一種篩選抗血管生成活性物質的方法

2023-12-10 07:31:02

專利名稱：一種篩選抗血管生成活性物質的方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選抗血管生成藥物的方法，特別是一種利用斑馬魚模型篩選抗血管生成藥物的方法，屬於藥物篩選領域。
背景技術：
血管生成是惡性腫瘤發生發展過程中的必要過程，與惡性腫瘤的生長和轉移有十分密切的關係。腫瘤血管對於惡性腫瘤的作用主要表現在兩方面，1、腫瘤血管為腫瘤細胞的生長提供必需的養料和氧；2、腫瘤血管的存在為腫瘤細胞侵入循環系統、進而實現遠處器官轉移提供了前提。1971年Folkman首先提出腫瘤生長和轉移是血管依賴性的，阻斷血管生成是遏制腫瘤生長的有效策略這一著名學說，使人們開始認識到血管對於腫瘤的重要
眉、ο抗血管生成已經成為有效治療腫瘤的策略之一。建立可靠的血管生成模型是血管生成研究方面的基礎。動物模型是現代生物醫學和藥理學研究中的一個極為重要的實驗方法和手段。人們可通過不同手段複製出各種模型，在人為設計的實驗條件下反覆觀察和研究，避免了人體實驗造成的傷害。模型動物不僅在群體數量上容易得到滿足，而且可以在方法學上嚴格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性。斑馬魚模型是一種理想的抗血管生成藥物篩選體內模型。其胚胎早期發育的過程中，血管生成的模式比較簡單，主要出現在頭部和軀幹部體節間，體節間的血管最初由背部的動脈出芽形成於相鄰體節之間。現有的利用斑馬魚檢測樣品抑制血管生成活性的方法主要有兩種。1)鹼性磷酸酶染色方法。Parng等利用此模型篩選活性成分，在96孔板上用待測樣品處理胚胎，通過血管內源性鹼性磷酸酶染色來顯示血管，進而評價待測樣品對血管生成的作用。該方法操作繁瑣，而且不能實時觀測血管生成情況。2)螢光標記血管法。Cross等研究發現螢光標記血管的轉基因斑馬魚(VEGFR2 =GFP) 可用來快速篩選抗血管生成藥物，認為其有潛力成為一種高通量蹄選模型。一些抗血管生成藥物如SU5416、SU6668、TNP470作用於斑馬魚的效果與在哺乳動物中的相近。該方法簡便快捷，但是靶點單一，只有影響VEGFR2(II型血管內皮生長因子受體)表達的樣品才能出現陽性結果，而且影響VEGFR2表達的樣品，不一定影響血管生成。上述實例證實了利用斑馬魚篩選抗血管生成藥物的有效性，但是上述模型存在的不足之處極大地限制了抗血管生成活性物質的篩選。本領域迫切需要開發既操作便捷又能綜合反映樣品抑制血管生成活性的篩選抗血管生成活性物質的方法。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種利用斑馬魚模型中生成有血流的血管數量來篩選抗血管生成藥物的方法，以獲得具有藥物開發價值的新的活性物質。一種篩選抗血管生成藥物的方法，步驟如下(1)將發育20-28小時的輻鰭魚綱動物胚胎放入由對血管生成有抑制作用的待篩選物質配製的溶液中，培養20-28小時後，觀測輻鰭魚綱動物胚胎的循環系統發育情況，在心臟形態正常和心率正常的前提下，統計輻鰭魚綱動物胚胎體節間有血流的血管數量，得實驗組節間血流數；(2)觀測培養20-28小時後的對照組輻鰭魚綱動物胚胎的循環系統發育情況，在心臟形態和心率正常的前提下，統計輻鰭魚綱動物胚胎體節間有血流的血管數量，得對照組節間血流數；(3)將步驟⑴獲得的實驗組節間血流數與步驟(2)獲得的對照組節間血流數按
如下公式計算
血管生成抑制率(0/0)=對照組節間血 =-、實驗f且節間血流數χ100%
對照組節間血流數得到血管生成抑制率，當血管生成抑制率大於30%時，待篩選物質即為對血管生成有抑制作用的抗血管生成活性物質。所述步驟(1)中，輻鰭魚綱動物為斑馬魚。上述斑馬魚為野生型斑馬魚。所述步驟(1)中，對血管生成有抑制作用的待篩選物質為天然活性物質或化學合成物質。上述天然活性物質為來自植物、動物和/或微生物中的由單一組分或者多種組分構成的物質。上述多種組分的數量為2-50種；優選的，上述多種組分的數量為2-25種；更優選的，上述多種組分的數量為2-15種。所述步驟⑵中，對照組輻鰭魚綱動物胚胎為施用了陰性/陽性對照藥物的陰性 /陽性輻鰭魚綱動物胚胎、正常培養的輻鰭魚綱動物胚胎或施用了相應濃度溶劑的輻鰭魚綱動物胚胎。所述步驟(2)和步驟(3)中，心臟形態正常是心房和心室的形狀正常，是指心房與心室的體積比例為 1. 5-2. 5 (如圖 1 所示，Structure and Function of the Developing Zebrafish Heart, The Anatomical Record, 2000, Oct 1,260(2) :148_157.)；心率正常是心房跳動的頻率和心室跳動的頻率為180-210次/分。本發明的有益效果1.本發明通過觀測斑馬魚體節間有血流的血管數量獲得待篩選物質是否對血管生成有抑制作用，為成本低廉、快捷準確的化合物篩選提供了新的方法。2.本發明採用體節間有血流的血管數反映化合物/混合物對血管生成的影響，與傳統的以血管壁的存在或完整性反映化合物/混合物對血管生成的影響相比，從血管功能角度反映血管的存在，更加科學、客觀。3.本發明通過限定觀測時心臟形態和心率參數條件，排除心臟毒性引起的血流滯緩對數據影響的因素，提高了結果的客觀性和準確性。4.本發明中的模型動物斑馬魚，與其他模型動物相比，具有繁殖能力強、養殖成本低、胚胎透明、生長發育快等優點；利用斑馬魚胚胎進行化合物/混合物活性篩選，有利於提高篩選效率和降低實驗成本。


