抗血管生成藥劑及使用這種藥劑的方法

2023-12-10 07:30:17

專利名稱：抗血管生成藥劑及使用這種藥劑的方法
技術領域：
本公開內容涉及抑制或預防血管生成從而控制或治療依賴血管生成的疾病,該疾病以血管增生或以依賴於血管增生為特徵。本公開內容還涉及抗血管生成藥劑與化學治療劑的聯合應用。
背景技術：
血管生成是從已有毛細血管形成新血管的過程，血管生成包括源自內皮祖細胞的血管生長。血管生成是一個由促血管生成分子和抗血管生成分子之間平衡調節的聯合過程。血管生成的刺激(如缺氧或炎症細胞因子)導致血管生成生長因子，如血管內皮生長因子(VEGF)或成纖維細胞生長因子(FGF)的誘導表達和釋放。這些生長因子刺激已存在的脈管系統中的內皮細胞(EC)增生並從組織中遷移出來形成新的內皮通路。血管生成包括內皮細胞增殖。粥樣硬化斑塊生長、糖尿病性視網膜病、退化性黃斑病、晶狀體後纖維組織增生症、特發性肺纖維變性、急性成人呼吸窘迫症候群以及哮喘均與不適當或病理性的血管生成相關。此外，腫瘤進展與新血管形成相關聯，新血管形成提供了一種結構向持續生長的腫瘤組織輸送營養。儘管遠在30多年前就首先提有提議以血液供給為靶點來減緩甚至中止癌症的進展，直到最近血管生成抑制劑才進入癌症治療的主流。因此，本領域對減少病理性血管生成的方法和藥劑有著持續的需求。本公開內容的目的正是為了滿足這一需求。


圖1A為抗血管生成的示意圖，顯示了該蛋白中反平行摺疊的兩段短鏈。圖1B是抗血管生成的另一示意圖，顯示了該蛋白中反平行β_摺疊的兩段短鏈，其中疏水面朝外。圖1C為抗血管生成的另一示意圖，顯示了該蛋白中反平行摺疊的兩段短鏈，其中疏水面朝內。圖2為摺疊(上)及非摺疊(下)的抗血管生成的藥劑和宿主蛋白的核磁共振(NMR)
-1'TfeP曰。圖3A顯示抗血管生成藥劑和本領域現有藥劑(Anginex)相比對HUVEC細胞的增殖分析。圖3B顯示抗血管生成藥劑和本領域現有藥劑(Anginex)相比對M4A4癌症細胞的增殖分析。
圖4A圖示在使用抗血管生成藥劑開始治療後8天的治療的療程裡，腫瘤體積保持相對不變。圖4B圖示在使用抗血管生成藥劑開始治療後22天的治療的療程裡，腫瘤體積保持相對不變。圖5圖示了首次使用抗血管生成藥劑治療結束時腫瘤重量有著顯著的差異。圖6以圖片方式展示用緩衝液和宿主蛋白治療的小鼠腫瘤以正常的速率生長，而用抗血管生成藥劑治療的小鼠腫瘤生長速度則顯著緩慢。圖7顯示了用抗血管生成藥劑治療小鼠的血管密度試驗結果。圖8顯示任一治療組的小鼠體重沒有顯著變化。
圖9顯示細胞存活力可隨劑量而變。圖10顯示了使用不同劑量的抗血管生成藥劑治療14天或以上的腫瘤生長曲線。
圖11為Avastin*和rProAgio-PEG的腫瘤生長曲線。圖12圖示了 14天療程結束時的腫瘤重量。定義為幫助理解本文所使用的特定術語，本文作如下定義。「血管生成」定義為已有血管床的任何改變或有助於組織灌注的新脈管系統形成。它包括內皮細胞從已存在血管萌牙而成的新脈管或已有脈管改變大小、成熟方向或流動屬性從而改善組織血流灌注的重構。術語「胺基酸」指天然存在的胺基酸或非天然胺基酸，也指以與天然胺基酸相似的方式發揮功能的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然編碼的胺基酸為20種常見的胺基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)及吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸。胺基酸類似物指基本化學結構與天然存在的胺基酸相同的化合物，例如其α-碳與氫、羧基、氨基和R基結合。此類類似物可具有修飾過的R基團(如正亮氨酸)或是修飾過的肽鏈骨架，但仍保持其基本化學結構與天然存在的胺基酸相同。非限制性的胺基酸類似物實例包括高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞碸和甲硫蛋氨酸。術語「保守修飾變體」同時適用於天然和非天然胺基酸、天然和非天然核酸序列，以及它們的組合。對於特定的核酸序列來說，「保守修飾變體」指編碼相同或基本相同的天然及非天然胺基酸序列的那些天然和非天然核酸，或不編碼基本相同序列的天然和非天然核酸序列的天然和非天然核酸。例如，由於遺傳密碼的簡變性，大量功能相同的核酸可編碼任意特定的蛋白質。比如密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在密碼子指定為丙氨酸的每一個位點，密碼子可以變成相應密碼子的任一簡變密碼子而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異為「沉默變異」，屬於保守修飾變異的一種。同樣舉例來說，本文所述的編碼天然或非天然多肽的每一天然或非天然核酸序列也描述了該天然或非天然核酸的每一可能沉默變異。技術人員將認識到可以將天然或非天然核酸的每一密碼子(AUG和TGG除外，通常AUG是蛋氨酸的唯一密碼子，TGG是色氨酸的唯一密碼子)加以修飾得到功能完全相同的分子。因此，編碼天然和非天然多肽的天然和非天然核酸其每一沉默變異也隱含於所述各序列中。本文所用的術語「有效量」指所給藥的藥劑或化合物的量足以使所治療的不適或疾病的一個或多個症狀得到一定程序的緩解。其結果可以是疾病信號、症狀或病因的減少及/或緩解，或是生物系統的任何其它期望的改變。舉例來說，所給藥的藥劑或化合物包括但不限於天然胺基酸多肽、非天然胺基酸多肽、修飾過的天然胺基酸多肽或修飾過的非胺基酸多肽。含有這些天然胺基酸多肽、非天然胺基酸多肽、修飾過的天然胺基酸多肽或修飾過的非天然胺基酸多肽的組合物可以給藥用於預防、增強及/或治療性的處理。任一個體病例的適當「有效」量可以用技術，如劑量升級(爬坡)試驗加以確定。本文所用術語「核酸序列」指構成核酸的核苷酸順序和標識。「核酸」指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈或雙鏈形態的聚合體。本術語包括含有已知核苷酸類似物或已修飾的骨架殘基或連鎖的核酸，其可以是合成而得，也可是天然存在或非天然存在，結合特性與參照核酸相似，代謝方式也與參照核酸相似。這樣的類似物實例包括但不限於硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸鹽、手性甲基磷酸酸鹽、2-0-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNAs )。除非另外特指，特定的核酸序列也隱含了其保守修飾變體(如簡變密碼子置換體) 和互補序列，以及明確指明的序列。具體來說，簡變密碼子置換體可以由一個或多個指定或全部密碼子的第三個位點被混合鹼基及/或脫氧次黃苷殘基取代而來生成序列而得。術語核酸可以與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。特定的核酸序列也隱含了 「剪接變體」。類似地，核酸編碼的特定的蛋白也隱含了該核酸剪接變體所編碼的任意蛋白質。正如其字面所提示的那樣，「剪接變體」是基因替代剪接的產物。經過轉錄後，初始核酸轉錄本可被剪接成不同(替代)的核酸剪接產物來編碼不同的多肽。