Dna甲基化的檢測探針、檢測方法及檢測試劑盒的製作方法

2023-12-10 06:30:27 4

Dna甲基化的檢測探針、檢測方法及檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種DNA甲基化檢測探針、檢測方法及檢測試劑盒。該檢測探針包括能與甲基化DNA互補的3』端和5』端以及中間部分的用於引發HRCA反應的特異性序列。若待測DNA為甲基化DNA，則其能與檢測探針完全互補配對，在後續DNA連接酶的作用下，檢測探針的3』端和5』端連接形成環狀DNA；而非甲基化的DNA不能與檢測探針完全互補配對，沒有環狀DNA的形成。環狀DNA可以通過後續的HRCA反應及信號檢測定量分析待測DNA的甲基化程度，由於HRCA具有109倍信號放大能力，從而保證了檢測的超高靈敏度要求。且使用該探針，檢測過程中不需要使用昂貴的螢光標記的探針或進行PCR擴增，檢測的成本大大降低。此外，該檢測方法對甲基化DNA沒有酶切位點的要求，說明該方法有廣泛應用性。
【專利說明】DNA甲基化的檢測探針、檢測方法及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及ー種DNA甲基化的檢測探針、檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]隨著人類基因組計劃的完成，下ー個重要任務之一就是解密遺傳系統，即人體細胞在生長過程中是如何運用遺傳物質來決定某一特定基因在何時何地得到表達。DNA甲基化因其能影響基因表達的遺傳狀態，已成為表觀遺傳系統中的ー個重要部分。哺乳動物的DNA甲基化大多發生在CpG雙核苷酸中胞嘧啶上，即在胞嘧啶的嘧啶環上5號碳位置加入甲基。在正常細胞中，甲基化主要發生在重複的基因組區域，包括遺傳元件和衛星脫氧核苷酸，然而與基因啟動子和外顯子相關的CpG島嶼通常是沒有甲基化的。但是在這些區域上突變性的DNA甲基化能導致癌症抑制基因的轉錄沉默，這種突變性的DNA甲基化可以作為各種疾病包括癌症的標誌。CpG島嶼上特定區域的甲基化可能與特定類型的癌症相關。因此，人類基因組中任ー給定位置上DNA甲基化的準確定量對於人類癌症的早期治療是非常重要的。
[0003]傳統的已有多種用於分析單個CpG位置或短序列中DNA甲基化的檢測方法。甲基化特異性的PCR (MSP)開啟了將聚合酶鏈反應(PCR)用於甲基化分析的大門，但由於MSP的分析結果是通過觀察凝膠電泳的現象，導致MSP僅能提供實驗的定性分析而非定量分析。螢光標記實時監測PCR和甲基化特異性的量子點的螢光共振能量轉移(MSq-FRET)等方法都需要精密控溫的PCR儀，且一般需要使用螢光染料分子標記的探針，大大加重了實驗成本。結合亞硫酸鹽的限制性消化分析方法(COBRA)給定量且靈敏的DNA甲基化的檢測提供了另ー種選擇，但是COBRA的前提條件是分析樣品中要有甲基化敏感性的限制性消化酶的酶切位點。基於表面增強拉曼光譜法和單核苷酸擴增方法，由於較低的靈敏度導致應用受限。

【發明內容】

[0004]基於此，有必要提供一種靈敏度高、檢測成本低的DNA甲基化檢測探針及檢測方法。
[0005]ー種DNA甲基化檢測探針，包括其5』端和3』端用幹與甲基化DNA互補配對的序列以及中間部分的用於引發超分支滾環擴增反應的特異性序列，其中，檢測探針3』端的最後ー個鹼基為鳥嘌呤，所述鳥嘌呤與甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配對，且檢測探針3』端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3』端的序列反向互補配對，檢測探針5』端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的臨近脫氧核苷酸至5』端的序列反向互補配對。
[0006]在其中一個實施例中，所述檢測探針的DNA序列是SEQ ID NO:1。
