一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法

2023-12-08 15:55:31

專利名稱：：一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法
技術領域：
：本發明屬於香蕉生物技術育種領域，特別涉及一種有效提高大蕉(MwflABB，ra血/flcoLinn.cv.DaJiao)禾卩巴西蕉(Mm"AAACavendishcv.Baxi)胚性懸浮細胞(ECS)體胚發生頻率並成功再生植株的方法。
背景技術：
：香蕉(包括大蕉)是世界上最重要的經濟作物和農作物之一，也是許多熱帶亞熱帶國家和地區的主要糧食，為近五億人口提供主食，是繼水稻、小麥、玉米之後的第四大糧食來源。我國香蕉的總產量居全球的第三/四位，廣泛種植於廣東、福建、海南、廣西和雲南等省，產銷數額一直雄居南方水果之冠，被譽稱為我國南方的四大水果之一，有著巨大的經濟和社會效益。但是目前香蕉病害猖獗，面臨著包括真菌、細菌、病毒和生理性等多種病害的嚴重烕脅，其中由尖孢鐮刀菌引起的香蕉枯萎病能侵染絕大多數香蕉栽培品種，己經成為我國乃至世界上香蕉毀滅性的病害。我國最受大眾歡迎的巴西蕉(A/MaAAACavendishcv.Baxi)正是易感香蕉枯萎病的品種之一，而另一栽培種大蕉(MmmABBpora^w'acaLinnxv.DaJiao)已被證實具有抗香蕉枯萎病4號生理小種的優良特性，但由於其風味口感較差而市場收益不高。因此，如何培育出抗香蕉枯萎病且具有高經濟效益的香蕉新種是目前香蕉產業所面臨的迫切問題。然而大多數栽培蕉是無法產生種子的三倍體，難於利用傳統的雜交育種方式對其種質進行改良。而包括體外誘變、轉基因、體細胞雜交等生物技術育種方式有望可解決香蕉面臨的上述問題。建立穩定的香蕉胚性細胞懸浮系(ECSs)及高效的經體胚發生途徑的植株再生體系則是香蕉生物技術育種的前提條件。目前香蕉ECSs可通過多種途徑獲得，包括未成熟合子胚培養、scalps培養及未成熟花序培養。以未成熟花序為外植體是獲得香蕉ECSs並經體胚發生途徑獲得再生植株的較有效和重複性最好的方法，應用此法已經從多個品種的香蕉中成功獲得再生植株。但是這一培養體系亦存在不足之處花序外植體的採集受抽蕾季節的限制、不同植株花序生理狀態的差異、樣品採集時氣候的不同等諸多因素都影響該體系的穩定性，致使其胚性愈傷組織誘導率通常低於4%;胚性愈傷組織轉換為理想的ECS效率及其體胚發生能力、植株轉換率(通常不高於20%)均非常低下。鑑於以上技術瓶頸，目前尚未有建立巴西蕉ECS和大蕉ECS及其通過體胚發生再生植株的相關報導。
發明內容為了克服上述現有技術存在的不足,本發明的目的在於提供一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎(簡稱體胚)發生再生植株的方法。該方法首次建立大蕉(A/w犯ABBp"rtwfe/acaLinn.cv.DaJiao)禾口巴西蕉(MmmAAACavendishcv.Baxi)的胚性細胞懸浮系，並提供一種有效的提高其體細胞胚胎發生頻率成功再生植株的方法，為大蕉和巴西蕉的生物技術育種奠定基礎。本發明的目的通過下述方案實現一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟.-O)胚性愈傷組織的誘導分別以大蕉或巴西蕉112梳未成熟雄花序為外植體，接種於愈傷組織誘導培養基上誘導出胚性愈傷組織。(2)均一穩定的胚性細胞懸浮系(ECS)的建立挑取步驟(1)誘導出的大蕉黃色小顆粒狀胚性愈傷組織或巴西蕉淺黃色小顆粒狀胚性愈傷組織，分別轉入M2液體培養基，置於90110rpm搖床上懸浮培養34個月即可得較為分散、均質的大蕉胚性懸浮細胞或巴西蕉胚性懸浮細胞。