澱粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推測ConA的血凝作用是與細胞表面糖作用的結果。
目前已有近千種植物被測得具有凝集素活性。植物中，不只種子中存在凝集素，根、莖、葉、皮、果實汁中也發現有凝集素。除植物外，其它生物，如各種真菌、某些病毒、無脊椎動物、脊椎動物及至人體的各種組織和器官中都存在凝集素。
凝集素可與糖專一性地結合。目前按結合糖的類型，凝集素可分為六類D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙醯氨基葡萄糖；N-乙醯氨基半乳糖；D-半乳糖；L-巖藻糖；唾液酸。凝集素HAA(Helix aspersa agglutin)來源於歐洲花園蝸牛，能特異與缺失半乳糖的GalNAc結合，類似的凝集素還有目前蝸牛凝集素HPA(Helix pomatia agglutin)，野生長絨毛豌豆凝集素VVA(Vicia villosa agglutin)，花生凝集素PNA(Peamut agglutinin)。

發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明提供一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱及含有該預裝柱的診斷試劑盒。通過該試劑盒可以真實地檢測出血清或尿液中糖鏈異常IgA的含量水平，準確地診斷出IgA腎病，具有極高的靈敏度，方法快速簡便。
一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱，該預裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離心管裝有偶聯凝集素的親合介質，所述下部收集管中裝有緩衝溶液，所述分離管底部有一濾布，使得瓊脂糖顆粒無法穿過的濾布。該裝置通過離心收集純化的組分。
所述凝集素包括歐洲花園蝸牛凝集素HAA(Helix aspersa agglutin)、蝸牛凝集素HPA(Helix pomatia agglutin)，野生長絨毛豌豆凝集素VV(Vicia villosa)，花生凝集素PNA(Peamut agglutinin)。
所述親合介質是採用瓊脂糖凝膠為基礎載體的介質包括瓊脂糖sepharose4B、瓊脂糖凝膠sepharose 6B或瓊脂糖凝膠sepharose FF，瓊脂糖凝膠sepharoseCL-4B、瓊脂糖凝膠sepharose CL-6B。
所述緩衝溶液為凝集素的活性保護液。
所述瓊脂糖凝膠為sepharose 4B，緩衝液為凝集素的活性保護液，含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH 7.5。
所述濾布是能阻擋偶聯有凝集素的親合介質穿過而不阻擋液體和蛋白質穿過的濾布。
所述檢測的標本是血清和尿液，血清指去除血液中細胞成分，離心後的上清液體。
所述裝有偶聯凝集素的瓊脂糖凝膠由以下步驟得到的採用Pharmacia公司經CNBr活化的Sepharose 4B偶聯凝集素HAA(採購自Sigma公司)。
(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡於1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏鬥，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取2mgHAA，溶於7.5mL偶聯緩衝液(0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 8.3)，與經洗滌的Sepharose 4B合併，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；
(3)以10mL偶聯緩衝液洗去未偶聯的HAA，測定洗滌液中的HAA含量，計得偶聯率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩餘活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩衝液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩衝液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA、1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存備用。
本發明提供了與微量離心柱配套使用，用於洗脫結合到HAA-Sepharose上面的糖鏈異常IgA1的洗脫液，其製作方法和組成如下20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩衝液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，為保證長時間保存而不長菌，加入防腐劑Proclin 300至0.1％。
洗脫步驟在洗脫時，將上述溶液加入其中，在溫箱中溫育30分鐘，達到洗脫的目的。
本發明提供了一種採用該預裝離心柱進行純化糖鏈異常IgA步驟及其相關試劑組成。
該組合包括預裝微量離心柱(內裝已經偶聯了歐洲花園蝸牛凝集素HAA的瓊脂糖和其保護液)，清洗液(20mmTris-Hcl，PH7.4緩衝液，0.1％Proclin300)，洗脫液(20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩衝液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，0.1％，Proclin 300)。