[0007]具有SEQ ID NO:1基因序列的檢測探針可以應用在人類非小細胞肺癌細胞系基因組甲基化程度的檢測領域。
[0008]該DNA甲基化檢測探針，包括能與甲基化DNA互補的3』端和5』端以及中間部分的用於引發超分支滾環擴增(HRCA)反應的特異性序列，且檢測探針的3』端的最後ー個鹼基對應甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶，能特異性的與甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通過三個氫鍵的形成而互補配對。若待測DNA為甲基化DNA，則其能與檢測探針完全互補配對，且互補配對後導致檢測探針的3』端和5』端靠近，在後續DNA連接酶的作用下，檢測探針的3』端和5』端連接形成環狀DNA，從而不會被DNA外切酶III和I消化；而非甲基化的DNA經過亞硫酸氫鹽處理，胞嘧啶環上4號位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已經轉變成尿嘧啶，然而尿嘧啶不能與鳥嘌呤互補配對，非甲基化的DNA不能與檢測探針完全互補配對，沒有環狀DNA的形成，從而所有DNA都被DNA外切酶III和I消化。環狀DNA可以通過後續的HRCA反應及信號檢測定量分析待測DNA的甲基化程度，由於HRCA具有超高擴增能力(IO9倍信號放大)，從而保證了檢測的超高靈敏度要求。此外，使用該探針，檢測過程中不需要使用昂貴的螢光標記的探針或進行PCR擴增，檢測的成本大大降低。
[0009]ー種DNA甲基化的檢測方法，包括如下步驟:用亞硫酸氫鹽處理待測DNA，使所述待測DNA中未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶；向亞硫酸氫鹽處理後的待測DNA中加入上述檢測探針進行DNA融合反應；向融合反應得到的產物中加入DNA連接酶，進行連接反應；使用超分支滾環擴增方法擴增上步驟得到的產物並進行光譜信號檢測。
[0010]在其中一個實施例中，所述亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀。
[0011 ] 在其中一個實施例中，還包括在融合反應後向融合反應後得到的產物中加入DNA消化液，消化未完全互補配對的DNA序列的步驟。
[0012]在其中一個實施例中，所述進行光譜信號檢測是將超分支滾環擴增後的DNA產物與SYBR Green I螢光染料混合，在螢光光度計下檢測混合物的發射波強度。
`[0013]通過將待測DNA與鎖式探針融合，若待測DNA是甲基化DNA，則可以與鎖式探針在DNA連接酶的作用下形成環狀DNA，而非甲基化的DNA則不能與鎖式探針互補配對；通過HRCA擴增後，環狀DNA被大量擴增，從而能檢測到螢光強度，而沒有互補配對的序列則不能被擴增，從而使用上述檢測方法可以較為方便的分析待測DNA是否甲基化，且由於HRCA具有超高擴增能力，檢測的靈敏度得到保證，通過光譜分析，還具有定量的效果。檢測過程中不需要使用昂貴的螢光標記探針或進行PCR擴增，檢測的成本大大降低。且該檢測方法對甲基化DNA沒有酶切位點的要求，對於任ー給定位置的DNA甲基化程度檢測吋，只需改變該檢測探針的3』和5』端序列，使其與目標DNA序列互補，就能實現該位置DNA甲基化程度的檢測，說明該方法有廣泛應用性。
[0014]此外，還有必要提供一種靈敏度高、檢測成本低的用於人類非小細胞肺癌檢測的試劑盒。
[0015]一種人類非小細胞肺癌檢測試劑盒，包括檢測探針，所述檢測探針的DNA序列是SEQ ID NO:1。