(3)體細胞胚胎的誘導在體胚誘導前先將上述胚性懸浮細胞轉入不含2,4-D的M2液體培養基中預培養710天，隨後經篩網過濾篩選出大小及生長狀態較一致的細胞團，從中吸取0.22ml20%SCV(settledcellvolume,靜置10分鐘後所得的細胞沉澱體積)接種於含Img'LABA和5mg'L—1抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於2s土rc黑暗中進行體細胞胚胎的誘導；將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基中繼續培養直至體胚發育成熟，得到成熟體胚。(4)體胚的萌發及其植株再生將步驟(3)誘導出的成熟體胚轉入體胚萌發培養基中；置於28土rC黑暗培養，待葉鞘抽出後，將其轉至MR生根壯苗培養基中繼續培養，進一步發育成健壯的香蕉小植株。所述不含2,4-D的M2液體培養基的組成為MS基本培養基+4.1(jmol'L"生物素+680]^101「1穀氨醯胺+100mgL"麥芽提取物+130mmolL'1蔗糖，pH5.3，高溫高壓滅菌。所述體胚誘導培養基的組成為SH(Schenk和Hildebrandt1972)大量和微量元素及其鐵鹽+MS維生素+4.5pmol'L"生物素+680pmol'L"穀氨醯胺+211111101丄-1脯氨酸+10011^1/1麥芽提取物+1.1pmol'L"NAA+0.5iamol'L激動素+44ng'L"玉米素+29mmol'L-'乳糖+130mmol'L"蔗糖+1mg'L-1ABA+5mg'L"抗壞血酸+2g'L"Gelrite，其中ABA和抗壞血酸事先分別配置成10mgmr'母液，過濾滅菌後添加到pH5.8、經高溫高壓滅菌後溫度降至45r左右的其餘培養基成分中混勻，分裝於直徑9.5cm的培養皿中，2025ml/皿。步驟(3)所述20%SCV懸浮細胞是按下述方法製備得到吸取約5ml懸浮細胞於15ml刻度管中，靜置IO分鐘後，棄上清，將所得的細胞沉澱體積用不添加凝固劑Gelrite的體胚誘導培養基稀釋至5倍體積。為了更好地實現本發明，步驟(3)中經篩網過濾所得細胞團優選大小範圍為154pm900nm的細胞團。所述大蕉細胞接種量最佳為0.4ml20%SCV;巴西蕉細胞接種量最佳為1ml20%SCV。與現有技術相比，本發明具有如下優點和有益效果(1)在體胚誘導前採用預培養的方式降低香蕉胚性懸浮細胞外源2,4-D的含量，可促進懸浮細胞的體胚發生頻率。與文獻報導的不經預培養直接進行體胚誘導的方法相比，前者的體胚誘導率及其後的植株轉換率均比後者提高1倍左右(見表1)。(2)在體胚誘導前使用兩種不同孔徑的篩網對香蕉胚性懸浮細胞進行過濾篩選出大小及生長狀態較一致的細胞團，可在一定程度上實現體胚誘導的同步化，從而很大幅度上提高了懸浮細胞的體胚誘導頻率。實驗結果表明大小在154pm90(^m之間的大蕉細胞團的體胚誘導率比其餘兩種不同大小範圍的細胞團平均高出7.2倍，這在巴西蕉上取得的效果更顯著，平均可高出20.5倍(見表2)。(3)採用不同的細胞接種量進行香蕉體胚的誘導，結果表明大蕉細胞的接種量為0.4ml20%SCV、巴西蕉細胞的接種量為1ml20%SCV時可獲得最佳效果，比其餘接種量平均可高出2.8倍(見表2)。本實驗室在大蕉和巴西蕉以外的香蕉品種的試驗中也獲得了類似的效果，即體胚的誘導存在一個最佳的細胞接種量，不同的香蕉品種略有差異。(4)在體胚誘導初期於體胚誘導培養基上同時添加1mgL"ABA和5mgL"抗壞血酸，這在一定程度上防止了大蕉在體胚誘導期間培養物容易褐化的現象，同時可使大蕉和巴西蕉胚性懸浮細胞的體胚誘導率均提高1倍以上(見表3)。表1預培養對胚性懸浮細胞體胚誘導及植株轉換的影響tableseeoriginaldocumentpage7實驗重複3次，所得數據為平均值±標準誤差。表2細胞團大小及接種量對體胚誘導的影響tableseeoriginaldocumentpage7表3ABA和抗壞血酸對香蕉體胚誘導及培養物褐化程度的影響tableseeoriginaldocumentpage8實驗重複3次，所得數據為平均值±標準誤差。圖1為大蕉胚性細胞懸浮系的建立及其經體胚發生途徑再生植株的過程圖。圖2為巴西蕉胚性細胞懸浮系的建立及其經體胚發生途徑再生植株的過程圖。