剪接變體產生的機制各式各樣，其中包括了外顯子的替代剪接。此定義也包括了連讀轉錄而得的源自同一核酸的替代多肽。此定義也包括剪接反應的任意產物，包括剪接產物的重組型。本文中術語「多肽」、「肽」和「蛋白」可以互換使用，指代胺基酸殘基的聚合體。此術語適用於一個或多個胺基酸殘基為相應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物的胺基酸聚合體，也適用於天然存在的胺基酸聚合體及非天然存在的胺基酸聚合體。本文所用術語「藥學可接受」指的是不防礙化合物的生物學活性或屬性並且相對無毒性的材料，包括但不限於鹽、載體或稀釋劑，即該材料可以給藥於個體而不會產生不期望的生物學效應，或不與組合物中所含的任意組分產生有害的相互作用。本文所用術語「預防有效量」指的是含有至少一種非天然胺基酸多肽或至少一種已修飾非天然胺基酸多肽的組合物預防性地給藥於患者的用量，該用量將可以使所治療的疾病、不適或病症中一個或多個症狀得到一定程度的緩解。在諸如此類的預防性應用中，這樣的用量可能取決於患者的健康狀態、重量等等。本領域的技術人員可用常規的試驗，包括但不限於劑量升級臨床試驗來確定這樣的預防有效量。兩個核酸或多肽語境中的短語「基本相似」指兩個或多個序列或亞序列，當採用諸如下文實例中所述的序列對比算法或目檢方法測定，而按照最大對應性來比較和對齊時，它們之間具有至少75%、優選至少85%、更優選至少90%、95%或更多或任意整數值的核苷酸或胺基酸殘基同一性。優選的是，實質性同一性存在所比較序列的至少10個、優選約20個、更優選約40飛0個長度或任意整數的殘基的序列區域，或優選地6(Γ80個以上殘基的更長區域，或更優選地，至少約9(Γ100個殘基的更長區域，最優選的是序列與所比較序列整個長度，例如，核苷酸序列的編碼區實質相同。本文所用術語「協同作用」指的是預防或治療有效的藥劑聯用後比任意兩種或多種單獨藥劑的加起來的效果更有效。預防性或治療性藥劑聯用的協同作用可降低單種或多種藥劑給藥於患有特定疾病或不適的受試者的使用劑量及/或給藥頻率。在某些情況下，預防性或治療性藥劑聯用的協同作用可用來避免或減少使用單一治療所帶來的不良或不需要的副作用。本文所用術語「治療有效量」指含有至少一種非天然胺基酸多肽和/或至少一種已修飾非天然胺基酸多肽的組合物給藥於患有疾病、不適或病症的患者後，其用量足以治癒或至少部分地遏制或一定程度地緩解了所治療疾病、不適或病症的一個或多個症狀。這些組合物的有效性依具體情況而定，包括 但不限於疾病、病症或不適的嚴重程度和進程，先前的治療，患者的健康狀態和對藥物的反應，以及治療醫生的判斷。舉例來說，治療有效量可以經由常規的試驗包括但不限於劑量升級臨床試驗來確定。詳細說明本公開內容提供了一種抗血管生成藥劑及抑制血管生成的方法，其中將抗血管生成藥劑以治療有效的量和頻率給藥於患有相關疾病的哺乳動物進行治療，使該疾病得以消退或得到遏制而沒有明顯的毒性。血管生成相關疾病可選自腫瘤，包括實體腫瘤包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、神經母細胞瘤、中樞神經系統腫瘤、神經母細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤或黑素瘤。儘管沒有完整的清單，該抗血管生成藥劑可使即使不是全部也是絕大部分實體瘤消退或受到遏制。接受治療的哺乳動物可以是人類。在一個具體實施方案中，抗血管生成藥劑包括衍生自⑶2第一結構域的多肽的變體，其可為人源和及非人源。更具體地說，將CD2第一結構域的結構和功能加以改變後製備穩定性和活性不同的新多肽。在一些實施例中，這些改變可用於製備擬幾個內源性抗血管生成多肽，如PF4、IL8、TSP-1、內皮抑制素和其他合成多肽的活性部分的反向平行β -摺疊的至少兩段短鏈(如圖1Α、1Β和1C)。在一些實施例中，抗血管生成藥劑或多肽可包含由兩個片段、反平行摺疊、朝內的疏水面、朝外的親水面所形成的摺疊，這兩個片段至少有四個胺基酸。在其他實施例中，一個片段由6個或更多胺基酸組成。在其他的另一些實施例中，一個片段由8個或更多胺基酸組成。胺基酸殘基可在親水性和疏水性之間交替(如親水一疏水一親水一疏水或親水一疏水一疏水)。抗血管生成藥劑有許多體內、體外和先體外後體內的作用，包括臨床及非臨床使用情況下的抗血管生成特性。用定向進化技術製備或創造系統多肽變異的方法在本領域內是公知的。可以預期本文所公開的方法可用於製備其他具有至少兩個短鏈的反向平行β-摺疊的非⑶2多肽。在一個實施方案中，抗血管生成藥劑可使用合理的多肽設計來製備。合理設計包括鑑定多肽序列中胺基酸殘基並預測其對多肽特定影響的方法。例如，一種此類方法包括製備多肽變體的訓練集，其中數據提供了訓練集中每一多肽變體的活性及序列信息；衍生一個活性模型，使該模型可以根據特定胺基酸的改變來預測活性；並運用此模型來鑑定一個或多個多肽的特定位置上具有特定活性和屬性的一個或多個胺基酸。在另一實施方案中，通過在宿主多肽或⑶2的第一結構域(如SEQ ID Νο.4、5和7)內產生突變來製備抗血管生成藥劑。
本領域的普通技術人員可以用重組技術來製備特定的抗血管生成藥劑。例如，可以用常規方法製備SEQ ID NO. Γ11中的多肽或多肽的標識核酸。另外，SEQ IDN0. Γ 中的多肽也可用定點突變技術生產生，從而生成需要的抗血管生成藥劑。由於遺傳密碼的簡變性，與包括SEQ ID NO. f 11序列的任何序列不同的任意核酸序列可能發生改變。然後突變後的核酸序列可以亞克隆入合適的表達載體並在宿主如酵母或大腸桿菌(E. col1.)中表達。製備後的純化技術對於本領域的常規技術人員來說是顯而易見的。在一個實施方案中，抗血管生成藥劑可包括N-糖基化。N-糖基化過程存在於真核生物中，與多肽摺疊、可溶性以及長血液循環相關聯。N-糖基化可能需要共有序列Asn-X-Ser/Thr,並且該共有序列在肽環上時更易發生。在一個實例即畢赤酵母(Pichia)表達系統中，N-糖基化位點在位置N65上。在一些具體的實施方案中，抗血管生成藥劑控制或抑制血管生成。血管生成的抑制通常認為是中止了新血管的發育，不管其發育是經由萌牙而成還是由循環的幹細胞抵達分化成內皮細胞而成。然而，由於抗血管生成藥劑可以誘導活化的內皮細胞發生凋亡，抑制 血管生成應該也解釋為包括殺死細胞，尤其是那些靠近或位於腫瘤內已有血管內被腫瘤血管生成因子活化的細胞。因此，在本發明的上下文中，抑制血管生成也應該解釋為包括抑制新血管的發育，該抑制可伴有或不伴有鄰近已有血管的的破壞。抗血管生成藥劑可能通過抑制或控制凋亡來抑制或預防血管生成。體外分析表明生成的多肽在誘導內皮細胞凋亡方面有很強的活性而對上皮細胞和成纖細胞沒有影響。另外，生成的多肽對HUVEC細胞形成的管狀結構影響較小，提示對已有的正常血管毒性較小。存活因子包括血管內皮細胞生長因子或分裂素，以及對沒有直接生長刺激作用但可使細胞從受損恢復的因子。這些抗血管生成藥劑可以通過抑制血管生成的方式整合入治療哺乳動物的方法中，所述方法包括給藥抗血管生成藥劑的步驟。在一些特定的實施方案中，與某些小分子和短肽藥劑相比，抗血管生成多肽延長了循環時間。一些具體的實施方案提供了抑制血管生成的方法及治療與血管生成相關疾病的方法。在另一些實施文案中，本發明提供了抑制或減少腫瘤生長的方法，以及治療癌症患者的方法。