[0016]在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括超分支滾環擴增引物，所述超分支滾環擴增的正向引物的DNA序列和反向引物的DNA序列分別為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0017]上述檢測試劑盒中，檢測探針具有能與人類非小細胞肺癌細胞系(H157)的甲基化DNA互補配對的3』端(13個鹼基)和5』端(21個鹼基)以及為引發HRCA反應的兩個特異性序列(序列長度分別為25個和23個)，且檢測探針的3』端的最後ー個鹼基被設定為鳥嘌呤，能特異性的甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通過三個氫鍵的形成而互補配對；若待測個體的細胞中該位置DNA有甲基化，則其能與檢測探針互補配對，並導致檢測探針的3』端和5』端靠近，在後續DNA連接酶的作用下，檢測探針的3』端和5』端連接形成環狀DNA ;而非甲基化的DNA經過亞硫酸氫鹽處理，胞嘧啶環上4號位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已經轉變成尿嘧啶，然而尿嘧啶並不能與鳥嘌呤互補配對，從而非甲基化的DNA不能與檢測探針互補配對，也沒有環狀DNA的形成。環狀DNA再通過HRCA反應擴增，在擴增引物的存在下，引物的延伸和鏈置換不斷發生，得到大量的長度不同的雙鏈DNA產物，而這些產物通過螢光染料然後可以進行光譜定量檢測出。由於HRCA具有超高擴增能力，檢測的靈敏度得到保證，通過光譜分析，還具有定量的效果。檢測過程中不需要使用昂貴的螢光標記探針或進行PCR擴增，檢測的成本大大降低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為甲基化DNA與檢測探針的完全互補配對示意圖；
[0019]圖2為非甲基化的DNA與檢測探針的部分互補配對示意圖；
[0020]圖3為ー實施方式的DNA甲基化的檢測流程圖；
[0021]圖4為實施例1的檢測流程示意圖；
[0022]圖5為連接反應的電泳驗證圖，變性的10%的聚丙烯胺按凝膠電泳用標準銀染的結果圖，跑道M是DNA標誌，道1，2，3分別表示空白實驗，IOnM未甲基化DNA和IOnM甲基化DNA的連接產物；
[0023]圖6為為消化產物的電泳驗證圖，條件與圖5中相同；
[0024]圖7為實施例1中HRCA實驗的條件優化，InM的甲基化DNA (虛線柱)和InM的未甲基化DNA (實線柱)隨著引物濃度的變化得到的螢光強度變化圖；
[0025]圖8為實施例1中HRCA實驗的條件優化，InM的甲基化DNA (虛線柱)和InM的未甲基化DNA (實線柱)隨著dNTPs濃度的變化得到的螢光強度變化圖；
[0026]圖9為擴增反應的電泳驗證圖，使用的是SYBR Green I的瓊脂糖凝膠電泳法，跑道與圖5中表示的一致；
[0027]圖10為不同濃度的甲基化DNA的螢光檢測強度圖；
[0028]圖11為甲基化DNA的濃度與螢光強度的指數線性圖，線性範圍:lfmol/L到10pmol/L ；
[0029]圖12為不同甲基化含量水平的螢光檢測結果圖；
[0030]圖13為測量得到的甲基化含量水平與實際放入的甲基化含量水平的關係圖；
[0031]圖14為不同濃度的H157 (虛線柱)和H209 (實線柱)的基因組DNA與其螢光檢測值的關係圖；
[0032]圖15為IOnM甲基化DNA (M)和未甲基化DNA (U)的螢光檢測值。
【具體實施方式】
[0033]下面結合附圖及具體實施例對DNA甲基化檢測探針、檢測方法及檢測試劑盒進行進ー步的說明。[0034]ー實施方式的DNA甲基化檢測探針包括5』端和3』端的用幹與甲基化DNA互補配對的序列以及中間部分的用於引發超分支滾環擴增反應的特異性序列，其中，檢測探針3』端的最後ー個鹼基為鳥嘌呤，與甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配對，且檢測探針3』端的序列與甲基化DNA的自中部甲基化胞嘧啶至3』端的序列反向互補配對，檢測探針5』端的序列與甲基化DNA的自中部甲基化胞嘧啶的臨近脫氧核苷酸至另5』端的序列反向互補配對。