具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一歩詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。本發明所需各種培養基如下愈傷組織誘導培養基MS基本培養基(MumshigeandSkoog，1962)+4.5jimolL-1生物素+18pmolL.12，4-D+5.4)imolL.1NAA+5.7jamolL-1IAA+87mmorL'1蔗糖十7g'L"瓊月旨，pH5.8。M2液體培養基MS基本培養基+4.5iumol'L"2，4-D+4.1pmorL"生物素+680iimol'L'1穀氨醯胺+100mg'L麥芽提取物+130mmol'L"蔗糖，pH5.3。不含2,4-D的M2液體培養基MS基本培養基+4.1)iimol'L"生物素+680)imol'L"穀氨醯胺+100mg'L"麥芽提取物+130mmol'L"蔗糖，pH體胚誘導培養基SH(Schenk和Hildebrandtl972)大量和微量元素及其鐵鹽+MS維生素+4.5jamorL"生物素+680nmol'L"穀氨醯胺+2mmol'L"脯氨酸+100mg'L'1麥芽提取物十1.1)imol'L'1NAA+0.5pmolL"激動素+44嗎L"玉米素+29mmolL-1乳糖+UOmmol'L-1蔗糖+1mg丄-'ABA+5mg丄-'抗壞血酸+2g'L-1Gelrite，pH5.8。體胚萌發培養基MS大量元素和微量元素及其鐵鹽+MorelandWetmore維生素(Morel和Wetmore1951)+0.2famolL"6-BA+1.1pmol'L"IAA+87mmolL-'蔗糖+2gL"gelrite，pH5.8。MR生根壯苗培養基MS基本培養基+87mmol'L"蔗糖+0.1%活性炭十7g.L"瓊月旨，pH5.8。實施例1建立大蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(1)香蕉品種的選取。選用的品種為我國主栽品種之一、抗香蕉枯萎病4號生理小禾中的大蕉(MwsaABBparacfa/acaLirm.cv.DaJiao)。(2)大蕉胚性愈傷組織的誘導。於八月中旬取大蕉結果後的頂端花蕾，剝除外部苞片及雄花至離花序頂端46cm部分，用75%酒精消毒處理5min左右，無菌水洗滌3次。在無菌條件下，進--步剝除外圍花苞至11.5cm，以花蕾頂端分生組織為基準切取112梳未成熟的雄花序接種於愈傷組織誘導培養基上，於28土rC黑暗條件下培養56個月，期間視情況更新12次培養基；誘導出大蕉黃色小顆粒狀胚性愈傷組織。(3)均一穩定的大蕉胚性細胞懸浮系(ECS)的建立。挑取步驟(1)誘導出的黃色小顆粒狀胚性愈傷組織2克左右，轉入含30mlM2液體培養基的100mL錐形瓶中，置於28土rC，90110rpm搖床上黑暗培養。在培養的第一個月每周吸棄約2/3的舊培養液，用新鮮的M2液體培養基補充，同時用90(Him孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其後每2周更換一次培養基，繼代一個月後，用154]Lim孔徑篩網過濾去除較大的細胞團，繼續培養一月左右即可得較為分散、均質的大蕉胚性細胞懸浮系。(4)大蕉體細胞胚胎的誘導。在體胚誘導前先將大蕉胚性懸浮細胞轉入不含2，4-D的M2液體培養基中預培養7天，隨後經154)am孔徑篩網過濾，取過濾所得的小於154pm的細胞團，吸取0.2ml20%SCV(靜置10分鐘後所得的細胞沉澱體積)接種於含lmgl^'ABA和5mg'U'抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於28土rc黑暗中進行體胚的誘導。一個月後將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基繼續培養2月左右直至體胚發育成熟，得到成熟體胚；體胚誘導率約為380個/mlSCV。(5)大蕉體胚的萌發及植株再生。將步驟(4)誘導出的成熟體胚轉入萌發培養基中。萌發起始將培養物置於28土rC黑暗培養，待葉鞘抽出後，將其轉至MR生根壯苗培養基中於30pmolm'2S"光強(白色螢光燈)，16h/8h光周期條件下繼續培養一月左右，進一步發育成健壯的大蕉小植株；植株轉換率約為14%。實施例2建立大蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟-(1)香蕉品種的選取。選用的品種為抗香蕉枯萎病4號生理小種的大蕉(MwraABBparacfe/acaLinn.cv.DaJiao)。(2)大蕉胚性愈傷組織的誘導。同實施例1步驟(2)誘導出大蕉黃色小顆粒狀胚性愈傷組織。(3)均一穩定的大蕉胚性細胞懸浮系(ECS)的建立。挑取步驟(1)誘導出的胚性愈傷組織2克左右，轉入含30mlM2液體培養基的lOOmL錐形瓶中，置於28士rC，90110rpm搖床上黑暗培養。在培養的第--個月每周吸棄約2/3的舊培養液，用新鮮的M2液體培養基補充，同時用900pm孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其後每2周更換一次培養基，繼代一個半月後，用154pm孔徑篩網過濾去除較大的細胞團，繼續培養一月左右即可得較為分散、均質的大蕉胚性細胞懸浮系。(4)大蕉體細胞胚胎的誘導。在體胚誘導前先將大蕉胚性懸浮細胞轉入不含2，4-D的M2液體培養基中預培養8天，隨後依次經900)_im和154nm孔徑篩網過濾，取過濾所得的小於900pm且大於154lam的細胞團，吸取0.4ml20%SCV(靜置10分鐘後所得的細胞沉澱體積)接種於含lmg'L—1ABA和5mg'L/1抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於28土rc黑暗中進行體胚的誘導。一個月後將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基中繼續培養2月左右直至體胚發育成熟，得到成熟體胚；體胚誘導率約為2760個/mlSCV。(5)大蕉體胚的萌發及植株再生。同實施例1步驟(5)將大蕉成熟體胚發育成健壯的大蕉小植株；植株轉換率約為22%。實施例3建立大蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(1)香蕉品種的選取。選用的品種為抗香蕉枯萎病4號生理小種的大蕉(MwsaABB/araofe/acaLinn.cv.DaJiao)。(2)大蕉胚性愈傷組織的誘導。同實施例1步驟(2)誘導出大蕉黃色小顆粒狀胚性愈傷組織。(3)均一穩定的大蕉胚性細胞懸浮系(ECS)的建立。挑取步驟(1)誘導出的胚性愈傷組織2克左右，轉入含30mlM2液體培養基的100mL錐形瓶中，置於28土rC，90110rpm搖床上黑暗培養。在培養的第一個月每周吸棄約2/3的舊培養液，用新鮮的M2液體培養基補充，同時用900pm孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其後每2周更換一次培養基，繼代兩個月後，用154jim孔徑篩網過濾去除較大的細胞團，繼續培養一月左右即可得較為分散、均質的大蕉胚性細胞懸浮系。(4)大蕉體細胞胚胎的誘導。在體胚誘導前先將大蕉胚性懸浮細胞轉入不含2,4-D的M2液體培養基中預培養10天，隨後經900jam孔徑篩網過濾，取過濾所得的大於900jLim的細胞團，吸取2.0ml20%SCV(靜置10分鐘後所得的細胞沉澱體積)接種於含lmgL—1ABA和5mgL—'抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於28土rC黑暗中進行體胚的誘導。一個月後將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基中繼續培養2月左右直至體胚發育成熟，得到成熟體胚；體胚誘導率約為46個/mlSCV。(5)大蕉體胚的萌發及植株再生。同實施例1步驟(5)將大蕉成熟體胚發育成健壯的大蕉小植株；植株轉換率約為11%。