這些方法包括將上述一種或多種多肽治療劑以治療有效的量給藥於患者。具體來說，這些方法針對動物的治療性及預防性處置，更具體地說是針對人類。正如本文所述，血管生成相關的疾病包括但不限於依賴於血管生成的癌症，包括如實體瘤、血液原生癌如白血病，以及腫瘤轉移；良性腫瘤,如血管瘤、聽神經瘤、神經纖維瘤、沙眼及膿性肉芽腫；炎症性病症，如免疫性及非免疫性炎症；慢性關節風溼病和銀屑病；眼內血管生成疾病，如糖尿病性視網膜病、早產兒視網膜病、黃斑變性、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶狀體後纖維組織形成及(虹膜)發紅；奧-韋氏(Osler-Webber)症候群；心肌血管生成；斑塊新血管形成；毛細血管擴張；血友病關節；血管纖維瘤；傷口肉芽生成及傷口癒合；銀屑病硬皮症毛細血管擴張、膿性肉芽腫、冠脈側支形成、缺血性四肢血管生成、角膜疾病、(虹膜)發紅、關節炎、糖尿病性新血管形成、骨折、血管發生以及血細胞生成。抗血管生成藥劑與化療劑聯用的一個潛在好處是可以使用更低的化療劑量改進血管生成相關疾病的治療和控制。聯用可以給藥更長的時間，兩者聯用後由於效果增強也可以給藥更短的時間。根據聯合治療的不同屬性，本發明的多肽治療劑可在其他治療施用時同時或之後接著給藥。多肽治療劑可以通過單劑量或多劑量的方式進行給藥。在一些實施例中，多肽治療劑至少在傳統治療開始前數天即開始給藥，而在另一些實施例中，在傳統治療的給藥開始時或之前給藥多肽治療劑。在一個實施方案中，抗血管生成藥劑可與化療劑和其他治療劑以及放射療法聯用。化療劑可選自長春花生物鹼、喜樹生物鹼、紫杉烷或者鉬類似物，包括長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱、長春地辛、紫杉醇、多西紫杉醇、5-FU、順鉬、卡鉬、伊立替康、拓撲替康或環磷醯胺。由於抗血管生成藥劑有抗腫瘤作用，化療劑可以以低劑量方案與抗血管生成藥劑聯用給藥。化療劑給藥的劑量可低於最大耐受劑量。可以預期的是抗血管生成藥劑可與抗腫瘤劑一起使用，包括下列的抗腫瘤劑阿西維辛、阿柔比星、鹽酸阿考達唑、阿克羅寧、阿多來新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波黴素、醋酸阿美蒽醌、氨魯米特、安η 丫唆、阿那曲唑、安麴黴素、天冬醯胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、 阿扎替派、阿佐黴素、巴馬司他、苯佐替派、比卡魯胺、鹽酸比生群、二甲磺酸雙奈法德、比折來新、硫酸博來黴素、布喹那鈉、溴匹立明、白消安、放線菌素C、卡魯睪酮、卡醋胺、卡貝替姆、卡鉬、卡氮芥、鹽酸卡柔比星、卡折來新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西羅黴素、順鉬、克拉屈濱、甲磺酸克立那託、環磷醯胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素D、鹽酸柔紅黴素、地西他濱、右奧馬鉬、地扎胍寧、甲碘酸地扎胍寧、地吖醌、多西他賽、多柔比星、鹽酸多柔比星、屈洛昔芬、檸檬酸屈洛昔芬、丙酸甲雄烷酮、達佐黴素、依達曲沙、鹽酸二氟甲基鳥氨酸、依沙蘆星、恩洛鉬、恩普氨酯、依匹哌啶、鹽酸表柔比星、厄布洛唑、鹽酸依索比星、雌氮芥、雌氮芥磷酸鈉、依他硝唑、1131乙碘油、依託泊苷、磷酸依託泊苷、氯苯乙嘧胺、鹽酸法羅唑啉、法扎拉濱、芬維A胺、氟尿苷、磷酸氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟西他濱、磷喹酮、福司曲星鈉、吉西他濱、鹽酸吉西他濱、金Aul98、羥基脲、鹽酸伊達比星、異環磷醯胺、伊莫福新、幹擾素a_2a、幹擾素a-2b、幹擾素α-η 、幹擾素α_η3、幹擾素β-1a、幹擾素Y _Ib、異丙鉬、鹽酸伊立替康、醋酸蘭瑞肽、來曲唑、醋酸亮丙瑞林、鹽酸利阿唑、洛美曲索鈉、洛莫司汀、鹽酸洛索蒽醌、馬索羅酚、美登素、鹽酸氮芥、乙酸甲地孕酮、醋酸美侖孕酮、美法侖、美諾立爾、巰嘌呤、甲氨喋呤、甲氨蝶呤鈉、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米託卡星、絲裂紅素、米託潔林、米託馬星、絲裂黴素、米託司培、米託坦、鹽酸米託蒽醌、麥考酚酸、諾考達唑、諾加黴素、奧馬鉬、奧昔舒侖、紫杉醇、培門冬酶、培利黴素、溴新斯的明、硫酸培洛黴素、培磷醯胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、鹽酸吡羅蒽醌、普卡黴素、普洛美坦、葉吩姆鈉、泊非黴素、潑尼莫司汀、鹽酸丙卡巴肼、嘌呤黴素、鹽酸嘌呤黴素、吡唑黴素、利波腺苷、羅谷亞胺、沙芬戈、鹽酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙醯天冬氨酸鈉、司帕黴素、鹽酸鍺螺胺、螺莫司汀、螺鉬、鏈黑黴素、鏈佐星、氯化鍶Sr89、磺氯苯脲、他利黴素、紫杉烷、類紫杉醇(Txoid)、替可加蘭鈉、替加氟、鹽酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替羅昔隆、睪內酯、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、鹽酸拓撲替康、枸櫞酸託瑞米芬、醋酸曲託龍、磷酸曲西立濱、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、鹽酸妥布氯唑、烏拉莫司汀、烏瑞替派、伐普肽、維替泊芬、硫酸長春鹼、硫酸長春新鹼、長春地辛、硫酸長春地辛、硫酸長春匹定、硫酸長春甘酯、硫酸環氧長春鹼、酒石酸長春瑞濱、硫酸長春羅定、硫酸長春利定、伏氯唑、折尼鉬、淨司他丁以及鹽酸佐柔比星。
其他抗腫瘤化合物包括20-表-1，25 二羥維生素D3、5-乙炔尿嘧啶、阿比特龍、阿柔比星、醯基富烯、腺環戊醇、阿多來新、阿地白介素、ALL-TK拮抗劑、六甲蜜胺、氨莫司汀、2，4-二氯苯氧基乙酸(amidox)、氨磷汀、氨基乙醯丙酸、氨柔比星、阿託沙克鹼(atrsacrine)、阿那格雷、阿那曲唑、穿心蓮內酯、血管生成抑制劑、拮抗劑D、拮抗劑G、安雷利克斯、抗背部化形態發生多肽-1、抗雄激素物質、前列腺癌、抗雌激素藥、抗腫瘤肽、反義寡核苷酸、甘氨酸阿非科林、凋亡基因調節劑、凋亡調節劑、無嘌呤核酸、腺苷-CDP-DL-PTBA (ara-CDP-DL-PTBA)、精氨酸脫氨酶、苯胺丫啶(asulacrine)、阿他美坦、阿莫司汀、洋蟲膠抑制素I (axinastatin I)、洋蟲膠抑制素2 (axinastatin2)、洋蟲膠抑制素3 (axinastatin3)、阿扎司瓊、阿扎毒素、重氮酪氨酸、漿果赤黴素III衍生物、博拉諾(balanol)、巴馬司他、BCR/ABL拮抗劑、苯並二氫P卜吩、苯甲醯星狀孢子鹼、β -內醯胺衍生物、β-鳩尾(β-alethine) ; β -克拉黴素B、樺木酸、bFGF抑制劑、比卡魯胺、比生群、雙乙烯亞氨基精胺(bisaz ir idiny I spermine)、雙奈法德、雙枸櫞酸環己噻卓酯A(bistratene