[0035]該DNA甲基化檢測探針3』端的最後ー個鹼基對應甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶，能特異性的與甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通過三個氫鍵的形成而互補配對。如圖1所示，若待測DNA為甲基化DNA，則其能與檢測探針完全互補配對，且互補配對後導致檢測探針的3』端和5』端靠近，在後續DNA連接酶的作用下，檢測探針的3』端和5』端連接形成環狀DNA，不會被消化液消化。如圖2所示，非甲基化的DNA經過亞硫酸氫鹽處理，胞嘧啶環上4號位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已經轉變成尿嘧啶，然而尿嘧啶不能與鳥嘌呤互補配對，非甲基化的DNA不能與檢測探針完全互補配對，沒有環狀DNA的形成，從而所有DNA都被DNA外切酶III和I消化。
[0036]環狀DNA可以通過後續的HRCA反應及信號檢測定量分析待測DNA的甲基化程度，由於HRCA具有超高擴增能力(IO9倍信號放大)，從而保證了檢測的超高靈敏度要求。且該檢測探針能與眾多甲基化的DNA融合，兼容性好。此外，使用該探針，檢測過程中不需要使用昂貴的螢光標記的探針或進行PCR擴增，檢測的成本大大降低。
[0037]此外，本實施方式還提供了ー種DNA甲基化的檢測方法，如圖3所示，包括如下步驟:
[0038]步驟S310，用亞硫酸氫鹽處理待測DNA，使待測DNA中未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶。
[0039]亞硫酸氫鹽為亞硫酸·氫鈉或亞硫酸氫鉀等。
[0040]未甲基化的胞嘧啶被亞硫酸氫鹽轉化尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶則不能被轉化。
[0041]步驟S320，向亞硫酸氫鹽處理後的待測DNA中加入上述介紹的檢測探針進行DNA
融合反應。
[0042]鎖式探針(Padlock probe)是ー種較長的單鏈寡核苷酸片段，兩個末端和目標毗鄰互補，中間的一段連接序列對檢測結果沒有影響，可以作為通用引物的結合位點。從而鎖式探針與DNA融合後，探針的兩端毗鄰接近，在後續DNA連接酶的作用下，可以連接起來形成環狀DNA。在本實施方式中，鎖式探針即為上述DNA甲基化檢測探針。
[0043]步驟S330，向融合反應後得到的產物中加入DNA連接酶，進行連接反應。若待測DNA是甲基化DNA，則可以與鎖式探針在DNA連接酶的作用下形成環狀DNA ;而非甲基化的DNA則不能與鎖式探針完全互補配對，沒有環狀DNA的形成。
[0044]步驟S340，向經消化處理得到的產物中加入DNA消化液，消化未完全互補配對的DNA序列，從而得到純化的環狀DNA。進行消化步驟主要是為了減少非連接DNA導致的擴增，以減少後續檢測假陽性或其他DNA對實驗結果的幹擾。可以理解，在其他實施方式中，此步驟可以省略。步驟S350，使用超分支滾環擴增方法擴增上步驟得到的產物並進行光譜信號檢測。
[0045]環狀DNA可以通過後續的HRCA反應及信號檢測定量分析待測DNA的甲基化程度，由於HRCA具有超高擴增能力(1O9倍信號放大)，從而保證了檢測的超高靈敏度要求。
[0046]在本實施方式中，進行信號檢測是將超分支滾環擴增後的DNA產物與SYBR GreenI螢光染料混合，在螢光光度計下檢測混合物的發射波強度。
[0047]上述檢測方法可以較為方便的分析待測DNA是否甲基化，且由於HRCA具有超高擴增能力，檢測的靈敏度得到保證，通過光譜分析，還具有定量的效果。檢測過程中不需要使用昂貴的螢光標記探針或進行PCR擴增，檢測的成本大大降低。
[0048]進ー步，本實施方式還提供了一種人類非小細胞肺癌檢測試劑盒，其包括檢測探針，檢測探針的DNA序列是SEQ ID NO:1。該探針用於檢測人類非小細胞中DNA序列為SEQID NO: 2的甲基化DNA。