如圖1所示為大蕉胚性細胞懸浮系的建立及其經體胚發生途徑再生植株的過程，其中A、誘導愈傷組織的大蕉未成熟雄花序外植體(bar=1.5mm);B、由大蕉未成熟雄花序誘導出的黃色顆粒狀胚性愈傷組織(bar=8mm);C、大蕉胚性愈傷組織的起始懸浮培養(bar-13mm);D、依次經卯Opim和154jiim孔徑篩網過濾後培養3個月以上所得的分散均質的大蕉胚性細胞懸浮系(bar^llmm);E、大蕉胚性懸浮細胞體胚的起始誘導(bar=15mm);F、在體胚誘導培養基上培養20天後獲得的球形胚(ba產6mm);G、更新體胚誘導培養基後繼續培養一月後所得的體胚(bar-17mm);H、培養三個月後的成熟體胚(bar=6mm);I、萌發中的體胚(bar=8mm);J、萌發體胚轉入MR培養基中一月後獲得的大蕉小植株(bar-12mm)。實施例4建立巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(1)香蕉品種的選取。選用的品種為我國目前栽培最廣泛且最受大眾歡迎的巴西蕉(MwsaAAACavendishcv.Baxi)。(2)巴西蕉胚性愈傷組織的誘導。於八月中旬取巴西蕉結果後的頂端花蕾，剝除外部苞片及雄花至離花序頂端46cm部分，用75%酒精消毒處理5min左右，無菌水洗滌3次。在無菌條件下，進一步剝除外圍花苞至11.5cm，以花蕾頂端分生組織為基準切取112梳未成熟的雄花序接種於愈傷組織誘導培養基上，於28土rC黑暗條件下培養56個月，期間視情況更新12次培養基。誘導出巴西蕉淺黃色小顆粒狀胚性愈傷組織。(3)均一穩定的巴西蕉胚性細胞懸浮系(ECS)的建立。挑取步驟(1)誘導出的淺黃色小顆粒狀胚性愈傷組織2克左右，轉入含30mlM2液體培養基的OOmL錐形瓶中，置於28土rC，卯110rpm搖床上黑暗培養。在培養的第一個月每周吸棄約2/3的舊培養液，用新鮮M2液體培養基補充，同時用900Hm孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其後每2周更換一次培養基，繼代一個月後，用154pm孔徑篩網過濾除去較大的細胞團，繼續培養一月左右即可得較為分散、均質的巴西蕉胚性細胞懸浮系。(4)巴西蕉體細胞胚胎的誘導。在體胚誘導前先將巴西蕉胚性懸浮細胞轉入不含2，4-D的M2培養基中預培養7天，隨後經154pm孔徑篩網過濾，取過濾所得的小於154|am的細胞團，吸取0.5ml20%SCV(靜置10分鐘後所得的細胞沉澱體積)接種於含lmgL—1ABA和5mgL"抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於28土rc黑暗中進行體胚的誘導。一個月後將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基中繼續培養2月左右直至體胚發育成熟，得到成熟體胚；體胚誘導率約為720個/mlSCV。(5)巴西蕉體胚的萌發及植株再生。將步驟(4)誘導的成熟體胚轉入萌發培養基中。萌發起始將培養物置於28土rC黑暗培養，待葉鞘抽出後，將其轉至MR生根壯苗培養基中於30)imolrn^s'1光強(白色螢光燈)，16h/8h光周期條件下繼續培養一月左右，進一步發育成健壯的巴西蕉小植株；植株轉換率約為24%。實施例5建立巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(1)香蕉品種的選取。選用的品種為巴西蕉(M^"AAACavendishcv.Baxi)。(2)巴西蕉胚性愈傷組織的誘導。同實施例4步驟(2)誘導出巴西蕉淺黃色小顆粒狀胚性愈傷組織。(3)均一穩定的巴西蕉胚性細胞懸浮系(ECS)的建立。挑取歩驟(1)誘導出的胚性愈傷組織2克左右，轉入含30mlM2液體培養基的100mL錐形瓶中，置於28土ir，90110rpm搖床上黑暗培養。