圖1是斑馬魚心臟切片顯微照片；其中A、心房，V、心室。具體實施方法下面結合實施例，對本發明做進一步闡述，但本發明所保護範圍不限於此。實驗材料1.實驗動物實驗所用斑馬魚為AB系普通斑馬魚。餵養時，照明14h/黑暗IOh交替進行，雌雄斑馬魚分開餵養，定時餵以人工顆粒狀餌料和滷蟲無節幼體(Artemia nauplii)。採卵時， 傍晚將健康性成熟的斑馬魚，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸內，次日清晨獲得受精卵。對受精卵進行消毒和清洗後，移入斑馬魚胚胎培養用水中，28°C下控光培養。實驗方法1.試劑配製抑制血管生成的陽性化合物PTK787 (購自Sigma公司)溶解於二甲基亞碸，配成 5mg/ml的儲液低溫保存，實驗前用斑馬魚胚胎培養用水(5mmol/L NaCl,0. 17mmol/L KCl, 0. 4mmol/L CaCl2,0. 16mmol/L MgSO4)稀釋至 0. 0625 μ g/ml、0. 125 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、 0. 5 μ g/ml 和 1 μ g/ml 的 PTK787 溶液。抑制血管生成的陽性化合物靛玉紅購自中國藥品生物製品檢定所，稱取靛玉紅樣品5mg，溶解於100 μ L 二甲基亞碸(DMSO)，配製成質量濃度為50mg/ml的母液，再用胚胎培養用水將母液稀釋成5mg/ml，10mg/ml,20mg/ml,40mg/ml (1%。DMS0)4個質量濃度的靛玉紅溶液。實施例1 :PTK787對斑馬魚血管生成的影響在體視顯微鏡下挑選發育24小時的正常胚胎，移入96孔板的樣孔中，每孔一枚。 樣孔中已預先加入了含不同濃度的ΡΤΚ787溶液，每個濃度10個重複。對照組為胚胎培養用水。隨後加蓋封閉，置於光照培養箱(28°C)內，讓胚胎繼續發育。在胚胎發育48小時後， 於倒置顯微鏡下觀察心臟形態，記錄心跳頻率，再觀測統計體節間有血流的血管數量，獲得實驗組節間血流數和對照組節間血流數。結果見表1，根據如下公式計算血管生成抑制率
權利要求
1.一種篩選抗血管生成藥物的方法，步驟如下(1)將發育20-28小時的輻鰭魚綱動物胚胎放入由對血管生成有抑制作用的待篩選物質配製的溶液中，培養20-28小時後，觀測輻鰭魚綱動物胚胎的循環系統發育情況，在心臟形態正常和心率正常的前提下，統計輻鰭魚綱動物胚胎體節間有血流的血管數量，得實驗組節間血流數；(2)觀測培養20-28小時後的對照組輻鰭魚綱動物胚胎的循環系統發育情況，在心臟形態和心率正常的前提下，統計輻鰭魚綱動物胚胎體節間有血流的血管數量，得對照組節間血流數；(3)將步驟(1)獲得的實驗組節間血流數與步驟(2)獲得的對照組節間血流數按如下公式計算.血管生成抑制率(0/0)=對照組節間血 =-、實驗f且節間血流數xl00%對照組節間血流數得到血管生成抑制率，當血管生成抑制率大於30%時，帶篩選物質即為對血管生成有抑制作用的抗血管生成藥物。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中，輻鰭魚綱動物為斑馬魚。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，上述斑馬魚為野生型斑馬魚。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中，對血管生成有抑制作用的待篩選物質為天然活性物質或化學合成物質。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，上述天然活性物質為來自植物、動物和/或微生物中的由單一組分或者多種組分構成的物質。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，上述多種組分的數量為2-50種。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，上述多種組分的數量為2-25種。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，上述多種組分的數量為2-15種。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，對照組輻鰭魚綱動物胚胎為施用了陰性/陽性對照藥物的陰性/陽性輻鰭魚綱動物胚胎、正常培養的輻鰭魚綱動物胚胎或施用了相應濃度溶劑的輻鰭魚綱動物胚胎。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)和步驟(3)中，心臟形態正常是心房和心室的形狀正常，是指心房與心室的體積比例為1. 5-2. 5 ；心率正常是心房跳動的頻率和心室跳動的頻率為180-210次/分。
全文摘要
本發明涉及一種篩選抗血管生成活性物質的方法，特別是一種利用斑馬魚模型篩選抗血管生成活性物質的方法，屬於藥物篩選領域。本發明通過觀測統計斑馬魚體節間有血流的血管數量獲得待篩選物質是否對血管生成有抑制作用。與傳統的以血管壁的存在或完整性反映化合物/混合物對血管生成的影響相比，從血管功能角度反映血管的存在，更加科學、客觀，提高了結果的準確性。
文檔編號G01N33/50GK102445531SQ20111028441
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月22日 優先權日2011年9月22日
發明者何秋霞, 侯海榮, 劉可春, 彭維兵, 王希敏, 王雪, 袁延強, 陳錫強, 韓利文 申請人:山東省科學院生物研究所