[0049]此外，該檢測試劑盒還包括超分支滾環擴增引物，超分支滾環擴增引物的DNA序列分別為序列表中的SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0050]該檢測試劑盒中的檢測探針具有能與人類非小細胞肺癌細胞系(H157)的甲基化DNA互補配對的3』端(13個鹼基)和5』端(21個鹼基)以及為引發HRCA反應的兩個特異性序列(序列長度分別為25個和23個)，且檢測探針的3』端的最後ー個鹼基被設定為鳥嘌呤，能特異性的甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通過三個氫鍵的形成而互補配對；若待測個體的細胞中該位置DNA有甲基化，則其能與檢測探針互補配對，並導致檢測探針的3』端和5』端靠近，在後續DNA連接酶的作用下，檢測探針的3』端和5』端連接形成環狀DNA ;而非甲基化的DNA經過亞硫酸氫鹽處理，胞嘧啶環上4號位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已經轉變成尿嘧啶，然而尿嘧啶並不能與鳥嘌呤互補配對，從而非甲基化的DNA不能與檢測探針完全互補配對，也沒有環狀DNA的形成。
[0051]以下結合具體實施例驗證上述檢測探針及檢測方法的可行性
[0052]實施例1
[0053]H157 (人類非小細胞肺癌細胞系)及H209 (人類小細胞肺癌細胞系)細胞系的甲基化DNA檢測,如圖4所示。
[0054]1、DNA提取及消化
[0055]1.1分別培養H157和H209兩種細胞系。正常的H157細胞系中pl6啟動子區域是高度甲基化的，而正常的H209細胞系中的這些區域是沒有甲基化的。
[0056]培養條件:將兩種細胞系分別置於含有10%牛血清白蛋白的DMEM培養液中，放置在加溼處理的含有5% 二氧化碳的37 °C培養箱中培養。
[0057]1.2 提取 DNA
[0058]用DNA提取試劑盒分別提取上述兩種細胞系的基因組DNA，並採用分光光度計檢測該DNA提取溶液在260納米處的吸收值，換算出DNA濃度。 [0059]1.3用Pst I和BstE II兩種限制性消化酶分別處理提取的DNA，以消化基因組DNA為較短的鹼基片段，得到待測DNA。
[0060]在其他實施例中，細胞系中DNA的提取這個步驟可以省略，採用直接購買的方式獲得甲基化的DNA和未甲基化的DNA。
[0061]2、亞硫酸氫鈉處理待測DNA，使所述待測DNA中未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶。
[0062]處理條件為:1μ g待測DNA中加入至20μ L體積的濃度為0.35mol/L的氫氧化鈉溶液中，37°C反應20分鐘後，將一定體積的的亞硫酸氫鈉溶液和對苯二酚加至上述溶液中使其終濃度分別為3.2mol/L和0.5mmOl/L，50°C反應16-18小時，然後使溶液過脫鹽柱，回收DNA ;向回收的DNA中加入一定體積的氫氧化鈉溶液，使其在50ii L的溶液中終濃度為
0.3mol/L，37°C反應15分鐘，然後用醋酸氨將該溶液完全中和，最後在こ醇中沉澱，乾燥得到DNA粉末。將得到的DNA粉末溶於超純水中，於-20V保存備用。
[0063]3、連接反應
[0064]3.1根據待測DNA的序列設計鎖式探針
[0065]在本實施例中，待測DNA的序列分別如下:
[0066]甲基化DNA 序列為:GAG GGT GGG GmCG GAC mCGmC GTG mCGC TmCGGmCG GCT G (SEQID NO:2)，其中，mC表示甲基化的胞嘧啶；
[0067]未甲基化DNA 序列為:GAG GGT GGG GCG GAC CGC GTG CGC TCGGCG GCT G (SEQID NO:5)。
[0068]設計的鎖式探針的序列:CACGCG ATC CGC CCC ACC CTC ATT AGG TTACTG CGA TTAGCA CAA GCA CCA AGA GCA ACT ACA CGA ATT CCA ACCGCC GAA CG (SEQ ID NO:1)。