1.將待檢測血清或尿液完全離心，血清要求無溶血；取出預裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取250ul血清或尿液於試管中，並加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋後標本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請不要蓋離心管蓋子，樣本稀釋液將在15分鐘內流入下層收集管中；試管中剩餘150ul稀釋標本(樣本①)準備對照檢測用。
4.將收集管內液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(或3000轉)室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(或3000轉)室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數滴出現在下層收集管時，蓋上離心管蓋，放置37℃恆溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉)轉室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測。
本發明提供了一種含有上述預裝離心柱的化學發光試劑盒及其製作方法。
該化學發光試劑盒包括了分離IgA腎病糖鏈異常IgA1的預裝離心柱；包被了羊抗人IgA的化學發光酶標板；陽性對照物、陰性對照物；酶標記的抗IgA1單克隆抗體；底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA1清洗緩衝液、糖鏈異常IgA1洗脫液、IgA標準品。
本試劑盒的製作方法如下(1)包被將普通高滴度的羊抗人IgA多抗(來源於Sigma公司)用0.05M檸檬酸緩衝液稀釋後加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩衝液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩衝液封閉過夜，甩幹後晾乾，即獲得單克隆抗體包被酶標板。化學發光酶標板可選用國產板或進口板；規格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對照物陽性對照物收集IgA腎病病人血清，過濾除菌、分裝；陰性對照物收集正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標記單抗購買自Sigma公司的HRP-鼠抗人IgA1。
(4)輔助試劑的配製方法如下a)底物溶液A通過市售獲得b)顯色液B通過市售c)糖鏈異常IgA1清洗緩衝液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑d)糖鏈異常IgA1洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑d)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配製的0.05％吐溫20溶液；(5)將預裝離心柱、包被了羊抗人IgA多抗的化學發光酶標板、陽性對照物、陰性對照物、酶標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA1清洗緩衝液、糖鏈異常IgA1洗脫液、IgA標準品共同包裝，得到試劑盒。
本發明還提供了一種含有上述預裝離心柱的酶聯免疫定量檢測試劑盒及其製作。
該試劑盒包括了分離IgA腎病糖鏈異常IgA1的預裝離心柱；包被了羊抗人IgA多抗的酶標板；陽性對照物、陰性對照物；酶標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體；底物溶液A、顯色液B、反應終止液、糖鏈異常IgA1清洗緩衝液、糖鏈異常IgA1洗脫液、IgA標準品、濃縮洗滌液。
本試劑盒的製作方法如下(1)包被將普通高滴度的羊抗人IgA多抗(來源於Sigma公司)用0.05M碳酸緩衝液稀釋後加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩衝液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩衝液封閉過夜，甩幹後晾乾，即獲得單克隆抗體包被酶標板。酶標板是聚苯乙烯酶標板，可選用國產板或進口板；規格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對照物陽性對照物收集IgA腎病病人血清，過濾除菌、分裝；陰性對照物收集正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標記單抗標記HRP的鼠抗人IgA1單克隆抗體來源於Sigma公司。