在培養的第一'個月每周吸棄約2/3的舊培養液，用新鮮M2液體培養基補充，同時用900pm孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其後每2周更換一次培養基，繼代一個半月後，用154pm孔徑篩網過濾除去較大的細胞團，繼續培養一月左右即可得較為分散、均質的巴西蕉胚性細胞懸浮系。(4)巴西蕉體細胞胚胎的誘導。在體胚誘導前先將巴西蕉胚性懸浮細胞轉入不含2，4-D的M2培養基中預培養8天，隨後依次經900jLim和154|im孔徑篩網過濾，取過濾所得的小於900)um且大於154pim的細胞團，吸取1.0ml20%SCV(靜置10分鐘後所得的細胞沉澱體積)接種於含lmg'L—1ABA和5mg'L—1抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於28±1。C黑暗中進行體胚的誘導。一個月後將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基中繼續培養2月左右直至體胚發育成熟，得到成熟體胚;體胚誘導率約為28500個/mlSCV。(5)巴西蕉體胚的萌發及植株再生。同實施例4步驟(5)將巴西蕉成熟體胚發育成健壯的巴西蕉小植株；植株轉換率約為37%。實施例6建立巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(1)香蕉品種的選取。選用的品種為巴西蕉(M^aAAACavendishcv.Baxi)。(2)巴西蕉胚性愈傷組織的誘導。同實施例4步驟(2)誘導出巴西蕉淺黃色小顆粒狀胚性愈傷組織。(3)均-一穩定的巴西蕉胚性細胞懸浮系(ECS)的建立。挑取步驟(1)誘導出的胚性愈傷組織2克左右，轉入含30mlM2液體培養基的100mL錐形瓶中，置於28士rC，90110rpm搖床上黑暗培養。在培養的第一個月每周吸棄約2/3的舊培養液，用新鮮M2液體培養基補充，同時用900pm孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其後每2周更換一次培養基，繼代兩個月後，用154jiim孔徑篩網過濾除去較大的細胞團，繼續培養一月左右即可得較為分散、均質的巴西蕉胚性細胞懸浮系。(4)巴西蕉體細胞胚胎的誘導。在體胚誘導前先將巴西蕉胚性懸浮細胞轉入不含2,4-D的M2培養基中預培養10天，隨後經90(^m孔徑篩網過濾，取過濾所得的大於900pm的細胞團，吸取2.0ml20%SCV(靜置10分鐘後所得的細胞沉澱體積)接種於含lmgl^ABA和5mg'L/1抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於28土rC黑暗中進行體胚的誘導。一個月後將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基中繼續培養2月左右直至體胚發育成熟，得到成熟體胚；體胚誘導率約為930個/mlSCV。(5)巴西蕉體胚的萌發及植株再生。同實施例4步驟(5)將巴西蕉成熟體胚發育成健壯的巴西蕉小植株；植株轉換率約為19%。如圖2所示為巴西蕉胚性細胞懸浮系的建立及其經體胚發生途徑再生植株的過程，其中A、誘導愈傷組織的巴西蕉未成熟雄花序外植體(baFl.4mm);B、由巴西蕉未成熟雄花序誘導出的淺黃色顆粒狀胚性愈傷組織(bar=4.8mm);C、巴西蕉胚性愈傷組織懸浮培養3個月以上所得的分散均質的胚性細胞懸浮系(bar=12mm);D、巴西蕉胚性懸浮細胞在體胚誘導培養基上培養一月後所得的體胚(bar=15mm);E、培養三個月後的成熟體胚(bar=13mm);F、萌發中的體胚(bar-16mm);G、在MR培養基上培養一月後所得的巴西蕉小植株(bar=10mm)。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。