[0069]在本實施例中，為了增強檢測的特異性，在鎖式探針的序列上做了特別設計:鎖式探針的總長為83個鹼基，與甲基化DNA互補配對的5』端有21個鹼基，3』端有13個鹼基，中間成環部分49個鹼基，這種兩端互補配對的不對稱序列結構，將有利於目的基因與鎖式探針的結合；其次，鎖式探針的3』端的最後ー個鹼基被設定為鳥嘌呤，特異性與甲基化DNA的甲基化胞嘧啶通過三個氫鍵的形成而互補配對，而未甲基化DNA通過亞硫酸氫鈉的處理，胞嘧啶環上4號位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已經轉變成尿嘧啶，不能與鳥嘌呤互補配對。`
[0070]在其他實施例中，鎖式探針可以採用其他合理的設計方案，例如5』端的用於互補配對的序列長度不限於21bp，3』端的用於互補配對的序列長度也不限於13bp。鎖式探針的設計只要滿足實驗要求即可。即確保鎖式探針5』和3』端的序列分別與目的甲基化DNA的5』和3』的序列反向互補配對。
[0071]3.2連接反應的條件
[0072]將不同濃度的2L待測DNA與2L的lmol/L的鎖式探針混合，製備20L的混合液，混合液中含有:20mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)緩衝液，25mmol/L醋酸鉀，10mmol/L醋酸鎂，lmmol/L的煙醯胺腺苷二核苷酸和0.l%Triton X-100。95°C反應5分鐘，然後加入12單位的Taq DNA連接酶，65 °C反應60分鐘。
[0073]用亞硫酸氫鹽處理待測DNA後，未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不發生變化，在連接反應中，甲基化的DNA能與鎖式探針的兩端完全互補配對，使鎖式探針的3』端和5』端靠近，在連接酶的作用下，鎖式探針的3』端和5』端連接起來，形成環狀鎖式探針。未甲基化的DNA由於序列有了重大區別，不能與鎖式探針完全互補配對，因此3』端和5』端不能被連接酶連接起來，從而甲基化DNA與未甲基化DNA可以由此區分，由於鎖式探針的環化連接特異性強，因此這種利用鎖式探針的環化連接用於甲基化檢測的方法具有高特異性。
[0074]3.3連接反應產物的驗證
[0075]為了證明該方法的可行性，在本實施方式中，選用電泳實驗來驗證，如圖5所示，圖5為連接反應產物的標準銀染的變性的10%的聚丙烯醯胺凝膠電泳圖，跑道M是DNA標誌，泳道1、2、3分別表示空白實驗、IOnM未甲基化DNA和IOnM甲基化DNA的連接產物。由於線性鎖式探針比環狀鎖式探針跑得快，電泳圖證明連接反應產物的存在，方法可行。
[0076]4、消化反應
[0077]4.1消化反應的條件
[0078]取IOL連接反應後的溶液與IOL消化液混合，37°C反應2小時，最後在95°C 10分鐘失活。IOL消化液中含有lmmol/L的DTT，6.7mmol/L的氯化鎂，67mmol/L的pH 9.5的甘氨酸-氫氧化鉀緩衝液，10單位的DNA外切酶I和外切酶III。
[0079]DNA外切酶1和外切酶III能消化非環狀DNA，但不能消化環狀DNA，從而得到純的環狀鎖式探針。在本實施例中，非環狀DNA指的是甲基化DNA、未甲基化DNA及未發生連接反應的鎖式探針。
[0080]4.2消化反應產物的驗證
[0081]在本實施例中，選用電泳實驗來驗證，如圖6所示是消化反應產物通過標準銀染的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳圖，從圖6看到，所有非環狀DNA均被消化乾淨(圖6中跑道I和2)，除了環狀鎖式探針(圖6中跑道3)。環狀鎖式探針的存在進ー步證明了連接反應的可行性，同時為了減少後面的擴增反應中非連接特異性擴增的發生，進ー步提高特異性，外切酶的消化作用非常重要。