(4)輔助試劑的配製方法如下a)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩衝液(pH5.0)配製的3％過氧化氫溶液；b)顯色液B四甲基聯苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；c)糖鏈異常IgA1清洗緩衝液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑d)糖鏈異常IgA1洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑e)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配製的0.05％吐溫20溶液；f)反應終止液2mol/L硫酸；(5)將預裝離心柱、包被了羊抗人IgA多抗的酶標板、陽性對照物、陰性對照物、酶標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA1清洗緩衝液、糖鏈異常IgA1洗脫液、反應終止液、IgA標準品共同包裝，得到試劑盒。
本發明克服了以往IgA腎病無特異檢測方法的缺點，避免腎活檢給病人帶來的痛苦，操作者只需要離心和溫育等簡單操作，在2小時內就可以完成檢測，直接定量計算出血樣或尿液標本中所含的糖鏈異常IgA1的含量，方法簡便，檢測快捷，結果準確，為IgA腎病的預防、診斷、治療提供了支持。


附圖為本發明預裝離心柱的剖面結構示意圖。
具體實施例方式
下面用實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明的實施例是用於說明本發明而不是對本發明的限制。根據本發明的實質對本發明進行的具體改進都屬於本發明要求保護的範圍。
參見附圖，本發明提供的一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA1的預裝離心柱，由位於上部的分離管1和位於下部的收集管3組成，通常可以採用將分離管插接到收集管上的方式實現兩者的連接，所述上部分離管裝有偶聯凝集素的親合介質4(為圖面清晰起見，圖中標註的是用於裝親合介質的管內空間，沒有繪出介質實物)，所述下部收集管中裝有緩衝溶液(為圖面清晰起見，圖中標註的是用於裝緩衝溶液的管內空間，沒有繪出溶液實物)，所述分離管底部主要是一濾布，該濾布採用能阻擋偶聯有凝集素的親合介質穿過而不阻擋液體和蛋白質穿過的濾布，以便在離心分離時，分離出來的液體和蛋白質能夠透過該濾布進入下面的收集管。可以使用現有的這種濾布，並通過在分離管底部設置一個夾持塑料墊圈，將濾布固定住。
實施例1檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的酶聯免疫定量檢測試劑盒的製作該試劑盒(96人份)組成包括IgA腎病糖鏈異常IgA親和吸附離心管96份IgA腎病陰性、陽性對照物各1瓶；
羊抗人IgA多抗包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；IgA標準品1瓶；底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；反應終止液1瓶，5ml/瓶；糖鏈異常IgA清洗緩衝液25ml/瓶糖鏈異常IgA洗脫液15ml/瓶濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)20ml/瓶具體操作如下1.製備IgA腎病-陰性、陽性對照物1)收集血清或尿液從醫院或血站獲得健康正常人血清，於-20℃保存備用；當試劑盒用於檢測尿液時，對照陽性採用IgA腎病陽性病人尿液。
2)分裝陽性對照物在無菌條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存於4℃；陰性對照物正常人血清，經檢定為IgA腎病陰性。取多份以上血清合併成批，經60℃1小時處理後，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存於4℃。
2.製作羊抗人IgA多抗包被板a)包被酶標板採用進口或國產的12×8可拆條板。將羊抗人IgA多抗用0.05mol/L碳酸鹽緩衝液稀釋為20μg/ml後加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩衝液洗板，再用該封閉液2％BSA封閉過夜，甩幹後晾乾，即獲得羊抗人IgA多抗包被酶標板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；
b)辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體可以市售(Sigma公司)獲得4)分裝用含10％胎牛血清的緩衝液稀釋由步驟3)獲得的酶標鼠抗人IgA1單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存於4℃。
4.輔助試劑的配製1)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩衝液(PH5.0)配製的3％過氧化氫溶液，按5ml/瓶分裝；2)顯色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分裝；3)反應終止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分裝；4)糖鏈異常IgA清洗緩衝液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑5)糖鏈異常IgA洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑6)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配製的0.05％吐溫20溶液；實施例2檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的化學發光檢測試劑盒的製作該試劑盒(96人份)組成包括IgA腎病糖鏈異常IgA親和吸附離心管96份IgA腎病陰性、陽性對照各1瓶；羊抗人IgA多抗包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；IgA標準品1瓶底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；糖鏈異常IgA清洗緩衝液25ml/瓶糖鏈異常IgA洗脫液15ml/瓶濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)20ml/瓶具體操作如下1.