A)、比折來新、布來福林(breflate)、溴匹立明、布度鈦、丁硫氨酸硫酸亞胺、卡泊三醇、鈣磷酸蛋白C、喜樹鹼衍生物、金絲雀痘IL-2、卡培他濱、氨甲醯-氨-三唑、羧氨基三唑、CaRest M3、CARN700、衍生自軟骨的抑制劑、卡折來新、酪蛋白激酶抑制劑(IC0S)、 澳粟精胺、天蠶抗菌肽B、西曲瑞克、二氫卟酚、磺胺氯喹惡啉、西卡前列素、順卟啉、克拉屈濱、氯米芬類似物、克黴唑、克裡斯黴素(collismycin) A、克裡斯黴素(collismycin) B、考布他汀A4、考布他汀類似物、天然產物(conagenin)、五環胍類生物鹼(crambescidin) 816、克立那託、自念珠藻環肽8 (cryptophycin8)、自念珠藻環肽A (cryptophycin A)衍生物、先導化合物(curacin) A、環戍烯蒽醌(eyeIopentanthraquinones)、環鉬(cycloplatam)、環青黴素(cypemycin)、阿糖胞嘧啶、溶細胞因子、磷酸己烷雌酚、達昔單抗、地西他濱、脫氫膜海鞘素B、地洛瑞林、右異環磷醯胺、右雷佐生、右維拉帕米、地吖醌、膜海鞘素B、3，4- 二輕筌苯並氧廂酸(didox)、二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)、二氫-5-氮胞苷、9- 二氫紫杉醇、雙草黴素、聯苯螺莫司汀、二十二烷醇、多拉司瓊、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、屈大麻酹、苯並批咯類(duocannycin SA)、依布硒、依考莫司汀、依地福新、依決洛單抗、依氟鳥氨酸、欖香烯、乙嘧替氟、表柔比星、愛普列特、雌氮芥類似物、雌激素激動劑、雌激素拮抗劑、依他硝唑、磷酸依託泊苷、依西美坦、法倔唑、法扎拉濱、芬維A胺、非格司亭、非那甾胺、夫拉平度(fIavopiridol )、氟卓斯汀、氟海星酮(fluasterone)、氟達拉濱、鹽酸氟代柔紅黴(fluorodaunorunicin)、福酹美克、福美坦、福司曲星、福莫司汀、德克薩P卜啉禮(gadolinium texaphyriη)、硝酸鎵、加洛他濱、加尼瑞克、明膠酶抑制劑、吉西他濱、穀胱甘肽抑制劑、1，7—庚二醇一雙氨基磺酸醋(h印sulfam)、神經生長因子、六甲撐二乙醯胺、金絲桃素、伊班膦酸、伊達比星、艾多昔芬、伊決孟酮、伊莫福新、伊洛馬司他、咪唑吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激肽、胰島素樣生長因子-1受體抑制劑、幹擾素激動劑、幹擾素、白介素、碘節胍、碘阿黴素、甘薯苦醇、伊立替康、伊羅普拉、伊索拉定、異苯唑(isobengazole)、同功齒素康得靈(isohomohalicondrin) B、伊他司瓊、促微絲聚合劑(jasplakinolide)、環縮肽(kahalalide) F、片螺素(Iamellarin) -N三乙酸鹽、蘭瑞肽、雷拉黴素(Leinamycin)、來格司亭、硫酸蘑菇多糖、來泊司汀(I印tolstatin)、來曲唑、白血病抑制因子、白細胞α幹擾素、亮脯利特+雌激素+黃體酮、亮丙瑞林、左旋咪唑、利阿唑、線性聚胺類似物、親脂性雙糖肽、親脂性鉬化合物、環肽噻唑啉海洋環肽(Iissoclinamide) 7、洛鉬、Φ丘蝴磷脂、洛美曲索、氯尼達明、洛索蒽醌、洛伐他汀、洛索立賓、勒託替康、藍花贗靛素餾(Iutetium七013 1^1'；[11)、利索茶鹼(178(^711;[116)、溶解肽、美坦新、抑甘露糖苷酶素(mannostatin)A、馬立馬司他、馬索羅酚、乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物、基質溶解因子抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、美諾立爾、美巴龍(merbarone)、美替瑞林、蛋氨酸酶(methioninas)、甲氧氯普胺、MIF抑制劑、米非司酮、米替福新、米立司亭、錯配雙鏈RNA、米託胍腙、二溴衛矛醇、絲裂黴素類似物、米託萘胺、絲裂毒素(mitotoxin)成纖維細胞生長因子-皂草素、米託蒽醌、莫法羅汀、莫拉司亭、單克隆抗體、人絨毛膜促性腺激素、單磷酸類脂A+分支桿菌(myobacterium)細胞壁sk、莫哌達醇、多藥耐藥基因抑制劑、基於多腫瘤抑制基因-1的治療、芥末抗癌劑、印度洋海綿B (mycaperoxideB)、分枝桿菌(myobacterium)細胞壁提取物、苔蘚蟲海綿(myriaporone)、N-乙醯 地那林、N取代苯醯胺類、那法瑞林、那哥斯普(nagrestip)、納洛酮+噴他佐辛、納帕維(napavin)、萘職二醇(naphterpin)、那託司亭、奈達鉬(nedaplati)、奈莫柔比星、奈立膦酸、中性肽鏈內切酶、尼魯米特、尼薩米森(]^8311^(^11)、一氧化氮調節劑、一氧化二氮抗氧化劑、尼楚林(11；[1:；10111711)、0-6-節基鳥嘌呤、奧曲肽、奧克三諾(okicenone)、寡核苷酸、奧那司酮、昂丹司瓊、奧瑞森(oracin)、口服細胞因子誘導劑、奧馬鉬、奧沙特隆、奧沙利鉬、奧諾米森(oxaunomycin)、紫杉酚類似物、紫杉酚衍生物、鈀胺(palauamine)、棕櫚醯根黴素、帕米磷酸、人參三醇、帕諾米芬、副菌鐵素(parabactin)、帕折普汀、培門冬酶、培得星、戊聚糖聚硫酸鈉、噴司他丁、噴曲唑(pentrozole)、全氟溴燒、培磷醯胺、紫蘇子醇、吩嗪黴素(phenazinomycin)、乙酸苯酯、磷酸酶抑制劑、溶鏈菌製劑、鹽酸毛果雲香鹼、卩比柔比星、卩比曲克辛、帕斯婦(placetin) A、帕斯婷(placetin) B、纖溶酶原活化因子抑制劑、鉬複合物、鉬類化合物、鉬三胺複合物、葉吩姆鈉、泊非黴素、丙基雙吖啶酮、前列腺素J2、蛋白酶體抑制劑、基於A蛋白的免疫調節劑、蛋白激酶C抑制劑、微海藻類(microalgal)蛋白激酶C抑制劑、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制齊U、嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑、紅紫素、吡唑啉吖唆、吡醇羥乙酯血紅蛋白聚氧乙烯綴合物、raf拮抗劑、雷替曲塞、雷莫司瓊、ras法尼基蛋白轉移酶抑制劑、ras抑制劑、ras-GAP抑制劑、脫甲基瑞替普汀、錸Re86依替膦酸鹽、根黴素、核酶、維甲醯酚胺(retinamide) RH、羅谷亞胺、羅稀吐鹼(rohitukine)、羅莫肽、羅喹美克、如彼給諾(rubiginone) B1、如波斯(ruboxyl)、沙芬戈、沙託品(saintopin)、SarCNU、肌肉葉綠醇(sarcophytol) A、沙格司亭、Sdil模擬物、司莫司汀、衰老相關抑制劑1、正義寡核苷酸、信號轉導抑制劑、信號轉導調控劑、單鏈抗原結合蛋白、西佐非蘭、索布佐生、卡鈉(sodium borocaptate)、苯乙酸鈉、索沃澳(solverol)、生長調節素結合蛋白、索納明、磷乙天冬氨酸、穗黴素D (spicamycinD)、螺莫司汀、脾臟五肽(splenopentin)、CD-螺環縮酮前體δ -內酯(spongistatinl)、角鯊胺、幹細胞抑制劑、幹細胞分化抑制劑、莖胺(stipiamide)、基質降解酶抑制劑、硫密斯(sulfmosine)、強效血管腸肽拮抗劑、磺酸偏端黴素(suradista)、舒拉明、苦馬豆素、合成葡糖氨基葡聚糖、他莫司汀、它莫西芬甲碘化物、牛磺莫司汀、他扎羅汀、替可加蘭鈉、替加氟、締批喃洋(tellurapyrylium)、端粒末端轉移酶抑制劑、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊式、四氯十氧化物、四氫惡唑環(tetrazomine)、白蓬草硝酸鈉(thaliblastine)、沙立度胺、噻可拉林、血小板生成素、血小板生成素模擬物、胸腺法新、胸腺生成素受體激動劑、胸腺曲南、促甲狀腺激素、本紫紅素乙酯錫、替拉扎明、二氯環戊二烯鈦、託泊替康、雙吲哚鹼(topsentin)、託瑞米芬、全能幹細胞因子；翻譯抑制劑、維甲酸、三乙醯尿苷、曲西立濱、三甲曲沙、曲普瑞林、託烷司瓊、妥羅雄脲、酪氨酸激酶抑制劑、酪氨酸磷酸化抑制劑、UBC抑制劑、烏苯美司、泌尿生殖竇衍生生長抑制因子、尿激酶受體拮抗劑、伐普肽、全酸蝕樹脂粘結劑(variolinB)、載體系統、紅細胞基因治療、維拉雷瑣、藜蘆明、黃雀(verdins)、維替泊芬、長春瑞濱、維夏汀(vinxaltine)、維它新(vitin)、伏氯唑、扎諾特隆、折尼鉬、亞節維C(zilascorb)、淨司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)。本領域常規技術人員應知屬於此類藥劑的大量其他化合物也可用於與所述抗血管生成藥劑聯用。可以預期的是抗血管生成藥劑可與抗癌補充增強劑，包括下列補充增強劑一起使用抗癌補充增強劑，三環抗抑鬱藥(如丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、氯米帕明(clomiprainine)、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普羅替林、阿莫沙平和馬普替林)、非三環抗抑鬱藥(如舍曲林、曲唑酮 和西酞普蘭)、Ca2+阻滯劑(維拉帕米、硝苯地平、尼群地平和卡羅維林)、鈣調蛋白抑制劑(如普尼拉明、三氟拉嗪和氯米帕明)、兩性黴素B、曲帕拉醇類似物(如他莫昔芬)、抗心律失常藥(如奎尼丁)、抗高血壓藥(如利血平)、硫醇耗竭劑(depleters)(如丁硫氨酸(buthionine)和亞碸亞胺(sulfoximine)),以及降低多藥耐藥性的藥劑如Cremaphor EL0本發明的化合物也可與細胞因子，如粒細胞集落刺激因子一起給藥。本領域常規技術人員應知屬於此類藥劑的大量其他化合物也可用於與所述抗血管生成藥劑聯用。—個實施方案也包括一套治療哺乳動物中血管生成相關疾病的試劑盒,其包括抗血管生成藥劑和化療劑。藥劑聯用後使其給藥的劑量和頻率對血管生成停止或消退有治療效果。在一些特定實施方案中，抗血管生成藥劑及/或多核苷酸單獨給藥或與抗炎劑聯合給藥。可與本發明抗血管生成藥劑一起給藥的抗炎劑包括但不限於皮質類固醇(如倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、強的松和曲安西龍)、非類固醇抗炎藥(如雙氯芬酸、二氟尼柳、依託度酸、非諾洛芬、夫洛非寧、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸(meclofenamate)、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普秦、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、替諾昔康、噻洛芬酸和託美丁)，以及抗組胺藥、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑類、吡唑啉酮、水楊酸衍生物、噻嗪氨甲醯衍生物、e-乙醯氨基己酸、S-腺苷蛋氨酸、3-氨基-4-羥基丁酸、阿米西群、苄達酸、苄達明、布可隆、聯苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈創藍油烴、萘丁美酮、尼美舒利、奧古蛋白、奧沙西羅、瑞尼託林、哌立索唑、哌福肟、普羅喹宗、普羅沙唑和替尼達普。藥物學的藥劑包括下列類屬和具體實例。所述類屬並不受具體的實例所限定。本領域常規技術人員應能容易地識別作用於中樞神經系統之外的藥物學的藥劑。本領域技術人員亦應知屬於所述類屬、依據本發明可用的大量其他化合物。在一些實施方案中，可能需要增加抗血管生成藥劑的溶解度和血液循環時間。可以用聚乙二醇將本發明多肽加以衍生以增加多肽的溶解度和血液循環時間，包括諸如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯卩比咯燒酮、多氧聚物(polyoxomers)、聚山梨醇酯和聚乙烯醇,尤其優選PEG聚合物。所述PEG聚合物分子量約為100到約4000。對於本領域技術人員顯而易見的是，除上述列舉實例外，也可根據本公開內容選用其他合適的親水聚合物。所用聚合物通常包括可通過烴化或醯化反應連接於本發明多肽的聚合物。在一個實施例中，抗血管生成藥劑用一個20kDa的PEG鏈進行PEG加聚。
聚乙二醇分子(或其他化學部分)連接時應考慮其對多肽功能結構域或抗原結構域的影響。本領域技術人員可以選用多種連接方法。舉例來說，聚乙二醇可通過活性基團，如游離氨基或羧基與胺基酸殘基共價結合。活性基團是指聚乙二醇分子活化後可以結合的基團。含游離氨基的胺基酸殘基可包括賴氨酸殘基和N-端胺基酸殘基；含游離羧基的胺基酸殘基可包括天門冬氨酸殘基、穀氨酸殘基和C-端胺基酸殘基。巰基也可用作連接聚乙二醇分子的活性基團。出於治療目的，連接優選氨基連接，如N-端或賴氨酸基連接。可能需要對多肽在N末端進行特別的化學修飾。以聚乙二醇為本組合物示例，可以選用各種不同的聚乙二醇分子(分子量、支鏈等)、反應混合物中聚乙二醇分子對多肽分子的比例、所進行的聚乙二醇化反應類型，以及獲得所選N端聚乙二醇化多肽的方法。在適當的反應條件下，大體上實現了用含有聚合物的羰基在多肽N端進行的羰選擇性衍生。有多種給藥途徑可用。可以根據抗血管生成藥劑、所治療的具體疾病以及起效所需劑量來選擇特定的模式。可使用臨床可接受的任意給藥模式來實踐這些方法，即產生有效水平免疫應答而沒有臨床不可接受的副作用的任意模式。某些給藥方式為非腸胃途徑。