[0082]5、超分支滾環擴增反應
[0083]5.1根據鎖式探針設計兩條引物
[0084]引物I 序列(正向引物)為:3』CTT GTG CTA ATC GCA GTA ACC TAA T 5』 (SEQ IDNO:3)；
[0085]引物2 序列(反向引物)為:3，ACC AAG AGC AAC TAC ACG AAT TC 5，(SEQ ID NO:4)。
[0086]5.2超分支滾環擴增反應的條件
[0087]將IOL的消化反應產物與20L擴增溶液混合，63V反應I小吋。擴增溶液中含有:
0.05umol/L的引物I和引物2，400iimol/L的脫氧核苷三磷酸混合液和8個單位的Bst
DNA聚合酶。
[0088]如圖7，隨著兩引物的濃度由lymol/L到0.05iimol/L的降低，甲基化基因與未甲基化基因的螢光強度的差值逐漸増大，因此，本實施例選定0.05 u mol/L為兩種引物的最優濃度，因為較高濃度的引物，將會引起引物自身的二聚和非特異性的擴增。另外，如圖8所示，隨著dNTPs底物濃度由2 u mol/L到400 u mol/L的增加，甲基化基因與未甲基化基因的螢光強度的差值逐漸増大，因此本實施例選用400 u mol/L為dNTPs底物的最佳濃度。
[0089]5.3超分支滾環擴增反應產物的驗證
[0090]在本實施例中，選用電泳實驗來驗證，如圖9所示是超分支滾環擴增反應產物以SYBR Green I為染料的瓊脂糖凝膠電泳圖，從圖9中跑道3可以看到，甲基化基因能通過環化鎖式探針進而擴增得到大量的DNA產物，而空白實驗(圖9中跑道I)和未甲基化DNA (圖9中跑道2)不能擴增，因而得不到產物。
[0091]6、檢測
[0092]6.1檢測條件
[0093]將30 ii L超分支滾環擴增反應後的溶液和IuLW SYBR Green I (20倍)混合，加去離子水至100 uし室溫孵育10分鐘，後用螢光光度計檢測該溶液，螢光檢測條件:激發光波長為488納米，光譜採集範圍為500-650納米，在520納米處計量其發射波強度。
[0094]6.2檢測結果
[0095]DNA甲基化的高靈敏度的準確定量對於癌症的早期治療是非常重要的。為了證明該方法的高靈敏性，本實施例研究了不同濃度的甲基化基因的螢光檢測結果。如圖10所示，隨著甲基化基因濃度的増大，其螢光檢測值也増大，且濃度與信號強度值成指數關係，即濃度的對數值與信號強度值成線性關係(如圖11)，且線性關係覆蓋4個數量級，由IfmoI/L到IOpmoI/L0線性關係式為=If = 34.54+102.981oglOC，其中If為螢光信號強度值，C為甲基化基因的濃度(費摩爾每升)。用此方程分析空白值加上3倍偏差值的螢光強度得到檢測限為0.8費摩爾每升。這個檢測限值比用金納米的比色方法高出8個數量級，比用單鹼基擴增的拉曼增強光譜得到的高3個數量級。 [0096]此外，本實施例還將甲基化基因與未甲基化基因以ー定比例混合得到的人工混合液，並對其甲基化程度做了檢測。如圖12，隨著甲基化程度的増加，得到的螢光強度值也跟著増大。且如圖13顯示，檢測得到的甲基化程度與實際加入的甲基化程度幾乎吻合。並且，該方法能成功檢測混合樣品中0.01%的甲基化基，明顯比下列方法得到的解析度高:MALD1-MS質譜(5%)，基於量子點的螢光能量轉移(1%)，陽離子共軛聚合電解質方法(1%)，甲基化特異的PCR (0.1%)，甚至可以和MS-qFRET (0.01%)相比。
[0097]在本實施例中，為了進一步驗證上述檢測方法的可靠性，對實際樣品進行檢測。用此方法考察了非小細胞肺癌細胞系H157和小細胞肺癌細胞系H209中pl6啟動子區域片段中的六個CpG島嶼的甲基化情況。用本分析方法檢測細胞系的實際樣品時，本實施例在實驗之前用限制性消化酶處理了基因組DNA，目的是為了防止在隨後的試驗中DNA的形成的超螺旋或超環化等二級結構。如圖14所示，隨著基因組DNA的量的增加,檢測H157得到的螢光強度隨之増大，而H209則保持不變，且H157的檢測限為2ng。由此表明，本專利中的檢測方法能較高靈敏度的檢測肺癌細胞系中DNA甲基化的情況。