製備IgA腎病-陰性、陽性對照物1)收集血清或尿液從醫院或血站獲得健康正常人血清，於-20℃保存備用；當試劑盒用於檢測尿液時，對照陽性採用IgA腎病陽性病人尿液。
2)分裝陽性對照物在無菌條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存於4℃；陰性對照物正常人血清，經檢定為IgA腎病陰性。取多份以上血清合併成批，經60℃1小時處理後，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存於4℃。
2.製作羊抗人IgA多抗包被板a)包被化學發光酶標板採用進口或國產的12×8可拆條板。將步驟1)羊抗人IgA多抗用0.05mol/L檸檬酸緩衝液稀釋為20μg/ml後加入酶標板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩衝液洗板，再用該封閉液緩衝液封閉過夜，甩幹後晾乾，即獲得單克隆抗體包被酶標板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；b)辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體通過市售(Sigma公司)獲得4)分裝用含10％胎牛血清的緩衝液稀釋由步驟3)獲得的酶標鼠抗人IgAl單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存於4℃。
4.輔助試劑的配製1)底物溶液A1.0ml EDTA(1.0×10-2M、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)和0.2ml Tween20(1％)2)顯色液Bluminol 5.0×10-4Mol/L；
3)糖鏈異常IgA清洗緩衝液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑4)糖鏈異常IgA洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑5)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配製的0.05％吐溫20溶液；實施例3預裝離心柱的製備和使用1、預裝離心柱由離心柱和填充介質組成，離心柱由上部的離心管和下部的收集管組成，二者套在一起，組成離心柱，輔助試劑包括糖鏈異常IgA清洗液和糖鏈異常IgA洗脫液。
2、離心柱填充材料的製備採用Pharmacia公司經CNBr活化的Sepharose4B和Sigma公司的HAA，按以下步驟偶聯(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡於1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏鬥，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取50mg HAA，溶於7.5mL偶聯緩衝液(0.1mmol/L NaHCO3，pH8.3，0.5mol/L NaCl)，與經洗滌的Sepharose 4B合併，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；(3)以10mL偶聯緩衝液洗去未偶聯的HAA。經測定洗滌液中的HAA含量，計得偶聯率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩餘活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩衝液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩衝液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA，1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存備用。
3、在上部分離心管中，加入一層濾布，並加一個塑料墊圈固定，該濾布的孔徑小於瓊脂糖，因此瓊脂糖不能經過，但是蛋白質量和液體可以流過。取300ul已經偶聯的凝集素的sepharose 4B加入離心柱上部的離心管中。