某些具體的實施方案也提供了藥物組合物。所述組合物包含治療有效量的活性組分(如抗血管生成藥劑、抗血管生成劑藥加化療劑或抗血管生成藥劑加抗炎劑)以及藥物學上可接受的載體。所述藥物學上可接受載體可以為無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油及合成的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。藥物組合物靜脈給藥時以水為載體。鹽水溶液、葡萄糖水和甘油溶液也可用作液體載體，尤其是注射溶液的載體。合適的藥物賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、碳酸鈣、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、幹脫脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要時組合物也可含有小量的增溼劑或乳化劑，或PH緩衝劑。這些組合物劑型可是溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋劑等。組合物也可與傳統的粘合劑和諸如甘油三酯的載體一起製成栓劑。口服劑型可包含標準載體如藥用級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。此類組合物包含有治療效量的抗血管生成藥劑和適量載體，以便提供適合於給藥給患者的劑型。劑型應與給藥模式相稱。可以用標準臨床技術來確定對治療、抑制和預防異常表達相關疾病或病症起效(如參見圖9)的抗血管生成藥劑用量及/或治療性多肽的活性。另外，也可用體外試驗輔助鑑別最佳劑量範圍。劑型中所採用的精確劑量也取決於給藥途徑以及疾病或病症的嚴重程度，應根據醫師的判斷和每個患者的情況來確定。可以從體外或動物模型實驗系統製得的劑量應答曲線外推有效劑量。更具體地說，在人類身上使用所述藥劑或藥物組合物之前可先在體外然後在體內測試所需的治療或預防活性。例如，用體外試驗證明化合物或藥物組合物的治療性或預防性用途，包括對細胞系或患者組織樣本的效果。可以利用本領域技術人員公知的技術確定化合物或組合物對細胞系及/或組織樣本的效果，包括但不限於玫瑰花環形成試驗和細胞溶解試驗。依據本發明，可用於確定是否給藥了特定化合的體外試驗包括體外細胞培養試驗，患者組織樣本於培養物中生長並暴露於或給藥了化合物，並觀察了此化合物對組織樣本的效果。可以預期的是，抗血管生成藥劑可根據常規途徑製成適於人類靜脈內給藥的藥物組合物。典型的靜脈內給藥的組合物為無菌等滲緩衝液的溶液。必要時，組合物也可包括增溶劑和局部麻醉劑，如利多卡因來減輕注射部位的疼痛。通常來說，這些成分分別供應或以單位劑型混合一起供應，如將乾燥凍乾粉或無水濃縮物存於密封容器，象安瓿或包裝袋(sachette)內，容器標明了活性成分含量。當組合物以輸注方式給藥時，組合物可用含無菌藥用級水或鹽水的輸注瓶配製。當組合物以注射劑給藥時，可提供注射用無菌水或鹽水的安瓿以便所述成分在給藥前可以混合。已知有多種遞藥系統可用於本發明化合物的給藥，如脂質體包囊、微粒、微囊、可表達所述化合物的重組細胞、受體介導的胞吞、構建核酸成為逆轉錄病毒或其他載體的一部分，等等。導入的方法包括但不限於皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及口服途徑。化合物或組合物可用任意方便的途徑給藥，例如輸注或快速濃注，或者通過上皮或黏膜皮膚內層(如口腔黏膜、直腸黏膜和腸黏膜等)，也可與其他具有生物學活性的藥劑一起給藥。可以全身性或局部給藥。另外，可能需要將本發明的藥物化合物或組合物以任意合適的途徑，包括心室內注射和鞘內注射導入中樞神經系統，心室內注射可用心室內導管加以輔助。 在一個具體的實施方案中，可能需要將抗血管生成藥劑局部給藥於需治療的區域。例如，可以用下述方法但不限於這些方法來實現手術時局部輸注，手述後例如和傷口敷料一起局部應用，應用方式為注射、使用導管、使用栓劑或使用植入物；所述植入物可為多孔性、無孔或凝膠狀材料，其包括膜，如矽酮(sialastic)膜或纖維。給藥多肽時應注意使用多肽不會吸收的材料。在一個具體實施方案中，抗血管生成藥劑為編碼多肽的核酸，將所述核酸構建為適當核酸表達載體的一部分，使其給藥後進入細胞內，在體內促進其編碼的多肽表達，施用方式可以使用逆轉錄病毒載體、直接注射、使用微粒轟擊、用脂質或細胞表面受體或轉染劑包膜、或與公知進入胞核的同源異形盒樣肽接合給藥，等等。此外，可以通過同源重組使核酸導入細胞內並與宿主細胞的DNA整合進行表達。其他實施方案專注於含有編碼抗血管生成藥劑多核苷酸的載體、宿主細胞，以及用合成和重組的技術生產抗血管生成藥劑。例如，載體可以為噬菌體、質粒、病毒或逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體可具有複製能力或有複製缺陷。在後一種情況下，病毒繁殖通常僅在互補宿主細胞內發生。編碼抗血管生成藥劑的多核苷酸可與含有選擇性標記的載體連接在宿主內繁殖。質粒載體通常以沉澱物，如磷酸鈣沉澱物或以帶電脂質的複合物形式導入。多核苷酸插入應該與適當的啟動子可操作地連接，在此僅列舉數例，如λ噬菌體的PL啟動子、大腸桿菌的lac、trp、phoA和tac啟動子，SV40的早期啟動子和後期啟動子以及逆轉錄病毒LTR的啟動子。本領域技術人員也公知其他適當的啟動子。表達構建體還包含轉錄的起始位點和終止位點以及轉錄區內用於翻譯的核糖體結合位點。構建體所表達的轉錄本的編碼區優選在所翻譯多肽的起始位置和大約終止的位置分別包括翻譯起始密碼子和終止密碼子(UAA、UGA或UAG)0如前文所述，表達載體優選包括至少一個選擇性標記。可以預期的是，常規基因和序列可用於抗血管生成藥劑的表達和複製。不同種屬或細胞類型之間的基因表達調控序列的性質可能有差異，一般來說必須包括分別參與轉錄起始和翻譯起始的5』非轉錄序列和5』非翻譯序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。啟動子可以為組成型或誘導型。必要時調控序列也可包括增強子序列或上遊激活序列。在一個實施方案中，編碼抗血管生成藥劑的多核苷酸可與編碼信號序列的多核苷酸融合，後者將多肽定位到原核細胞或真核細胞的特定隔室，並且/或者定位多肽的分泌。例如，在大腸桿菌內可能需要將蛋白的表達定向到胞質空間。有數個商用載體可用於構建融合蛋白來定位蛋白的位置。一個具體實施方案提供了支架，其包含一個通常是管狀的結構(例如包括螺旋形)，其表面塗層有前述抗血管生成藥劑。支架可以為基架，通常呈圓柱形，可插入到體內的管道(如膽管)或體內管道的一部分中防止其閉合或再閉合，所述管道已經狹窄、不規則的挫傷、堵塞或因疾病進展而閉塞(如腫瘤的向內生長)。—個具體實施方案也提供抗血管生成藥劑在不同手術操作中的廣泛應用。例如，本發明一方面可以使用抗血管生成蛋白(例如，以噴霧或薄膜的形式)在去除腫瘤之前對區域包被或噴塗，從而將正常的周圍組織與惡性組織分離，同時/或者預防疾病向周圍組織擴散。然而，在本發明的另一方面，可在需要使用手術網狀織物的任意手術操作中採用本發明抗血管生成蛋白包被過的手術網狀織物。下文所述實施例目的在於幫助理解本發明，無意也不應理解為對本發明的範圍構 成任何方面的限制。