[0098]實施例2
[0099]特異性檢測甲基化基因
[0100]早前的研究表明，pl6中的癌症抑制基因的甲基化將導致多種癌症。為了證明該方法的可行性，本實施例合成了一段DNA,序列與pl6中的一段癌症基因相同,序列為:GAGGGT GGG GmCG GAC mCGmC GTGmCGC TmCG GmCG GCTG (SEQ ID NO:2)，並對這段 DNA 的甲基化做了檢測。如圖15所示，由IOnM甲基化DNA得到的螢光強度值為698.8±25.3，比由IOnM未甲基化DNA得到的螢光強度值(30.2±5.5)高了 23倍，說明該方法能成功用於甲基化DNA的檢測。
[0101]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。
【權利要求】
1.ー種DNA甲基化檢測探針，其特徵在於，包括5』端和3』端的用幹與甲基化DNA互補配對的序列以及中間部分的用於引發超分支滾環擴增反應的特異性序列，其中，檢測探針3』端的最後ー個鹼基為鳥嘌呤，所述鳥嘌呤與甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配對，且檢測探針3』端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3』端的序列反向互補配對，檢測探針5』端的序列與甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的臨近脫氧核苷酸至5』端的序列反向互補配對。
2.根據權利要求1所述的DNA甲基化檢測探針，其特徵在於，所述檢測探針的DNA序列是 SEQ ID NO:1。
3.ー種DNA序列為SEQ ID NO:1的檢測探針在檢測人類非小細胞肺癌細胞系基因組甲基化程度中的應用。
4.ー種DNA甲基化的檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟: 用亞硫酸氫鹽處理待測DNA，使所述待測DNA中未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶； 向亞硫酸氫鹽處理後的待測DNA中加入如權利要求1所述的檢測探針進行DNA融合反應； 向融合反應得到的產物中加入DNA連接酶，進行連接反應； 使用超分支滾環擴增方法擴增上步驟得到的產物並進行光譜信號檢測。
5.根據權利要求4所述的DNA甲基化檢測方法，其特徵在於，所述亞硫酸氫鹽為亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀。
6.根據權利要求4所述的DNA甲基化的檢測方法，其特徵在於，還包括在融合反應後向融合反應後得到的產物中加入DNA消化液，消化未完全互補配對的DNA序列的步驟。
7.根據權利要求4所述的DNA甲基化檢測方法，其特徵在於，所述進行光譜信號檢測是將超分支滾環擴增後的DNA產物與SYBR Green I螢光染料混合，在螢光光度計下檢測混合物的發射波強度。
8.一種人類非小細胞肺癌檢測試劑盒，其特徵在幹，包括檢測探針，所述檢測探針的DNA 序列是 SEQ ID NO:1。
9.根據 權利要求8所述的人類非小細胞肺癌檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括超分支滾環擴增引物，所述超分支滾環擴增的正向引物的DNA序列和反向引物的DNA序列分別為 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589777SQ201210288700
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年8月14日 優先權日:2012年8月14日
【發明者】張春陽, 曹岸萍 申請人:中國科學院深圳先進技術研究院