4、加入1ml-2ml凝集素保存緩衝液，緩衝液充滿存在介質的部位，並大部分存在於下面的收集管中，本發明預裝離心柱下部收集管中的緩衝液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L MnCl2和50mmol/L Tris-HCL，PH 7.5本預裝離心柱的使用方法如下1.將待檢測血清或尿液完全離心，血清無溶血；取出預裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取250ul樣本於試管中，並加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋後標本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請不要蓋離心管蓋子，樣本稀釋液將在15分鐘內流入下層收集管中；4.將收集管內液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(或3000轉)室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(或3000轉)室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數滴出現在下層收集管時，蓋上離心管蓋，放置37℃恆溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉)轉室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測。
本發明的試劑盒的質量檢測方法是
1)蛋白載量偶聯HAA的含量通過計算偶聯前蛋白含量減去未偶聯蛋白獲得含量。要求不低於7mg/ml，在7-10mg/ml可以取得較好的結果。
2)準確性5份正常陰性質控血清(包括特異性對照血清)參考品、5份正常尿液參考品的檢測結果，無假陽性出現。3份IgA腎病患者血清和2份IgA腎病患者尿液標本檢測結果無假陰性出現。
3)精密度隨機抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份陽性質控血清按說明書操作步驟進行重複測定。計算每次測定結果，求出均值、SD和變異係數CV。精密度試驗結果顯示批間CV小於10％。
3)檢測靈敏度根據IgA標準品稀釋測定結果，本試劑盒的檢測靈敏度為10ng/ml。
實施例4用本發明提供的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的化學發光檢測試劑盒進行糖鏈異常IgA含量檢測的方法和步驟是一、試劑盒組成1，羊抗人IgA多抗包被板2，鼠抗人IgA1單抗酶標記物3，化學發光底物A和B4，濃縮洗滌液5，預裝HAA-Sepharose 4B親和吸附離心管6，糖鏈異常IgA清洗液7，糖鏈異常IgA洗脫液8，IgA定量標準品9，說明書10，蓋板膜二、標本處理和糖鏈異常IgA純化
1.取出預裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。將待檢測血清或尿液完全離心，血清要求無溶血；2.樣本稀釋吸取250ul血清或尿液於試管中，並加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋後標本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請不要蓋離心管蓋子，樣本稀釋液將在15分鐘內流入下層收集管中；試管中剩餘150ul稀釋血清(樣本①)準備對照檢測用。
4.將收集管內液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(或3000轉)室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(或3000轉)室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數滴出現在下層收集管時，蓋上離心管蓋，放置37℃恆溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉)轉室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測。
三、定量檢測糖鏈異常IgA1.設計好包被板的位置及數量，未用的包被板密閉，放入到2-8℃冰箱中。
2.加入待檢查糖鏈異常IgA的標本到相應的包被板微孔中。
3.37℃溫育30分鐘。
4.洗滌5次，扣幹包被板上殘留的液體。
5.依次向各孔中加入100μl的酶結合物。
6.37℃溫育30分鐘7.洗滌5次，扣幹包被板上殘留的液體8.向每孔加入50μl底物液，請預先將A、B液等體積混合；或向每孔中先加25μl底物A再加25μl底物B，輕輕拍勻5秒鐘。
9.在加入底物後10分鐘內採用化學發光儀進行檢測。四、結果判定製作標準曲線以標準品濃度為橫坐標，標準品測定的RLU值為縱坐標，作出標準曲線；計算標準曲線回歸係數R2，當R2＞0.95時本次測定有效；將檢測所得的讀值按該試劑標準品曲線計算糖鏈異常IgA含量，比值判定糖鏈異常IgA≥10ng/mL為IgA腎病或患IgA腎病高危者糖鏈異常IgA1％判定(IgA1樣本2含量÷IgA1樣本1含量)*100％糖鏈異常IgA1％≥10％為IgA腎病陽性糖鏈異常IgA1％＜10％為IgA腎病陰性實施例5採用本發明提供的試劑盒對IgA腎病病人陽性樣品的檢測結果為判斷本發明酶聯免疫試劑盒與臨床IgA腎病檢測結果的符合率，取本發明的試劑盒進行了對比檢測實驗。採用北京大學附屬第一醫院提供的20份已知IgA腎病標本和來自河北血液中心的20份正常獻血員血清進行對比檢測。
表1.在不同標本中檢出率比較

實施例5採用本發明提供的試劑盒對IgA腎病病人血清樣品和尿液樣品檢測的對比結果為判斷本發明對兩種樣本檢測的差異，取本發明的化學發光試劑盒試劑盒對來自美國阿拉巴馬州伯明罕大學醫學系提供的10份已知IgA腎病血清和尿液標本進行對比檢測。
表2.在不同標本中檢出率比較

結果表明兩種體液檢測無明顯差異。
權利要求