實施例實施例1:抗血管生成藥劑的表達抗血管生成藥劑從大腸桿菌表達和純化。為了有助於確認所設計多肽仍能正確地摺疊，其結構用IH-NMR分析進行確證。抗血管生成藥劑的NMR譜(120 μ m)與⑶2-D1的NMR譜(120 μ m)進行對比。如圖2所示，抗血管生成藥劑的NMR譜幾乎與⑶2-D1的NMR譜(上)完全一樣，而未摺疊多肽(用有機溶劑處理)則顯示完全不同的譜(下)。所得多肽顯示了與宿主蛋白和生成的蛋白之間1H-NMK圓二色譜(CD )及螢光光譜的相似性所證明的非常相似的結構性質。實施例2 :內皮細胞和細胞凋亡用HUVEC細胞進行細胞存活分析來確定抗血管生成藥劑對內皮細胞的作用。細胞用不同濃度的抗血管生成藥劑生成的樣例、血管生成抑制肽及用於衍生抗血管生成藥劑的宿主多肽進行處理。如圖3A所示，抗血管生成藥劑更有效地誘導HUVEC細胞的細胞凋亡(圖2A)。我們還測試了這種作用是否為內皮細胞特異性的。為此用HUVEC、M4A4在5 μ M或10 μ M抗血管生成藥劑、血管生成抑制肽及宿主蛋白存在的條件下進行細胞增殖試驗。如圖3Β和圖9所示，非常明顯抗血管生成藥劑對HUVEC細胞的增殖有很強的抑制，而Μ4Α4上皮細胞則沒有觀察到這種抑制作用。這些觀察資料表明抗血管生成藥劑的作用是內皮細胞特異性的。實施例3 :抑制PC-3細胞異種移植的腫瘤生長明顯地，抗血管生成藥劑對抑制HUVEC細胞生長並誘導其細胞凋亡有著很強的活性。用免疫缺陷小鼠製備PC-3細胞的異種移植模型。患腫瘤小鼠(每組6隻)用抗血管生成藥劑(10mg/kg)、PEG化抗血管生成藥劑(10mg/kg)、宿主蛋白(10mg/kg)和緩衝鹽水每日劑量治療兩周。治療於腫瘤接種7天後開始。測定腫瘤體積或腫瘤細胞的生物發光。如圖4A和4B所示，抗血管生成藥劑和抗血管生成藥劑PEG抑制了腫瘤的生長。圖4A圖示了在使用抗血管生成藥劑治療的療程中，8天後治療開始時，腫瘤體積保持相對不變。圖4B圖示使用抗血管生成藥劑治療的療程裡，22天後治療開始時，抗血管生成藥劑的劑量依賴效應，腫瘤體積也保持相對不變。同時在對照組中，用緩衝液和宿主蛋白治療的小鼠其腫瘤以正常速度生長。治療療程結束，切除每個治療組的腫瘤和稱重。如圖5所示，抗血管生成藥劑組和對照組之間的腫瘤重量有明顯的差異。本試驗中腫瘤的初始值為2xl06細胞。治療於腫瘤接種22天後開始。抗血管生成藥劑完全抑制了腫瘤的生長。如圖6所示，對照組小鼠用緩衝液和宿主蛋白(⑶2)治療，其腫瘤以正常速度生長。從這些影像可以看出，用檢測的抗血管生成藥劑治療後腫瘤保持穩定。僅出於參考目的，將蛋白MlWT稱為促血管生成素I (Angiol)，MlPEG為促血管生成素2 (Angio2)。實施例4 :治療後的血管密度圖7表明，從治療小鼠製備腫瘤組織切片用免疫螢光染色後顯示，與PEG化宿主蛋白治療組和緩衝液治療組相比，抗血管生成藥劑組和PEG化抗血管生成藥劑組治療後血管 密度顯著降低。治療結束後收集腫瘤以確定抗血管生成藥劑治療效果是否真正與腫瘤血管相關。從收集的腫瘤製備組織載玻片。組織載玻片用內皮細胞特異性的分子標誌物，抗CD31抗體免疫染色。腫瘤組織載玻片的免疫染色用共聚焦顯微鏡觀察。結果表明抗血管生成藥劑對腫瘤血管生成具有特異性效果。實施例5 :抗血管生成藥劑的毒性及免疫原性CD2第一結構域的親本蛋白的毒性之前已有分析，其對小鼠無毒。用CD-1小鼠檢驗抗血管生成多肽的毒性來輔助確保新設計沒有改變此蛋白的毒性。首先在14天治療期間密切監測患腫瘤裸小鼠體重。如圖8所示，在任何治療組的小鼠均未觀察到體重明顯變化。另外，測試正常⑶-1小鼠的毒性。三組小鼠(每組7隻小鼠)用一劑、兩劑和三劑100 μ I多肽(100mg/kg，是所用劑量的20倍)靜脈注射，每兩次注射之間間隔三天。然後將動物放回籠裡30天。未觀察到有受試小鼠死亡。所有動物行為表現正常(飲食習慣未改變，體重無異常增加或減少，皮毛無異常表現)。毒性試驗表明，抗血管生成藥劑和帶有PEG的抗血管生成藥劑在高於患腫瘤小鼠治療所用劑量約20倍的至少三個劑量沒有急性毒性。另外，我們也檢驗了抗血管生成藥劑和帶有PEG的抗血管生成藥劑治療時是否有肝、腎及心血管損傷。組織學檢查未發現受試動物有器官損傷。實施例6 :N-糖基化序列ID No. 11所示多肽用畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統進行表達和純化。此多肽的畢赤酵母表達同時由胞內表達和分泌表達實現。多肽進一步用離子交換柱進行純化。此多肽表達為組氨酸標記多肽。組氨酸標記用凝血酶裂解去除。畢赤酵母表達和純化的糖基化蛋白是一種抗血管生成藥劑，其含有N-糖基化。如圖13所示，用抗血管生成藥劑不同樣例處理後細胞存活力強健。實施例7 :序列序列ID No.1為大鼠來源⑶2第一結構域的胺基酸序列(WT大鼠⑶2_D1)RDSGTVffGAL GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RffERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILAN⑶LKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALDLRILE序列ID No. 2為人源的⑶2第一結構域的胺基酸序列(WT人⑶2_D1)
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETF K EKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQER序列ID No. 3也稱為MlWT或促血管生成素I (Angiol )，是源自序列ID No.1的CD2第一結構域的在W7Q、G8M、A9K、D94N、R96K、I97V、L98I和E99I突變後的變體胺基酸序列RDSGTVQMKL GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RffERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILAN⑶LKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALNLKVII序列ID No. 4 是源自序列 ID No.1 的 CD2 第一結構域在 E411、K43V、K45L、M46G、K47S、P48V和G53L突變後的變體胺基酸序列RDSGTVKffKA GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RffERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILAN⑶LKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALSLDVNI序列ID No. 5是源自序列ID No.1的CD2第一結構域在E41N、M46Q和F49S突變後的變體胺基酸序列RDSGTEVIKA GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RffERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILAN⑶LKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALKLTAIL序列ID No. 6,稱為前促血管生成素(ProAngio)-PEG或促血管生成素2(Angio2),是源自序列ID No. 3的CD2第一結構域在M23C突變後的變體胺基酸序列RDSGTVQMKL GHGINLNIPN FQCTDDIDEV RffERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILAN⑶LKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALNLKVII序列ID No. 7 是源自序列 ID No.1 的 CD2 第一結構域在 E411、K43V、K45L、M46G、K47S和F49S突變後的變體胺基酸序列RDSGTVffGAL GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RffERGSTLVA IFVRLGSVKM KPLLKSGAFEILANGDLKIK NLTRDDSGTY NVTVYSTNGT RILNKALDLR ILE序列ID No. 8是⑶2第一結構域一個變體的胺基酸序列RDSGTVWGALGHGINLNIPNFQMTDDIDEVRWERGSTLVANFKRKQKPS LKSGAFEILANGDLKIKNLTRDDSGTYNVTVYSTNGTRILNKALDLRILE序列ID No. 9,稱為hProAngioB或促血管生成素3(Angio3),是源自序列ID No. 2的 CD2 第一結構域在 E8S、T9V、W10Q、G11M、A12K、D99N、I102V、Q103I 和 E104I 突變後的變
體胺基酸序列KEITNALSVQMKLGQD1NLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETF K EKDTYELLKNGALKIKHLKTDDQDIYKVSIADTKGKNVLEKIFNLKVII序列ID No. 10，稱為hProAngio或促血管生成素4(Angio4)，是源自序列ID No. 9的CD2第一結構域在M30C突變後的變體胺基酸序列KEITNALSVQMKLGQDINLDIPSFQCSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETF KEKDTYELLKNGALKIKHLKTDDQDIYKVSIADTKGKNVLEKIFNLKVII序列ID No. 11,稱為hProAngioY或促血管生成素5 (Angio5),是酵母來源0)2第一結構域一個變體的胺基酸序列KEITNALSVQMKLGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETF KEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIADTKGKNVLEKIFNLKVII
實施例7 :腫瘤生長抑制圖10顯示了腫瘤治療14天或以上的生長曲線。結果表明序列ID No. 10所編碼多肽得到的hProAgio或促血管生成素4(Angio4),可有效抑制腫瘤生長。試驗使用hProAgio或促血管生成素4 (Angio4)(日劑量為10mg/kg)的PC-3異種移植完成，並以緩衝鹽水對照。腫瘤接種8天後開始治療。實施例8 與Avasting的效果對比為進一步測試抗血管生成多肽的效果，用rProAgio-PEG或促血管生成素2(Angio2)(每日劑量20mg/kg)和Avastin (20mg/kg,隔日一劑)對PC-3異種移植進行試驗和分析。腫瘤接種21天後開始治療。圖11為Avastin*和rProAgio-PEG或促血管生成素2(Angio2)的腫瘤生長曲線。14天療程結束時將各治療組的腫瘤提取出來並稱重，圖12圖示了腫瘤的重量。用促血管生成素2 (Angio2)和Avastin:''治療的動物組別的腫瘤重量和生長有顯著差異。 前述詳細說明及後附圖的呈現僅以說明及描述為目的。其並不是毫無遺漏，也無意對本發明的實質構成限制。所選擇和描述的實施方案最佳地闡述了本明的原理及其實踐應用。本領域技術人員應該認識到對本說明所公開的發明進行許多改變不會超出本發明的實質和範圍。
權利要求
1.一種減少個體中血管生成的方法，該方法包括將人類或小鼠CD2多肽第一結構域變體以有效劑量給藥於個體，其中給藥提供了個體中血管生成的減少；其中多肽包含由兩個片段、反向平行摺疊、朝內的疏水面和朝外的親水面所形成的摺疊；兩個片段包含在親水性和疏水性之間交替的至少五個胺基酸。
2.根據權利要求1所述方法，其中多肽減少了病症相關的血管生成，所述病症選自腫瘤生長、動脈粥樣硬化、糖尿病性視網膜病、衰老相關的黃斑病以及晶狀體後纖維組織形成。
3.根據權利要求1所述方法，其中所述給藥途徑選自靜脈注射、實體腫瘤內或旁給藥、全身給藥、動脈內給藥、眼內給藥、腹膜內給藥以及局部給藥。
4.根據權利要求1所述方法,多肽選自序列IdNo.1、序列Id No. 2、序列Id No. 3、序列 Id No. 4、序列 Id No. 5、序列 Id No. 6、序列 Id No. 7、序列 Id No. 8、序列 Id No. 9、序列Id No. 10 及序列 Id No. 11。
5.根據權利要求1所述方法,其中抗血管生成藥劑誘導內皮細胞的細胞凋亡。
6.根據權利要求1所述方法，還包括給藥治療有效量或預防有效量的化療劑。
7.根據權利要求1所述方法，還包括第二種藥劑的治療有效量或預防有效量的放射治療。
8.根據權利要求1所述方法，其中抗血管生成藥劑誘導哺乳動物的細胞凋亡。
9.根據權利要求1所述方法,其中抗血管生成藥劑誘導內皮細胞的細胞凋亡。
10.一種抗血管生成多肽，其包含與CD2第一結構域基本相似的胺基酸片段，其中多肽包含由兩個片段、反向平行摺疊、朝內的疏水面和朝外的親水面所形成的摺疊；兩個片段包含在親水性和疏水性之間交替的至少四個胺基酸。
11.根據權利要求10所述多肽，其中多肽包含與選自下列序列的胺基酸基本相似的胺基酸序列Id No.1、序列Id No. 2、序列Id No. 3、序列Id No. 4、序列Id No. 5、序列IdNo. 6、序列 Id No. 7、序列 Id No. 8、序列 Id No. 9、序列 Id No. 10 及序列 Id No. 11。
12.根據權利要求10所述多肽，還包含聚乙二醇(PEG)部分。
13.根據權利要求10所述多肽，還包含聚糖部分。
14.一種包含權利要求10所述分離的肽或其變體的藥物組合物。
15.一種編碼權利要求10所述分離的肽或其變體的核酸。
16.一種製備包含與CD2第一結構域基本相似的胺基酸片段的抗血管生成多肽的方法，包括將編碼權利要求10所述分離的肽或其變體的核酸在酵母中進行表達，表達過程中抗血管生成藥劑被糖基化。
17.—種包含人類或小鼠CD2多肽的第一結構域變體多肽的藥物組合物，其中多肽包含由兩個片段、反向平行摺疊、朝內的疏水面和朝外的親水面所形成的摺疊；兩個片段包含在親水性和疏水性之間交替的至少四個胺基酸。
全文摘要
抗血管生成藥劑或多肽，其包含與CD2第一結構域基本相似的胺基酸片段，其中多肽包含由兩個片段所形成的β-摺疊。也包括使用這種藥劑和多肽的方法。
文檔編號C07K14/705GK103002904SQ201180034591
公開日2013年3月27日 申請日期2011年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者劉志仁, 詹妮·J·楊, 魯蔭 申請人:喬治亞州立大學研究基金會