權利要求1、一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)胚性愈傷組織的誘導分別以大蕉或巴西蕉1～12梳未成熟雄花序為外植體，接種於愈傷組織誘導培養基上誘導出胚性愈傷組織；(2)均一穩定的胚性細胞懸浮系的建立挑取步驟(1)誘導出的大蕉黃色小顆粒狀胚性愈傷組織或巴西蕉淺黃色小顆粒狀胚性愈傷組織，分別轉入M2液體培養基中，置於90～110rpm搖床上懸浮培養3～4個月即可得分散、均質的大蕉胚性細胞懸浮系或巴西蕉胚性細胞懸浮系；(3)體細胞胚胎的誘導在體胚誘導前先將上述胚性懸浮細胞轉入不含2，4-D的M2液體培養基中預培養7～10天，隨後經篩網過濾篩選出大小及生長狀態一致的細胞團，從細胞團中吸取0.2～2ml20％SCV即細胞接種量接種於含1mg·L-1ABA和5mg·L-1抗壞血酸的體胚誘導培養基中，置於28±1℃黑暗中進行體細胞胚胎的誘導；將誘導出的白色球形胚轉入去除ABA和抗壞血酸的體胚誘導培養基中繼續培養直至體胚發育成熟，得到成熟體胚；(4)體胚的萌發及其植株再生將步驟(3)誘導出的成熟體胚轉入體胚萌發培養基中；置於28±1℃黑暗培養，待葉鞘抽出後，將其轉至MR生根壯苗培養基中繼續培養，進一步發育成健壯的香蕉小植株。2、根據權利要求1所述的一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，其特徵在於所述不含2,4-D的M2液體培養基的組成為MS基本培養基+4.1nmoLL"生物素+680pmolL"穀氨醯胺+100mg'L"麥芽提取物+130mmolU'蔗糖，pH5.3，高溫高壓滅菌。3、根據權利要求1所述的一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，其特徵在於所述體胚誘導培養基的組成為SH大量和微量元素及其鐵鹽+MS維生素+4.5pmorL—1生物素+680pmorL"穀氨醯胺+2mmol'L-1脯氨酸+100mg'L"麥芽提取物十1.1nmol'L"NAA+0.5pmorL"激動素+44!ig'L"玉米素+29mmorL"乳糖+130mmol'L"蔗糖+1mg'L"ABA+5mg'U1抗壞血酸+2g'L"GeMte，其中ABA和抗壞血酸事先分別配置成10mg'ml"母液，過濾滅菌後添加到pH5.8、經高溫高壓滅菌後溫度降至45。C的其餘培養基成分中混勻，分裝於直徑9.5cm的培養皿中，2025ml/皿。4、根據權利要求1所述的一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，其特徵在於步驟(3)中所述20%SCV懸浮細胞是按下述方法製備得到吸取5ml懸浮細胞於15ml刻度管中，靜置10分鐘後，棄上清，將所得的細胞沉澱體積用不添加凝固劑Gelrite的體胚誘導培養基稀釋至5倍體積。5、根據權利要求1所述的一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，其特徵在於步驟(3)中所述經篩網過濾所得細胞團的大小範圍為154,900拜。6、根據權利要求1所述的一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，其特徵在於所述大蕉細胞的接種量為0.4ml20%SCV;巴西蕉細胞的接種量為1ml20%SCV。全文摘要本發明公開了一種建立大蕉和巴西蕉高效體細胞胚胎發生再生植株的方法。該方法在懸浮細胞體胚誘導前先用不含2，4-D的M2液體培養基預培養7～10天，經篩網過濾篩選出大小及生長狀態較一致的細胞團，接種於體胚誘導培養基上。預培養可使體胚誘導率及其後的植株轉換率均提高1倍左右；經篩網過濾所得大小範圍為154μm～900μm的細胞團其體胚誘導效果最佳；大蕉和巴西蕉細胞的最佳接種量分別為0.4ml20％SCV和1ml20％SCV。此外在體胚誘導初期於香蕉現有技術體胚誘導培養基上添加ABA和抗壞血酸，在一定程度上防止了大蕉在體胚誘導期間培養物容易褐化的現象，並可有效提高大蕉和巴西蕉胚性懸浮細胞的體胚發生頻率。文檔編號A01H4/00GK101180948SQ20071003256公開日2008年5月21日申請日期2007年12月14日優先權日2007年12月14日發明者戴雪梅,望肖,趙傑堂,霞黃,黃學林申請人:中山大學