1.一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱，其特徵在於其由上部分離管和下部收集管組成，所述上部離管裝有偶聯凝集素的親合介質，上部的分離管底部有一濾布，所述下部收集管中裝有緩衝溶液。為純化親和吸附的蛋白，並配套清洗液和洗脫液。
2，如權利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱，其特徵在於所述凝集素為歐洲花園蝸牛凝集素HAA、蝸牛凝集素HPA、或野生長絨毛豌豆凝集素VVA、花生凝集素PNA。
3.如權利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱，其特徵在於所述親合介質是採用瓊脂糖基礎介質包括瓊脂糖凝膠sepharose 4B、瓊脂糖凝膠sepharose 6B、或瓊脂糖凝膠sepharose FF，瓊脂糖凝膠sepharoseCL-4B、瓊脂糖凝膠sepharose CL-6B所述緩衝溶液為凝集素的活性保護液。
4.如權利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱，其特徵在於所述濾布是能阻擋偶聯有凝集素的親合介質穿過而不阻擋液體和蛋白質穿過的濾布。
5.如權利要求3所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱，其特徵在於所述裝有偶聯凝集素HAA的瓊脂糖凝膠通過以下步驟獲得(1)將溴化氫活化Sepharose 4B用1mmol/L HCl浸泡、洗滌；(2)稱取HAA，溶於偶聯緩衝液中，與經洗滌的Sepharose4B合併混勻；(3)用偶聯緩衝液洗去未偶聯的HAA，測定洗滌液中的HAA含量，計得偶聯率為98％；(4)用甘氨酸封閉剩餘活化基因，洗滌，4℃暫存備用。
6.如權利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱，其特徵在所述檢測的標本是血清和尿液，血清指去除血液中細胞成分，離心後的上清液體。
7.一種檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其特徵為試劑盒所含的標本處理系統如權利要求1所述，經過權利要求1所述的裝置進行純化獲得糖鏈異常IgA後，進行檢測獲得其含量。該種定量檢測方法包括放射免疫測定法、螢光免疫測定法(時間分辨螢光技術)、酶免疫測定法、免疫膠體金標記技術、化學發光免疫測定法、電化學發光免疫測定法。
8.一種如權利要求7所述的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其特徵為標本處理系統如權利要求1所述，檢測糖鏈異常IgA和糖鏈異常IgA含量採用化學發光方法，檢測試劑盒包括下列組件(1)分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱；(2)包被了羊抗人IgA多抗的化學發光酶標板；(3)陽性對照物、陰性對照物；(4)酶標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體；(5)化學發光底物溶液A、化學發光底物顯色液B、糖鏈異常IgA清洗緩衝液、糖鏈異常IgA洗脫液、IgA標準品，所述分離糖鏈異常IgA的預裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯凝集素的親合介質，所述下部收集管中裝有緩衝溶液。
9.一種如權利要求7所述的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其特徵為標本處理系統如權利要求1所述，檢測糖鏈異常IgA採用酶聯免疫定量分析方法，檢測試劑盒包括下列組件(1)分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱；(2)包被了羊抗人IgA多抗的酶標板；(3)陽性對照物、陰性對照物；(4)酶標記的鼠抗人IgA1單克隆抗體；(5)底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA清洗緩衝液、糖鏈異常IgA洗脫液、反應終止液、IgA標準品、濃縮洗滌液，所述分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯凝集素的親合介質，所述下部收集管中裝有緩衝溶液。
10，一種如權利要求7所述的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其判定方法為計算糖鏈異常IgA佔總IgA的比值、計算糖鏈異常IgA的含量。
全文摘要
本發明涉及了一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預裝離心柱。該離心柱由上部分離管和下部收集管組成。上部分離管裝有偶聯蝸牛凝集素(HAA)的親合介質，上部分離管底部是一個濾布，下部收集管中裝有緩衝溶液。蝸牛凝集素(HAA)能與糖鏈異常IgA相結合。經過離心洗脫，獲得與蝸牛凝集素HAA相結合的糖鏈異常IgA。本發明還涉及了一種含有該預裝離心柱的化學發光檢測試劑盒和一種含有該預裝離心柱的酶聯免疫定量檢測試劑盒及其製備、使用方法。應用該試劑盒可快速、簡便的測定糖鏈異常IgA的含量，準確的對IgA腎病進行早期診斷，為IgA腎病的預防、診斷、治療提供支持。
文檔編號G01N33/53GK101051010SQ20071010750
公開日2007年10月10日 申請日期2007年5月17日 優先權日2007年5月17日
發明者林長青 申請人:北京熱景生物技術有限公司